專利名稱：共焦顯微鏡成像系統(tǒng)的制作方法
這是申請日為1998年3月16目的美國專利申請?zhí)?9/042,527的繼續(xù)部分，這里通過參考合并為一個整體。
本發(fā)明涉及一種包括利用線掃描共焦成像系統(tǒng)和相關(guān)數(shù)據(jù)處理程序的各種實施例，通過執(zhí)行對細(xì)胞提取物、細(xì)胞或組織的生物學(xué)活性測定的多種分析，識別用于診斷和治療疾病的藥劑的方法和設(shè)備。
準(zhǔn)確執(zhí)行細(xì)胞水平的分析的方法和設(shè)備是當(dāng)前在藥物發(fā)現(xiàn)和發(fā)展以及生物學(xué)研究方面所需要的。細(xì)胞水平的分析有利于用在評估化合物的生物學(xué)活性和新的生物物品的作用機制。在細(xì)胞水平的分析中，研究物的活性用競爭和補償方法來測定。因為關(guān)于化合物的篩選、信息對于化合物的特定活性很有用。例如，不僅可以評估化合物是否結(jié)合到被分析的靶物質(zhì)，而且可評估它究竟是該靶物質(zhì)的正常活性的興奮劑還是拮抗劑。常見的情況是，該靶物質(zhì)是一個細(xì)胞表面受體。在一些信號通道，具有治療功能的最大電位通道的元素不是受體而是與該受體相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號蛋白。因此，有必要發(fā)展一種分析整個通道，尤其是在細(xì)胞環(huán)境下的活性的方法。
另外，需要快速且價廉的篩選大量的化合物。這種需要已經(jīng)出現(xiàn)在制藥工業(yè)，這里常常需要測試化合物對各種生物化學(xué)靶物質(zhì)，例如受體、酶和核酸的活性。這些化合物從很廣的組中選擇，大約超過一百萬種分立的化合物。這里使用術(shù)語化合物的目的是為了說明包括很廣的，簡單的有機和無機分子、蛋白質(zhì)、肽、核酸和寡核苷酸、碳水化合物、脂類、或任何生物學(xué)研究的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但并不僅限于此。
在化合物篩選領(lǐng)域，細(xì)胞水平的分析涉及的是一堆細(xì)胞。測定的反應(yīng)通常是整個細(xì)胞群的平均水平。例如，一個常見的用于離子通道分析的儀器在美國專利申請?zhí)?,355,215中公開。典型的分析包括測定離子敏感染料的時間依賴的熒光性，這種熒光是作為測定在加入某種化合物后繼發(fā)的研究離子在細(xì)胞內(nèi)濃度的變化的指標(biāo)。準(zhǔn)備加入細(xì)胞群中的染料在測定前被置于多孔板的孔底部。一般來說，細(xì)胞的反應(yīng)無論在幅度上還是時間上都是不同的。這種變異性可能是阻礙或者妨礙了對化合物篩選來說很重要的生物活性的觀察。這種不均一性可能由于實驗的原材料引起，但更重要的是，不均一性是任何細(xì)胞群所固有的。其中，變異性的起源可能是繼發(fā)于細(xì)胞群中生命周期的差異，或者是許多活的靶物質(zhì)分子進化差異的結(jié)果。一種可減緩、補償、甚至利用這種變異的方法，將增強在化合物藥物活性的特征的細(xì)胞水平分析的值。
量化單個細(xì)胞的反應(yīng)防止了在細(xì)胞群反應(yīng)中出現(xiàn)的非均一性問題。假設(shè)一下在細(xì)胞群中很小一部分對刺激起反應(yīng)的情況。測定平均反應(yīng)的裝置將比判斷單個細(xì)胞反應(yīng)的裝置的敏感性低。后一種方法產(chǎn)生了一個反應(yīng)全貌的統(tǒng)計學(xué)特征，允許人們從該活細(xì)胞亞群中去挑選。細(xì)胞群的另外的特征將增強對反應(yīng)全貌的說明。
現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)使用的各種測定裝置試圖滿足這種需求。流式細(xì)胞儀分析被廣泛應(yīng)用，通過一次一個使細(xì)胞穿過聚焦的激光束測定細(xì)胞的特性。但這種方法有幾個缺點。對制藥工業(yè)最重要的是不能很方便地對放置于微量滴定板中的化合物進行分析。另外，處理量很低，典型地每個樣本需要10-100秒時間，每個細(xì)胞的觀察時間少于1ms，不允許動力學(xué)分析，還有，只能確定細(xì)胞平均信號。
另外，很多分析需要判斷熒光信號的相對位置。如美國專利申請?zhí)?,107,422和美國專利申請?zhí)?,547,849公開的被稱作掃描細(xì)胞儀的裝置，被廣泛用于成像單個細(xì)胞。為了獲得可接受的速度，這些裝置在很低的分辨率(5～10μm)下操作。因此，這些裝置在分析需要熒光信號分布的空間信息方面比流式細(xì)胞儀強不了多少。
另一個可選的技術(shù)是快像、全場顯微鏡。這些裝置對于某些樣本具有能在可以與本發(fā)明相媲美的分辨率和速度下獲得圖像的能力，然而，它們不是共焦，因此容易受背景熒光的影響，而且不能用于光截面樣本。另外，不能方便地同步獲得多參數(shù)數(shù)據(jù)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以以足夠快且多用途的方式對單個細(xì)胞或細(xì)胞群執(zhí)行多參數(shù)熒光成像，用于化合物篩選。提供不僅用于獲得并分析單個細(xì)胞的初始反應(yīng)而且還另外測定樣本群的變異性的方法和設(shè)備。另外，用亞細(xì)胞分辨率還可判斷多重?zé)晒獾亩ㄎ?。最后，本發(fā)明可用于以視頻速率快速成像變化的事件。綜合這些能力，能夠使研究進入到備選藥物的作用機制的新領(lǐng)域。
本發(fā)明還可被用在基于熒光的生物化學(xué)分析的發(fā)明上，有些類似于那些被廣泛應(yīng)用于篩選化合物的方法中的表面閃爍分析。(“SSA”)。


圖1(a)-1(f)描述了受體結(jié)合SSA的步驟。在圖1(a)，具有挑選的受體12的可溶性膜10被加入到包含液體30的孔20中。這些膜從表達受體的細(xì)胞中分離出來。在圖(b)中，放射性標(biāo)記的配體14被加入到孔中。已知該配體對于膜受體具有高親和力。最普通的放射性標(biāo)記是3H,35S,125I,33P和32P。在圖1(c)中，硅珠16被加入到孔中。這些硅珠表面包被有對膜有強烈粘著作用的小麥胚凝集素。硅珠具有3-8μm直徑，由摻雜有閃爍劑的塑料材料制成。另外，圖1(b)和1(c)描述的操作的順序可以互換。
放射性標(biāo)記通過發(fā)射高能電子或貝塔粒子衰減，該粒子根據(jù)放射性同位素的不同，傳播約1-100μm才停止。如果該放射性標(biāo)記結(jié)合到附著在硅珠表面的膜上，該貝塔粒子可穿入軌珠引起發(fā)光。如果該放射性標(biāo)記分散在液體中，發(fā)射的貝塔粒子一般將不激發(fā)硅珠發(fā)光。在圖1(d)中，檢測由放射性標(biāo)記衰減引起的硅珠的發(fā)光。在圖1(e)中，待測化合物18被加入孔中。該分析的目的是判斷這種化合物置換放射性標(biāo)記配體的程度。如果放射性標(biāo)記被置換并彌散到液體中，硅珠的發(fā)光將減弱。在圖1(f)中，再次檢測硅珠的發(fā)光。通過測定發(fā)光的減少，可以判斷待測化合物的活性。
