專(zhuān)利名稱(chēng)：同步檢測(cè)雞四種病毒試劑盒的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同步檢測(cè)雞新城疫(ND)、傳染性法氏囊(IBD)、傳染性支氣管炎(IB)和產(chǎn)蛋下降綜合癥(EDS)四種病毒的條形酶標(biāo)斑點(diǎn)試劑盒的制備方法。
ND、IBD、IB和EDS是雞的四種最常見(jiàn)的傳染病，也是造成養(yǎng)禽業(yè)巨大損失的主要原因。因此，對(duì)雞群采取準(zhǔn)確而快速的疫病監(jiān)測(cè)是防止和減少由此而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的重要手段。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)是當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項(xiàng)新技術(shù)，其基本過(guò)程是將抗原(或抗體)，吸附于固相載體，在載體上進(jìn)行免疫酶反應(yīng)，底物顯色后用肉眼或分光光度計(jì)判定結(jié)果。若以硝酸纖維膜為固相載體，待檢樣本點(diǎn)加在膜上，然后在膜上進(jìn)行ELISA，則該法又稱(chēng)酶標(biāo)斑點(diǎn)法(Dot-ELISA)。1994年第三期《中國(guó)畜禽傳染病》(總第76期)刊登的《用Dot-ELISA檢測(cè)傳染性法氏囊病病毒》一文對(duì)此檢測(cè)病毒法曾有報(bào)導(dǎo)。但此法即在一張硝酸纖維膜上吸附一種抗體，配以相應(yīng)的試劑，用于檢測(cè)一種病毒。由于在實(shí)際工作中，所檢測(cè)的病毒很少是單一的，尤其是對(duì)雞群進(jìn)行ND、IBD、IB和EDS四種病毒的同步監(jiān)測(cè)，此種單項(xiàng)檢測(cè)的形式不僅操作起來(lái)比較煩瑣，而且根本無(wú)法通過(guò)一次檢測(cè)同時(shí)確定檢樣中是否含有四種病毒的任一種。由此，長(zhǎng)期以來(lái)給禽病的監(jiān)測(cè)工作帶來(lái)諸多的不便，難以適應(yīng)實(shí)際應(yīng)用的需要。
本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)之不足，提供一種能夠快速、簡(jiǎn)便而又可靠的一次性同步檢測(cè)雞四種病毒條形酶標(biāo)斑點(diǎn)試劑盒的制備方法。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的取經(jīng)過(guò)純化的NDV、IBDV、IBV和EDS的四種抗體分別用PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)謩e滴加在同一條形載體上的四個(gè)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行包被。將包被后的載體自然干燥后，用封閉液將四個(gè)帶狀區(qū)域加以封閉，密封于塑料袋中，置于溫度在4℃的環(huán)境中存放。包被好的載體配以相應(yīng)的試劑四種酶標(biāo)記抗體、底物液、樣品稀釋液、洗滌液和終止液，即可用于對(duì)檢測(cè)樣品進(jìn)行檢測(cè)。
本發(fā)明的特點(diǎn)將NDV、IBDV、IBV和EDS四種抗體包被在同一條形硝酸纖維膜上，配以相應(yīng)試劑，即可對(duì)雞群通過(guò)一次取樣便可同時(shí)檢測(cè)出是否有上述四種病毒的任一種，從而減少了由傳統(tǒng)的一紙一法需多次重復(fù)操作和由此及因多種不同試劑造成的系統(tǒng)誤差，并且具有操作方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、可靠及經(jīng)濟(jì)等顯著的特點(diǎn)，是一項(xiàng)值得推廣的技術(shù)。
實(shí)施例步驟一 以NDV、IBDV、IBV和EDS標(biāo)準(zhǔn)毒株按常規(guī)法分別接種雞體獲得相應(yīng)的四種抗血清，然后將此四種抗血清分別經(jīng)親和層析進(jìn)行提純，并采用Folin酚試劑測(cè)定四種抗體的蛋白含量。
步驟二 分別取NDV、IBDV、IBV和EDS四種純化抗體，采用過(guò)碘酸鈉法，以辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記制成酶標(biāo)記抗體。
步驟三 分別取經(jīng)過(guò)純化的NDV、IBDV、IBV和EDS抗體，用PH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋為1～5μg蛋白質(zhì)/ml的包被液；將四種抗體的包被液分別滴加在同一條形硝酸纖維膜(0.8×4.0cm)的四個(gè)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行包被。每種抗體試劑5μI，在四個(gè)區(qū)域內(nèi)均形成0.2×0.5的帶狀。自然干燥后用封閉液將四個(gè)帶狀區(qū)域加以封閉，然后密封于塑料袋中，置4℃保存。包被好的硝酸纖維膜配以相應(yīng)的試劑四種酶標(biāo)記抗體、底物液、樣品稀釋液、洗滌液、終止液，即可用于對(duì)待檢測(cè)樣品的檢測(cè)。
步驟四 檢測(cè)時(shí)，取一包被硝酸纖維膜，將待檢樣品(病料)剪碎，用樣品稀釋液作1∶5稀釋后，滴加于包被硝酸纖維膜上，每個(gè)帶狀區(qū)域滴加5μl，30分鐘后，用洗滌液沖洗3次。再滴加混合酶標(biāo)記抗體，每個(gè)帶狀區(qū)域50μl，45分鐘后，用洗滌液沖洗3次，最后滴加底物液(鄰苯二胺-OPD)50μl，30分鐘后，加終止液(IN硫酸)各50μl，終止反應(yīng)，取出判讀結(jié)果。若吸附某病毒的帶狀區(qū)域呈現(xiàn)棕褐色則檢驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性，即檢樣中含有某種病毒。
附操作與判讀示意圖
注A、B、C、D分別表示NDV、IBDV、IBV、EDS抗體
權(quán)利要求
1.一種同步檢測(cè)雞NDV、IBDV、IBV和EDS四種病毒的條形酶標(biāo)斑點(diǎn)試劑盒的制備方法，其特征是a)取經(jīng)過(guò)純化的NDV、IBDV、IBV和EDS四種抗體，分別用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋制成包被液；b)將四種抗體的包被液分別滴加在同一條形載體上的四個(gè)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行包被；c)將包被后的載體自然干燥后，用封閉液將四個(gè)帶狀區(qū)域加以封閉，密封于塑料袋中，置于溫度在4℃的環(huán)境下存放。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征是所述包被液為1-5μg蛋白質(zhì)/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒的制備方法，其特征是所述包被液抗體試劑的劑量為每種5μl。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種同步檢測(cè)雞新城疫ND、傳染性法氏囊IBD、傳染性支氣管炎IB和(產(chǎn)蛋下降綜合癥)EDS四種病毒的條形酶標(biāo)斑點(diǎn)試劑盒的制備方法,其方法是取雞NDV、IBDV、IBV和EDS四種抗體,用pH9.6碳酸鹽緩沖液稀釋制成包被液;用此包被液對(duì)硝酸纖維膜進(jìn)行包被,包被好的硝酸纖維膜與其他相應(yīng)試劑配合使用。該試劑盒通過(guò)一次取樣即可同時(shí)檢測(cè)上述四種病毒,并具有操作方法簡(jiǎn)便,快速、靈敏、可靠及經(jīng)濟(jì)等顯著的優(yōu)點(diǎn),是一項(xiàng)值得推廣的技術(shù)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK1197117SQ9810674
公開(kāi)日1998年10月28日 申請(qǐng)日期1998年3月25日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月25日
發(fā)明者余為一, 李郁, 李槿年, 魏建忠 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)