圖2(a)-2(f)描述了另一個實施例的受體結(jié)合SSA的步驟。這個實施例除了在圖2(a)-2(f)中描述的實施例使用在由摻雜了閃爍劑的塑料制成的孔底部22上涂布能夠粘著膜的材料來代替硅珠外，基本上與圖1(a)-1(f)描述的相同。結(jié)果，在圖2(a)-2(f)描述的實施例檢測孔底部的發(fā)光而不是硅珠的發(fā)光。
圖3(a)-3(d)描述了一個酶SSA的實施例。在圖3(a)中，摻雜閃爍劑的硅珠40與其上附著的放射性標(biāo)記的肽42被加入到包含液體60的孔50中。在圖3(b)中，待測化合物44被加入孔中。在圖3(c)中，酶46被加入孔中。如果沒有被抑制，酶46將從硅珠40上分離放射性標(biāo)記肽42。結(jié)果，該放射性標(biāo)記將彌散入液體中，放射性標(biāo)記的衰減在硅珠40上將不產(chǎn)生發(fā)光。另一方面，如果該待測化合物44抑制酶46，典型的是通過封閉酶的活性區(qū)域，酶46將不能分離該放射性標(biāo)記，則放射性標(biāo)記的衰減將在硅珠上產(chǎn)生發(fā)光。在圖3(d)中，測定該硅珠的發(fā)光，由此可以確定待測化合物的活性。
圖4(a)-4(d)描述了另一個酶SSA的實施例。在圖4(a)中，放射性標(biāo)記肽42附著在摻雜了閃爍劑的孔底部52上。在圖4(b)中，待測化合物44被加入孔中。在圖4(c)中，酶46被加入孔中。在圖4(d)中，測定孔底部的發(fā)光，由此可以確定待測化合物的活性。
上面的示例描述了SSA的一般原則，即被研究物的活性通過在閃爍劑的放射性衰減長度內(nèi)的放射性標(biāo)記數(shù)目的變化來分析。SSA的吸引力之一是沒有附著在閃爍劑上的放射性標(biāo)記在沖洗步驟中不需要從孔中移除。這就是SSA是相似的分析的原因。
放射性免疫測定(RIA)是受體結(jié)合分析的特異形式，這里受體是一種抗體，配體最常見的是天然或合成肽、蛋白質(zhì)、糖酶或小有機分子。RIA是一種間接的方法，用于測定在任何待測樣本，最常見是諸如血漿、腦脊液、尿、或細(xì)胞提取液等生物樣本中的配體濃度。在標(biāo)準(zhǔn)RIA，抗體對于配體具有特異的親和力，該分析包括抗體、固定濃度的放射性標(biāo)記和未知濃度的未標(biāo)記配體。未標(biāo)記配體的濃度通過它結(jié)合抗體，從而阻擋了標(biāo)記配體的結(jié)合的程度來判斷。RIA最常用于執(zhí)行類似于需要用沖洗步驟將未結(jié)合配體與結(jié)合的配體分離的分析。RIA已經(jīng)被發(fā)展成使用SSA的結(jié)構(gòu)，其中抗體受體被附著在摻雜于硅珠中的閃爍劑上，沖洗步驟被省略。
然而，SSA和RIA也有許多不足。首先，這些分析需要處理放射性材料，這既費錢又費時。第二，這些分析僅僅在較大的孔中才能有效。從硅珠或孔底部發(fā)射的發(fā)光率與貝塔粒子的發(fā)射率成正比。一個典型的3H分析產(chǎn)生少于每3H衰減檢測的光子。為增加分析的速度，必須增加放射性標(biāo)記配體的量，相應(yīng)的膜、硅珠和待測化合物的量也要增加。為了在10-60秒時間執(zhí)行氚SSA，需要使用107個硅珠。這種硅珠的量需要大約150μL的孔。SSA在用于篩選大量化合物所需的μL-體積的孔中無效。
本發(fā)明用熒光標(biāo)記配體代替SSA和RIA中使用的放射性標(biāo)記配體，如下面將要描述。這樣的方法，它引用了類似RIA的形式并保留了SSA的形式。這對于μL-體積的孔特別重要，因為表面張力使得不可能進行沖洗。然而，以相似的形式，熒光可能出現(xiàn)如受體結(jié)合分析描述的一樣的問題。當(dāng)加入待測化合物時，一些熒光標(biāo)記配體被置換出來，彌散游離于孔的容量中，而其它仍附著在膜上。這是用來判斷待測化合物活性的熒光標(biāo)記配體的熒光附著在膜上。但是，如果從整個孔中檢測熒光，游離于孔中的熒光標(biāo)記配體的發(fā)射將會干擾附著在膜上的熒光標(biāo)記配體的發(fā)射。
這里提到的問題在Schroeder等的美國專利申請?zhí)?,355,215中的圖5(a)和5(b)中示出。根據(jù)Schroeder等的方法，樣本被直接用以斜角放置在孔底部的光束134照射，如圖5所示，所以它不能照射整個孔。另外，當(dāng)光束照射區(qū)域114｀，熒光只有從位于孔容積下方接受最小量照射的區(qū)域114a才能檢測到。
然而，Schroeder等的方法仍有很多不足。首先，因為它檢測的僅僅是孔底的一小部分，只有用足夠的準(zhǔn)確度在足夠大的孔上才能執(zhí)行Schroeder等的方法。它不適于成像放置在1536孔板的直徑約1mm的孔中的樣本。第二，它的幾何結(jié)構(gòu)限制了照明角度，排除了使用高數(shù)值孔徑的光學(xué)組件的可能，而這是成像微米尺寸物品，如位于孔底部的單個細(xì)胞以達到足夠的光敏度和分辨率所需要的。
解決這個問題使用的另一個方法是點掃描顯微鏡。例如，Baer等人的美國專利申請?zhí)?,547,849中，闡述了點掃描共焦系統(tǒng)的使用。Baer等人的方法是通過犧牲空間分辨率來增加點掃描共焦技術(shù)固有的成像獲取時間的緩慢速度。例如，人們在一定條件下將樣本上的照明光束直徑擴大10倍，則照明區(qū)域增加100倍，容許人們以100倍的更快速度掃描。但該速度的獲得是以損失分辨率為代價。此外，像公開在｀849專利里的、適合所述的掃描方法的這些檢測裝置，將它們用于本發(fā)明則靈敏度太低。最后，背景反射程度和分辨率一起變低。因此，公開在｀849專利里的裝置與本發(fā)明相比，具有更低的靈敏度、更高的背景和更低的分辨率，而所有這些在現(xiàn)今的應(yīng)用中都很重要。
本發(fā)明包括新穎的線掃描共焦顯微鏡。線掃描共焦顯微鏡是現(xiàn)有技術(shù)所熟知的。兩個具有代表性的實施例是在White等的美國專利申請?zhí)?,452,125和由Brakenhoff和Visscher出版的J.Microscopy 17117-26(1993)圖7所示。兩者都使用了一個掃描鏡去掃描通過樣本的照明。相同的掃描鏡用來去掃描(de-scan)熒光輻射。經(jīng)過一個狹縫進行空間濾光后，熒光集團被再次掃描以利于裸眼觀察。振蕩鏡的使用使得這些顯微鏡能夠快速掃描視野。線照明主要用在需要快速成像的應(yīng)用中。線照明的平行性所固有的潛在速度與點照明相比的增加，只有在成像系統(tǒng)能夠同時沿照明線檢測到從樣本的每個點發(fā)射的光時才能實現(xiàn)。該公開的儀器的一個基本特征是具有在與物面共軛的平面上的多種的、獨立的檢測元件。
根據(jù)本發(fā)明，樣本必須位于成像系統(tǒng)的景深決定精確的“平面性”的“平面”中。在一個優(yōu)選實施例中，成像區(qū)域是1mm2而景深是10μm。因此，如果整個視野都要被同步聚焦，樣本必須是1％的平坦。這對于位于局部區(qū)域(如孔底部的中心區(qū)域)的許多樣本襯底(例如微量滴定板)是正確的。然而，要求樣本襯底在整個表面都平坦是不實際的。因為微量滴定板具有約～100mm范圍，需要10,000分之一的平面性。
本發(fā)明提供的光學(xué)自動聚焦系統(tǒng)能夠維持將要成像的樣本襯底的部分“聚焦”。光學(xué)自動聚焦機構(gòu)具有快速，且能夠在非導(dǎo)體基質(zhì)例如塑料微量滴定板和顯微鏡載玻片上操作的優(yōu)點。再有，這種聚焦機構(gòu)具有可忽略的操作延遲，即，聚焦機構(gòu)的反應(yīng)時間相對短于圖像獲取時間，最好是幾分之一秒。適合于現(xiàn)今應(yīng)用的基于光學(xué)的自動聚焦機構(gòu)是大家都知道的。例如，用于產(chǎn)生適用于伺服控制的定位誤差信號的基于像散透鏡的系統(tǒng)在Applied Optics 23 565-570(1984)中公開，和使用“偏斜光束”的聚焦誤差檢測系統(tǒng)在SPIA200 73-78(1979)公開。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中，樣本襯底是一個微量滴定板。在這種情況下，完成聚焦的較好的方法更依賴于該板的特性。如果該板的底部厚度是均一的，是焦深的一小部分，則維持板底部在與物面有一個恒定偏差的聚焦機構(gòu)就已足夠。但現(xiàn)在普通使用的微量滴定板底部是不夠均一的。因此，聚焦機構(gòu)必須跟蹤樣本駐留的表面，這通常是在微量滴定板的孔中。本發(fā)明的一個特征是使用一個新穎的自動聚焦機構(gòu)，用于快速聚焦不連續(xù)表面，如微量滴定板的孔底部。
因此，需要一種方法和設(shè)備用于準(zhǔn)確、快速并價廉地、以相似的形式篩選大量的化合物。另外，還需要一種方法和設(shè)備能夠以足夠成像單個細(xì)胞和亞細(xì)胞事件的分辨率執(zhí)行多參數(shù)熒光成像。還需要一種能夠以視頻速率附加監(jiān)測統(tǒng)計學(xué)上顯著的細(xì)胞群的成像系統(tǒng)。
本發(fā)明涉及線掃描共焦顯微鏡，以及線掃描共焦成像系統(tǒng)(LCI)進行生物活性分析的用法。
在一個優(yōu)選實施例中，該線掃描共焦成像系統(tǒng)采用用于照明樣本和激發(fā)熒光基團發(fā)出電磁能的多波長激光光源。這些波長包括紫外光譜以及可見光。
本發(fā)明能夠使用自動聚焦性能在微孔板上進行一連串快速分析，這種自動聚焦性能容許該LCI系統(tǒng)能夠迅速地從一個孔移動到另一個孔，而不會丟失共焦顯微鏡分辨薄的光截面這個固有能力的優(yōu)點。
在本發(fā)明的各個實施例中，移動樣本來影響在該樣本上的照明線的掃描。在另外的實施例中，振動反射鏡用于產(chǎn)生迅速移動的照明線，該線影響留存在固定位置的樣本的掃描。舉個例子，圖像能夠以每秒高達50幀的速度獲取。
本發(fā)明最好提供整合的分配，以容許附加的物質(zhì)迅速啟動生物事件的變化，如神經(jīng)或肌肉細(xì)胞的動作電位的傳播。
本發(fā)明最好使用多元件固態(tài)檢測裝置如電荷耦合器件(CCD)。這種裝置最好能夠連續(xù)的讀取。在一個優(yōu)選實施例，本發(fā)明使用了一個矩形CCD，它避免了對全二維檢波器的需要，允許高的讀取速度。另外，在一個多級掃描實施例可達到大的有效視野。
本發(fā)明還在一個優(yōu)選實施例中提供了在采集數(shù)據(jù)的同時進行特定的數(shù)據(jù)分析，從而允許以一個高事項處理吞吐量篩選模式操作的性能。
本發(fā)明提供了利用熒光進行多種生物分析的方法。在一個實施例中，被研究的靶物質(zhì)可以在一個固定的細(xì)胞或活細(xì)胞內(nèi)，或在亞細(xì)胞器內(nèi)或細(xì)胞膜上。這些分析包括對一個或多個參數(shù)的判斷，該判斷需要激發(fā)一個或多個熒光標(biāo)記，其中的熒光標(biāo)記一般來說對入射光的不同波長敏感。此外，這些分析需要以一個或多個波長發(fā)射的光的同步和精確的成像，并從該成像判斷熒光標(biāo)記的標(biāo)本在兩維或三維中的位置和強度以及它們的相關(guān)性。
此外，本發(fā)明提供一種方法來執(zhí)行這樣的分析，該分析需要或者依賴熒光發(fā)射的反應(yīng)而單獨成像，或者是同樣區(qū)域或細(xì)胞的快速重復(fù)成像。在各個實施例中，成像以每秒50幀的速度執(zhí)行。在多波長情況下、以高空間分辨率快速地成像的這種能力允許本發(fā)明執(zhí)行不能夠被提前執(zhí)行的分析，或者以一種高級方式執(zhí)行這些分析。
本發(fā)明涉及用于篩選化合物，以及用于各種牽涉使用熒光基團或熒光探針的多種類型分析的幾種方法。一般來說，這些分析和篩選程序包括待測化合物和試劑的使用，它們中的一些或全部是固有熒光，用熒光標(biāo)記或代謝成為熒光產(chǎn)品。待測化合物和試劑可以各種方式結(jié)合。
在一個實施例中，試劑被加入到包含液體的孔中。這可以是一個單孔或者多孔板上許多孔中的其中一個孔。被研究物質(zhì)的生物學(xué)活性通過由線掃描共焦顯微鏡測定的在位于孔底部或在孔底部的硅珠表面存在或不存在熒光集團來確定。該實施例和SSA形式一樣，即從檢測的標(biāo)本的局域化來判斷活性。在SSA情況下，局域化接近于閃爍劑的中心。在本方法中，定位是一個孔的區(qū)域，最好在底部。在SSA中，鄰近的標(biāo)本的敏感性由貝塔粒子的衰減長度來確定。在本方法中，對于局域化的熒光的敏感性通過共焦顯微鏡的光截面深度來確定。
另外，本發(fā)明可以快速、自動的方式執(zhí)行需要篩選多個樣本的高事項吞吐量分析。這些樣本可以是單獨的微孔，或可以是包含有液體、活細(xì)胞、固定細(xì)胞或細(xì)胞成分的孔。本發(fā)明還提供在分析期間需要保留液體樣本或維持活細(xì)胞活性的環(huán)境對照。
本發(fā)明的其它目的、特征和優(yōu)勢從下面的詳細(xì)描寫中將變得很明顯。
圖1(a)-1(f)示出了第一受體結(jié)合的SSA。
圖2(a)-2(f)示出了第二受體結(jié)合的SSA。
圖3(a)-3(f)示出了第一酶的SSA。
圖4(a)-4(f)示出了第二酶的SSA。
圖5(a)和5(b)是用于成像放置于孔底的樣本的現(xiàn)有技術(shù)的設(shè)備的概略圖。
圖6是根據(jù)本發(fā)明的用于成像樣本的線掃描共焦顯微鏡的第一實施例的概略圖。
圖7是現(xiàn)有技術(shù)顯微鏡的概略圖。
圖8(a)和8(b)分別是本發(fā)明的沒有掃描鏡的彩色實施例的射線路徑的頂視圖和側(cè)視圖。圖8(c)是單束自動聚焦的射線路徑的頂視圖。
圖9(a)和9(b)分別是本發(fā)明的具有掃描鏡的彩色實施例的射線路徑的頂視圖和側(cè)視圖。圖9(c)是單束自動聚焦的射線路徑的頂視圖。
圖10是兩束自動聚焦系統(tǒng)的側(cè)視圖。
圖11(a)-11(c)示出了矩形CCD照相機和讀出寄存器。
圖12(a)和12(b)是本發(fā)明的線掃描共焦顯微鏡使用傳統(tǒng)的暗視野成像形成的射線路徑的截面圖。
圖13(a)和13(b)是本發(fā)明的線掃描共焦顯微鏡使用倒置暗視野成像形成的射線路徑的截面圖。
圖14是本發(fā)明的線掃描共焦顯微鏡使用倒置暗視野成像形成的射線路徑的截面圖，這里的區(qū)域大于被照明的樣本平面的衍射極限區(qū)域。
圖15(a)-15(f)示出了根據(jù)本發(fā)明的受體結(jié)合分析的第一實施例。
圖16(a)-16(f)示出了根據(jù)本發(fā)明的受體結(jié)合分析的第二實施例。
圖17(a)-17(f)示出了根據(jù)本發(fā)明的酶分析的第一實施例。
圖18(a)-18(f)示出了根據(jù)本發(fā)明的酶分析的第二實施例。
圖19(a)-19(p)示出了成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞鈣離子對氨甲酰膽堿的反應(yīng)。示出了分別在預(yù)注射時間，0,1.2,2.4,3.6,4.8,6.0,7.2,8.4,9.6,10.8,12.0,13.2,14.4,15.6秒的反應(yīng)(即，圖19(a)-(o))圖20(a)-20(h)示出了成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞鈣離子對50mM的KCl的反應(yīng)。示出了分別在0,0.6,3.0,5.4,7.8,10.2,12.6和15.0秒的反應(yīng)(即，圖20(a)-(h))圖21(a)-21(c)示出了同種活細(xì)胞受體結(jié)合分析。圖21(a)示出了熒光素標(biāo)記的肽配體染色的細(xì)胞。圖21(b)示出了細(xì)胞質(zhì)用LDS751染色產(chǎn)生的掩膜。圖21(c)是圖21(a)和21(b)的重疊，它顯示了可變的受體活性。
圖22(a)-22(d)示出了同種活細(xì)胞受體結(jié)合分析。圖22(a)是標(biāo)記的和未標(biāo)記的配體競爭性結(jié)合細(xì)胞表面受體的圖示。圖22(b)-22(d)顯示在表中指定位點的免疫熒光反應(yīng)的圖像。
圖23(a)-23(d)示出了有Cy3標(biāo)記配體的同種活細(xì)胞受體結(jié)合分析。
圖24(a)-24(d)示出了具有不同數(shù)目Cy5標(biāo)記的4μm直徑硅珠。圖24(a)顯示了沒有標(biāo)記的硅珠的圖像。圖24(b)-(d)分別顯示了每珠平均17,170或1700Cy5標(biāo)記分子的硅珠的圖像。圖24(d)顯示的圖像比圖24(a)-24(c)的圖像尺寸縮小了10倍。
圖25(a)-25(c)示出了如表中的離子通道分析的數(shù)據(jù)。圖25(a)涉及成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞與附加的氨甲酰膽堿的反應(yīng)。圖25(b)-(c)顯示成神經(jīng)細(xì)胞瘤與附加的50mM KCl的鈣離子的反應(yīng)。
列在這里的所有專利申請、出版物和別的參考材料的整體被引用作為參考。
本發(fā)明用于鑒別疾病治療所用的藥劑。這里提供一種使用一種或多種熒光試劑測定生物反應(yīng)的、可進行多種生物分析的高吞吐量處理事項的方法。這種分析可在化學(xué)混合物或任何被研究的生物制劑分子，包括但不僅僅限于例如那些在組合庫中發(fā)現(xiàn)的藥物試驗品。另外，本發(fā)明提供一種用于從細(xì)胞和組織樣本中診斷病理狀態(tài)的方法。本發(fā)明還提供一種用于使用熒光試劑顯示藥物試驗品對整個細(xì)胞的多種生物反應(yīng)的方法。
本發(fā)明的技術(shù)可以用在分析以足夠快的速度從單個細(xì)胞、細(xì)胞的或亞細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)，從而容許在足夠量的構(gòu)成有統(tǒng)計學(xué)意義的細(xì)胞群樣本中獲得這種數(shù)據(jù)。本發(fā)明可進行多參數(shù)同步測定，以及從單個細(xì)胞使多個信號相關(guān)。因此它可被用在分析多相細(xì)胞反應(yīng)，以及分析限定的小細(xì)胞亞集的反應(yīng)。
另外，本發(fā)明可以成像多重信號通路的同步激活，并使這些多重信號同時相關(guān)或隨時間相關(guān)。當(dāng)一個特定的分析需要單個細(xì)胞的瞬時反應(yīng)或?qū)φ盏膯蝹€細(xì)胞的瞬時反應(yīng)時這種性能顯得很重要。
另外，本發(fā)明可以在存在未結(jié)合的熒光集團或在化合物，包括潛在的藥物試驗品中存在固有熒光時從細(xì)胞的共焦平面成像熒光信號。
這些分析可以使用任何已知的熒光團或熒光標(biāo)記，包括熒光素、若丹明、Texas Red、Amersham Corp.的染料Cy3、Cy5、Cy5.5和Cy7、Hoechst的核染料核Coumarin染料。(見Haugland,R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊,第六版,1996,分子探針,Inc.,Eugene,Oregon.)。
這些分析包括但不僅限于此受體結(jié)合分析、細(xì)胞內(nèi)電位或pH分析、離子濃度分析、酶活性分析、交通分析、動態(tài)成像分析和珍貴細(xì)胞事件分析。
受體結(jié)合和酶活性分析可以是基于硅珠的或基于細(xì)胞的分析。基于硅珠的一些例子在WO98/55866中被描述。然而，那里描述的方法使用的是點掃描共焦技術(shù)，而本發(fā)明使用的線掃描共焦成像系統(tǒng)在數(shù)據(jù)采集率方面具有顯著優(yōu)勢。
光學(xué)結(jié)構(gòu)圖6顯示本發(fā)明的第一實施例。該顯微鏡包括例如在光射距350-750nm內(nèi)的電磁輻射源400或410，柱面透鏡420，第一裂孔膜430，第一中繼透鏡440，分色鏡450，物鏡470，包含二維陣列的樣本孔482的微量滴定板480，管透鏡490，濾鏡500，第二裂孔膜510和檢測器520。這些元件沿光軸OA排列，裂孔膜430、510上的裂隙孔徑432、512與圖6的平面垂直伸展。透鏡440、470和490的焦距和這些透鏡之間的距離與裂孔膜430和透鏡440之間的距離，物鏡470和微量滴定板480以及透鏡490和裂孔膜510之間的距離相等，如此提供一個共焦顯微鏡。在這一實施例中，使用柱面透鏡420聚焦從燈400或激光器410發(fā)出的電磁輻射成一條直線。該線的形狀經(jīng)第一裂孔膜430優(yōu)化。裂孔膜430在光學(xué)系統(tǒng)的圖像平面上被描述，該平面與物面共軛。由裂孔膜430上的孔徑432形成的照明條帶通過透鏡440、分色鏡450和物鏡470中繼到包含二維陣列樣本孔482的微量滴定板480。為方便說明，圖6的光學(xué)元件以截面形式，孔板以可透視形式來描述。照明光線在孔板480上的投影由線484形成，可以理解它同樣垂直于圖6的平面。如箭頭A和B所指，孔板480可以在平行于陣列(未顯示)的方向在二維(X,Y)方向移動。
在另一個實施例，裂孔膜430位于光學(xué)系統(tǒng)的傅里葉(Fourier)平面，即與物鏡的后焦平面(BFP)460共軛的平面。在這種情況下，孔徑432位于圖中的平面上，透鏡440轉(zhuǎn)播由孔徑432形成的照明條帶在物鏡470的后焦平面460上，它轉(zhuǎn)換光線成為垂直于圖6的平面的物面上的線484。
在另一個實施例中，該裂孔膜430被完全移動。根據(jù)該實施例，照明光源是激光器410，從激光器發(fā)出的光線被聚焦到物鏡470的后焦平面460。這可以通過如圖6所示的柱面透鏡420和球面透鏡440的組合，或可以用柱面透鏡直接聚焦光線到平面460來完成。
通過投影照明光線到樣本平面，反射那里的熒光發(fā)射到檢測器520，在垂直于光線的方向移動板480，可以與檢測器520的讀取同步獲得樣本區(qū)域，例如在樣本孔482內(nèi)的樣本的圖像。在圖6描述的實施例中，熒光發(fā)射被物鏡470收集，經(jīng)雙色分光鏡450投射，穿過濾鏡500和第二裂孔膜510由物鏡490反射到檢測器520上，這樣適合于具有無窮遠(yuǎn)校正物鏡470的共焦成像系統(tǒng)。雙色分光鏡450和濾鏡500優(yōu)先阻擋在照明波長內(nèi)的光線。檢測器520實際上是一個照相機，可以是一維或兩維的。如果使用的是一維檢測器，則不需要裂孔膜510。在指定區(qū)域被成像前，照明、檢波和轉(zhuǎn)換連續(xù)進行。如果樣本以連續(xù)的速率轉(zhuǎn)換則機械運動可以簡化。如果照相機讀取時間小于曝光時間，則連續(xù)運動是最有用的。在一個優(yōu)選實施例中，照相機被連續(xù)讀取。在合并的曝光時間和讀取時間內(nèi)，樣本的位移d可以大于或小于照明線寬度W，例如0.5W≤d≤5W。多孔板上所有的孔都可以同樣的方式成像。
另外，顯微鏡可以被構(gòu)造成聚焦照明光線穿過許多相鄰的、主要由光學(xué)系統(tǒng)的視野所限制的孔，結(jié)果，可以同時使用一個以上的顯微鏡。
照明條帶484的大小和形狀由物鏡后焦平面460的富里葉變換條帶的寬度和長度確定。例如，線484的長度由460上線的寬度確定，相反，484的寬度由460的長度確定。對于衍射極限性能，挑選在460處的照明條帶的長度以充滿物鏡后部孔徑。本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員很容易理解，照明條帶484的大小和形狀可以被柱面透鏡420的焦距和420處束斑大小的組合控制，即由每個尺寸上的有效數(shù)值孔徑、物鏡的像差和物鏡視野的限制所控制。
選擇照明線484的尺寸以優(yōu)化信噪比。結(jié)果，它們是樣本依賴的。根據(jù)該分析，分辨率在衍射極限之間變動，即，少于0.5μm，大約為5μm。束斑的長度最好由物鏡的視野確定，例如在0.5和1.5mm之間。例如，尼康ELWD,0.6NA,40X物鏡有大約0.75mm的視野。這種物鏡的633nm輻射的衍射極限分辨率大約是0.6或大約為1100分辨單元。
有效深度分辨率主要由裂孔膜510上的孔徑寬度512或一維檢測器寬度和由物鏡470及透鏡490聯(lián)合產(chǎn)生的圖像放大倍數(shù)確定。共焦顯微鏡的最高深度分辨率接近1μm。在本申請中，5-10μm高的深度分辨率已經(jīng)足夠或者說非常好了。
例如，當(dāng)被研究的樣本，如活細(xì)胞，在衍射極限體積中包含的熒光基團不足以允許在足夠短的圖像獲得時間內(nèi)得到滿意的信噪比圖像，照射和收集從比衍射極限體積大的體積中的發(fā)射是有利的。在以視頻速率動態(tài)研究瞬態(tài)事件，例如離子通道開放的一個類似的情況下更適合用這種方法。實際上，這可以通過充滿物鏡的后部孔徑，等同于增加照明孔徑的直徑的方法來完成。照明的有效數(shù)值孔徑(“NA)小于物鏡的NA。然而，熒光發(fā)射以物鏡的全NA被收集。孔徑512的寬度必須增加，以檢測較大的照明體積的發(fā)射。在孔徑寬度大于衍射極限幾倍時，幾何光學(xué)給檢測體積單元的尺寸提供一個足夠的近似值。
橫向深度ad=dd/M]]>軸向深度zd=2ad/tanα]]>這里，M是放大倍數(shù)，dd是孔徑512的寬度，α是物鏡470所對著的半角。本發(fā)明的重要部分之一就是實施例中照明孔徑432或它的等價物在沒有孔徑及檢測孔徑512時可被單獨控制。多波長結(jié)構(gòu)啟用多波長熒光成像的實施例對某些分析類型是較合適的。由于在生物反應(yīng)領(lǐng)域時間是一個重要因素，所以兩種或者多種測量方法同時進行，一般來說是有利的，而且也是必要的。
獨立波長或色彩的數(shù)量與執(zhí)行的具體分析有關(guān)。在一個實施例中，使用了三個照明波長。圖8(a)和8(b)分別從頂視圖和側(cè)示圖，圖示了三色(three-color)線掃描共焦成像系統(tǒng)中的射線路徑?？傊?，該系統(tǒng)包括幾個電磁輻射源Sn、校準(zhǔn)透鏡Ln和鏡子Mn，該鏡子用于產(chǎn)生由柱面透鏡CL聚焦成為第一空間濾波器SF1上的細(xì)長束斑的校準(zhǔn)束斑，位于第一空間濾波器SF1和第二空間濾波器SF2和成像透鏡IL、射束分離器DM1和DM2以及檢測器D之間的共焦顯微鏡，用于從樣本中分離和檢出熒光輻射的不同波長成分?？臻g濾波器SF、SF1和SF2最好是裂孔膜。
特別是，圖8(a)描述了關(guān)于顏色λ1、λ2和λ3的光源S1、S2和S3，以及校準(zhǔn)來自各自光源的光線的透鏡L1、L2和L3。透鏡L1、L2和L3最好調(diào)整成能夠補償該系統(tǒng)中的別的透鏡的任何染色。鏡子M1、M2和M3用于組合來自光源Sn的照明色彩。鏡子M2和M1部分透射、部分反射并且最好是雙色的。
在共焦模式下操作顯微鏡需要把來自光源Sn的經(jīng)組合的激發(fā)光源聚焦成在物面OP上的“線”，或者高偏心橢圓。象以上結(jié)合圖6所作的討論那樣，可以使用多種的配置實現(xiàn)這種功能。在圖8所描述的實施例中，經(jīng)組合的照明光源由柱形透鏡CL聚焦到被拉長的橢圓，該橢圓與空間濾波器SF1中的縫隙一致。象圖8a和8b中所畫的那樣，裂孔膜SF1放在該系統(tǒng)的圖像平面內(nèi)，擺放成垂直于照明光線的傳播方向，并且其長軸處于圖8a的頁面內(nèi)。透鏡CL和OL中繼從包含SF1到物面OP的照明光線。旋轉(zhuǎn)鏡TM的作用是方便使用。在另一個實施例中，DM3位于TL和OL之間，CL把照明光線直接聚焦到BFP。對于本領(lǐng)域的熟練技術(shù)人員來說，別的實施例是顯然的。
參考圖8(b)，由樣本發(fā)出和由物鏡OL聚集的光線被管狀透鏡TL成像到空間濾波器SF2上。SF2最好是被擺放成垂直于頁平面延伸的縫。因此，通過濾光器SF2的光基本上是一條照明線。SF2可以被放置在初始成像平面或任何那里的共軛平面。DM3是部分反射，部分透射，最好是彩色?？傻玫阶詈媚軌蚍瓷湟欢úǘ蝺?nèi)的波長而透射其余波長的多波長“雙色”鏡，或“彩色”鏡。
δλ1定義為由λ1激發(fā)的熒光輻射。一般來說，這是比λ1稍長的波長分布。δλ2和δλ3的定義相似。DM3優(yōu)先反射λn，優(yōu)先透射δλn,n=1,2,3。由SF2透射的光被成像在檢測裝置上，該檢測裝置位于與初始成像平面共軛的平面上。在圖8(a)中，空間濾波器SF2的圖像是由透鏡IL產(chǎn)生于所有三個檢測器，Dn上。這個實施例是在需要幾乎完全的記錄在由各自檢測器產(chǎn)生圖像之間的應(yīng)用中優(yōu)選出來的。在另一個實施例中，各個透鏡ILn與檢測裝置相連，一對透鏡IL和ILn用作中繼空間濾光器SF2的圖像到各個檢測器Dn。光線在檢測器中被鏡DM1和DM2分離。鏡是部分透射、部分反射、最好是雙色。DM2優(yōu)先反射δλ2并且優(yōu)先透射δλ3。阻擋濾光片BF2和BF3分別優(yōu)先透射δλ2和δλ3，有效阻擋所有出現(xiàn)的其它波長。
掃描鏡結(jié)構(gòu)在本發(fā)明的一些實施例中，高速數(shù)據(jù)采集需要在視頻速率取景圖像。視頻速率成像一般每秒30到60幀。在目前的應(yīng)用中，意圖暗示具有30Hz數(shù)量級的幀速。在一個優(yōu)選實施例中，通過沿樣本平面的一維照明，以及通過掃描在垂直于它的方向上的照明束斑，以使得引起照明和樣本的相對位移，來實現(xiàn)視頻速率成像。該掃描級一般來說量很大。因此，它不能迅速充分地移動。
圖9描述了使用掃描鏡SM的本發(fā)明的一個實施例。該鏡子較適合放在與物鏡后焦平面(objective back focal plane,BFP)共軛的一個平面上在該BFP(或與其共軛的平面)里的旋轉(zhuǎn)引起該物面(OP)和它的共軛平面里的位移。對于透鏡RL1和RL2的聚焦長度的典型值來說，SM的整個掃描范圍僅僅需要幾度。如圖9所示，這一對透鏡把BFP以放大率為1成像到SM上，但可以很方便地使用各種放大率。圖象獲得速度的限制因素是照相機的讀取速度和信號強度。在以上所描述的成像模式中，數(shù)據(jù)能夠以照相機的讀取速度，例如1MHz，連續(xù)地獲得。最好用掃描鏡單向地獲得數(shù)據(jù)。允許人們連續(xù)地獲得數(shù)據(jù)的理想掃描移動是鋸齒移動。在實踐中，折返和返回的掃描時間的組合將構(gòu)成～1/3-2/3個掃描周期。假設(shè)空載時間為50％，則50Hz的鏡子振動頻率和1MHz～10,000像素的像素獲得率，將以每秒50幀獲得每一幀，這足夠用來一幀一幀地分辨和跟蹤諸如細(xì)胞之類的單獨物品。但每個圖像104個像素，比以上考慮的一般情況少102倍。根據(jù)該應(yīng)用，其優(yōu)勢是在高分辨率下獲得相對小的圖像，而在較低的分辨率下獲得相對較大的圖像，例如在像素為0.5μm×0.5μm時圖像為50μm×50μm，而在像素為2μm時圖像為200μm×200μm。
自動聚焦根據(jù)本發(fā)明，樣本必須位于成像系統(tǒng)的物面內(nèi)。因此，本發(fā)明提供一種自動聚焦機構(gòu)，它把該成像系統(tǒng)的視野中的樣本部分維持在那個系統(tǒng)的物面之內(nèi)。平面化的精確度由該系統(tǒng)的景深確定。在一個優(yōu)選實施例中，景深約等于10μm，而視野約等于1mm2。
公開的自動聚焦系統(tǒng)以可以忽略的延遲運行，即其響應(yīng)時間相對于該圖像的獲得時間來說較短，比如0.01-0.1s。此外，該自動聚焦光源獨立于照明光源和樣本特性。尤其是該配置允許該樣本容器的位置順著成像系統(tǒng)將被獨立于物面的位置確定的光軸放置。
圖8和9提供了單束自動聚焦的一個實施例，其中示出了波長為λ4的單獨光源S4和檢測器D4。波長為λ4需要區(qū)別于樣本熒光，特別是一個不能激發(fā)樣本中的明顯的熒光的波長。因此，λ4最好為近紅外光，例如為800-1000nm。部分透射、部分反射鏡DM4最好是二色性的，反射λ4和透射δλn,n=1,2,3。適用于本發(fā)明的基于光學(xué)的自動聚焦機構(gòu)是公知的。例如用于產(chǎn)生適合于伺服控制的位置誤差信號的、基于散光透鏡的系統(tǒng)公開在Applied Optics 23 565-570(1984)。使用“非對稱束”的聚焦誤差檢測系統(tǒng)公開在SPIE 200 73-78(1979)。后者的方法容易根據(jù)圖8和9實現(xiàn)，其中的D4為分開的檢測器。
為了使用具有在孔底放有樣本的微量滴定板，伺服回路必須中斷，以便在孔之間移動。這會引起相當(dāng)大的時間延遲，原因是每一次照明被移動到另一個孔時都需要重新聚焦。
在本發(fā)明的圖10所示的優(yōu)選實施例中，提供了樣本平面和物面的相對位置的連續(xù)閉環(huán)控制。該系統(tǒng)使用兩個獨立的電磁輻射束。來自S5的那一個聚焦在連續(xù)平面，例如微量滴定板的底上。來自S4的那一個聚焦在非連續(xù)平面，例如微量滴定板的孔底上。在一個實施例中，來自S4和S5的束斑分別具有波長λ4和λ5。λ4由L4校準(zhǔn)，由光圈I4形成孔，由物鏡OL聚焦到不連續(xù)的表面。λ5由L5校準(zhǔn)，由光圈I5形成孔，由物鏡CFL和物鏡OL共同聚焦到連續(xù)的表面。反射的光分別由透鏡IL4和IL5聚焦到檢測器D4和D5。部分透射，部分反射鏡DM4最好二色性的反射λ4和λ5，透射λn和δλn,n=1,2,3。鏡M4,M5和M6是部分透射，部分反射。在λ4和λ5不同時，M6最好是二色性的。
根據(jù)該實施例，其中樣本留存于微量滴定板中，λ4被聚焦到孔的底部。物面可以在可變距離內(nèi)偏移孔底部。這可以通過調(diào)整L4或通過伺服控制回路內(nèi)的偏移調(diào)整來完成。為描述方便起見，可以假定λ4聚焦到物面。
自動聚焦系統(tǒng)的操作描述如下。如果樣本孔的底部不在物鏡OL的焦平面，檢測器D4產(chǎn)生一個通過開關(guān)SW提供給Z控制的誤差信號。Z控制用于移動微量滴定板朝向或離開物鏡的馬達(未顯示)。另外，Z控制可以移動物鏡。如果微量滴定板的底部PB不在透鏡CFL和物鏡OL組合的焦平面，檢測器D5產(chǎn)生一個通過開關(guān)SW提供給Z控制的誤差信號。一個XY控制控制用于移動微量滴定板到物鏡OL的物面OP的馬達(未顯示)。
如指示的，整個掃描在計算機控制下進行。下面舉一個掃描的例子在一個特定的孔的成像完成后，計算機運行SW以將伺服機構(gòu)的控制從由D4產(chǎn)生的誤差信號切換到D5產(chǎn)生的誤差信號。然后計算機指令XY控制去移動板到下一個孔，之后伺服又切換回D4。
利用板底部的信號的“粗”聚焦機構(gòu)被用來維持樣本平面的位置在板底部的厚度中的孔到孔距離內(nèi)，從而需要“細(xì)”聚焦機構(gòu)搜索的范圍被減小。例如，光圈I5的直徑是2mm,IL5是100mm，則在檢測器上的圖像尺寸將是～100μm。同樣，如果光圈I4直徑是0.5mm,IL4是100mm，則在檢測器上的圖像尺寸將是～400m。后者被選成低靈敏度以使得它起“粗”聚焦作用。
象以上描述的含單-束斑的實施例那樣，波長λ4和λ5需要區(qū)別于樣本熒光，特別是不能激發(fā)樣本中的明顯熒光的波長。因此，λ4和λ5最好接近紅外線，例如為800-1000nm。此外，這兩個波長最好是有區(qū)別的，例如λ4=830nm、λ5=980nm。
在二-束斑自動聚焦的另一實施例中，λ4=λ5并且這二束斑可以來自同一源。最好這二束斑被偏振成相互垂直，和M6是偏振分束器(beamsplitter)。
在按以下方式操作的單束自動聚焦的優(yōu)選實施例中，提供偽閉環(huán)路控制。在所述板移動到SW在其后被切換回D4的下一個孔的同時，計算機在一次掃描的末尾操作SW把控制切換樣本固定裝置，該裝置維持Z控制輸出在一個恒定水平，此時板被移動到下一個孔，之后SW被切換回D4。
檢測裝置這里公開的設(shè)備的基本特征是在與物面共軛的平面內(nèi)，使用了具有多種獨立的檢測元件的檢測裝置。如以上所述，線照明的優(yōu)勢主要在于需要迅速成像的應(yīng)用中。與點照明情況相比較，潛在的速度增加是線照明的平行性固有特點，然而只有該成像系統(tǒng)有能力同時檢測沿照明線發(fā)射自樣本的每一點的光線，才能實現(xiàn)。
在以上描述的現(xiàn)有技術(shù)的成像系統(tǒng)(White等,US5,452,125和Brakenhoff and Visscher,J.Microscopy 171 17-26(1993))的輸出處安裝一個電荷耦合裝置(CCD)或別的照相機也是可以的。但這樣構(gòu)成的設(shè)備與本發(fā)明相比有三個顯著的缺點。一個是需要把圖像重新掃描到二維檢測器上，這增加了對設(shè)備來說是不必要的復(fù)雜度。另一個是需要有超過一般體系結(jié)構(gòu)照相機的1000像素×1000像素的足夠高質(zhì)量的全二維檢測器。第三個缺點是需要額外的時間從二維裝置中讀取整個圖像。
本發(fā)明被設(shè)計用來避免這些缺點，并且不但在高靈敏度和低噪聲檢測的限制條件下優(yōu)化成像速度，而且優(yōu)化吞吐量。一個實施例使用連續(xù)讀取的線照相機，而在一個優(yōu)選實施例中把一個矩形CCD用作線照相機。這兩個實施例在一個圖像內(nèi)的線之間、或者圖像之間都沒有空載時間。本發(fā)明的一個附帶優(yōu)點是在階段掃描實施例中可獲得更大的有效視野，這將在以下討論。
該檢測裝置的必要特性通過考慮下列優(yōu)選實施例，能夠進一步得到闡述。物鏡的分辨率極限是＜1μm，一般為～0.5μm，檢測器包括由～1000個獨立元件組成的陣列。分辨率、視野(FOV)和圖像獲取速度都不是獨立變量，需要在這些性能參數(shù)中協(xié)調(diào)?？偟膩碚f，該光學(xué)系統(tǒng)的放大率設(shè)置成在不犧牲分辨率的情況下，使得圖像盡可能和FOV一樣大。例如，～1mm的視野能夠以1μm的像素點成像在1000個元件陣列上。如果檢測元件是20μm平方，則系統(tǒng)的放大率將設(shè)置成20X。注意這不會產(chǎn)生1μm分辨率。像素點不等于分辨率。例如，如果物鏡的固有分辨率極限為0.5μm，并且物面中的每一個0.5μm×0.5μm區(qū)域映射到一個像素，則產(chǎn)生的數(shù)字圖像的真實分辨率不是0.5μm。為了獲得真實0.5μm分辨率，該像素點必須與物面中的一個0.2μm×0.2μm區(qū)域相對應(yīng)。在一個實施例中，成像系統(tǒng)的放大率設(shè)置成能獲得真實的光學(xué)分辨率。
目前，具有適合于本申請的足夠讀取速度的最高檢測效率、最低噪聲的檢測裝置是CCD照相機。在圖11中示出了一個具有mxn個檢測器元件陣列的矩形CCD照相機，其中m嚴(yán)格小于n。熒光發(fā)出的圖像覆蓋了最好地接近到讀取寄存器的一行。這使得傳輸時間最小，并且避免了把被照明的行和讀取寄存器之間的行中的假數(shù)累加到信號中。
理論上，人們能夠把光學(xué)系統(tǒng)的放大率設(shè)置成使得CCD照相機上的縫隙SF2的圖像的高度為一個像素，如圖11所示。但在實踐中，難于在照明線和照相機的行軸之間保持完全對準(zhǔn)，更難于如在圖8和9示范的多波長實施例中的三個照相機和照明之間保持完全對準(zhǔn)。通過在照相機的每一行中把多個檢測器元件，例如二到五個，纏繞在一起，在讀取噪聲或讀取時間受到最小損失的同時，對準(zhǔn)條件可以放寬。
具有一個或多個矩形CCD照相機作為檢測裝置聯(lián)合可變寬度檢測的空間濾波器，如圖8和9中的SF2以及圖6中的510，每個都安裝在與物面共軛的平面，該優(yōu)選實施例的另一個優(yōu)勢將在下面闡述。如上面所討論的，在本發(fā)明的一個實施例中，檢測空間濾波器被省去，線照相機(line camera)被用作檢測空間濾波器和檢測裝置的組合。但是如上面討論的，可變寬度檢測空間濾波器允許優(yōu)化檢測體積從而優(yōu)化樣本依賴的信噪比。下面的優(yōu)選實施例保留了線照相機的優(yōu)點，即速度和可變檢測體積的彈性。設(shè)定放大倍數(shù)從而在照相機的一行上成像一個衍射極限的高度h的線。檢測空間濾波器的寬度最好在h≤d≤10h之間可變。在照相機的照射柱上的檢測器是雙向的(binned)，在讀之前，與曝光和讀出時間相比，它需要一個可忽略時間的操作。
在一個優(yōu)選實施例中，照相機是Princeton InstrumentsNTE/CCD-1340/100-EMD。在一個優(yōu)選實施例中在少量讀噪聲電子的情況下讀出率是1MHz。圖象格式是1340×100，照相機可以連接電線以將大部分行(80％)從研究區(qū)域移開，使照相機在1340×20處更有效。
除了上面提到的連續(xù)讀照相機的優(yōu)點外，即在連續(xù)獲得之間無空載時間，另一個優(yōu)點是它允許獲得其長度僅僅由樣本的范圍限制的矩形圖像。該長度由更小的照相機寬度和照明線的范圍確定。在一個優(yōu)選實施例中，樣本被放置在96孔微量滴定板的孔底部，直徑是7mm。被照射的帶是1μm×1mm，從照射區(qū)域發(fā)出的輻射被成像到檢測裝置上。光學(xué)系列被設(shè)計成視野是1mm2。根據(jù)本發(fā)明，孔底部的圖像可在1×7mm視野的1μm像素上產(chǎn)生。環(huán)境控制在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施例中對活細(xì)胞進行檢測?；罴?xì)胞檢測常常需要接近生理狀態(tài)以使它正常存活。重要的參數(shù)之一是溫度。理想的是加入一個裝置能夠升高和降低溫度，特別是，維持樣本的溫度在37℃。在另一個實施例中，還需要控制相對濕度，和/或CO2和O2以維持活細(xì)胞的生存力。另外，控制濕度以減少蒸發(fā)對于小體積樣本來說很重要。
下面描述配置有可升高溫度，最好是37℃，與LCI系統(tǒng)兼容的微量滴定板的三個實施例。
成像系統(tǒng)最好安置在避光的罩內(nèi)。在第一個實施例中，通過維持整個密封罩內(nèi)的溫度來維持樣本板到所需溫度。然而，在37℃，除非升高的濕度被有意維持，蒸發(fā)冷卻將減少樣本體積從而限制檢測時間。
第二實施例在微孔板上配備了加熱罩，它允許微孔板在靜止的罩下移動。罩在孔上方有單獨一個開孔對準(zhǔn)顯微鏡的光軸。這個開孔允許發(fā)散進入活動孔中，同時維持加熱并限制板中留存物的循環(huán)。在加熱的罩盤和微孔板之間約0.5mm的空間允許自由移動微孔板及減少蒸發(fā)。因為被觀察孔的內(nèi)容物通過發(fā)散孔被暴露于環(huán)境狀態(tài)最多不過幾秒鐘，所說的內(nèi)容物在檢測期間不會遭受明顯的溫度變化。
在第三個實施例中，一個很薄的、加熱的藍寶石窗被用作盤底部的殼。一個電阻發(fā)熱絲貼在孔的隔板上，維持窗的溫度到所需的標(biāo)準(zhǔn)。
在另一實施例，三種公開的方法可以不同地組合。
綜合分配器在一個實施例中成像系統(tǒng)的視頻速率結(jié)構(gòu)進一步配置成用定時試劑發(fā)送進行促發(fā)動力學(xué)分析，特別是離子通道分析，通道開放的啟動通過發(fā)送溶液進入微孔來完成。例如，電壓門控通道可通過加入KCl溶液使胞膜去極化來打開。通道開放和隨后關(guān)閉的時間的依賴性和細(xì)胞內(nèi)濃度的相應(yīng)變化常要求以足夠快的視頻速率成像。然而成像系統(tǒng)的固有速度是不相關(guān)的，除非通道反應(yīng)可以被迅速地促發(fā)。
本發(fā)明的一個實施例提供了一種綜合分配器。對于在96或384孔板上分析的運行，需要范圍20-100μL的附加體積。例如單頭分配器，是IVEK分配器2000，因為比較適合離子通道活性促效藥的添加?？杀葐卧蓮腃AVRO取用。一般地說，能夠分配一種特定的化合物給每個孔就比較理想。一個實施例提供單頭分配器在機器人運動裝置上，該裝置在分析站點、包含特定化合物的源板和頂端清潔站點之間往復(fù)移動分配器頭。后者是對于固定的頂端分配器的清潔站和對于一次性頂端分配器的清潔站。這個系統(tǒng)相對便宜地提供了所要的功能，但它效率低，每一種化合物的吸入-配制-清潔周期需要約30秒。替換用的實施例是通過提供諸如Hamilton Microlab MPH-96這樣的多頭分配器集成到公開的LCI系統(tǒng)來。MPH-96由96個安裝在能夠執(zhí)行上述的吸入-配制-洗滌周期的機器人運動裝置上的、獨立的固定的頂端分配器組成。
在本發(fā)明的另外一個優(yōu)選實施例中，被用在自動篩選分析中的成像系統(tǒng)集成有諸如Zymark Twister那樣的操縱板機器人(plate-handling robots)。
暗視野共焦結(jié)構(gòu)在橫向分辨率小于衍射極限的情況下，由懸浮液引起的背景熒光通過本申請的暗視野成像技術(shù)能夠降低。圖12(a)和12(b)示出了傳統(tǒng)暗視野中的射線路徑。在圖12(a)，樣本600由來自物鏡620的光線610的空心錐照明。例如，這個光線的空心錐通過在圖10(a)中的透鏡440處放一根不透明的桿630來產(chǎn)生。在圖12(b)中，從樣本600散發(fā)出來的熒光穿過物鏡620的中心后，被收集起來。由于照明和收集的角度不同，所以只有既被照明又被檢測的平面才是包含樣本600的平面。
圖13(a)和13(b)示出了倒置的暗視野中的射線路徑。在圖13(a)，樣本700用穿過物鏡720中心的光線710的光束照明。在圖13(b)中，僅僅從物鏡720外邊周圍散發(fā)出來的熒光被收集到起來。從物鏡720外邊周圍收集可以通過在圖10(a)中透鏡490處，例如放一根不透明的桿730來實現(xiàn)。象傳統(tǒng)暗視野中一樣，倒置的暗視野包括在一個角度的照射和在另一個不同的角度收集，從而僅僅樣本平面既被照射也能被檢測到。
圖14描述在上述情況下的焦平面，其中照明一個比樣本平面的衍射極限區(qū)域更大的區(qū)域是有好處的。照明和收集的射線與圖3的倒置暗視野幾何形狀中那些相同。如果在與具有匹配于照明光束的寬度的透鏡后焦平面共軛的平面上放一個光闌，則可得到該暗視野體系結(jié)構(gòu)。從圖14可以了解到，這種體系結(jié)構(gòu)降低了不共面的熒光撞擊檢測器。來自上面的陰影區(qū)和下面的物面的熒光不穿過光闌。在點掃描共焦情況下，來自這些平面外區(qū)域的熒光被檢測孔徑有效地反射。在線掃描共焦情況下，來自沿該線的一側(cè)位置的不共面熒光被提供給沿該線的另一點的背景信號這是在相對于點掃描共焦的線掃描中信號-背景方面退化的起因。線掃描共焦的倒置暗視野體系結(jié)構(gòu)恢復(fù)了點掃描共焦的背景反射屬性的重要部分，同時保持了線掃描體系結(jié)構(gòu)的速度優(yōu)勢。
實時數(shù)據(jù)分析本發(fā)明可以連續(xù)產(chǎn)生每秒兆字節(jié)數(shù)據(jù)。在一個實施例中，系統(tǒng)集成有快速高強度，大容量存儲裝置，實時數(shù)據(jù)可以被假脫機以在之后分析。在一個優(yōu)選實施例，數(shù)據(jù)分析的運行基本上與數(shù)據(jù)采集同步進行。因此，數(shù)據(jù)在存儲之前被處理。一般來說，只有分析的結(jié)果被存檔，但它的優(yōu)點是還同時存儲了選擇的原始數(shù)據(jù)。
實時分析程序的示例結(jié)合每一分析組被提供如下。在所有情況下，程序被用來優(yōu)化操作研究物的硬件平臺的軟件密碼。在當(dāng)前的優(yōu)選實施例中，計算機是32位處理器，如PentiumⅡ。在這種情況下，所有數(shù)據(jù)以32位數(shù)據(jù)包被存取。
一般情況下，數(shù)據(jù)的采集和分析包括許多不連續(xù)的步驟。首先，熒光被轉(zhuǎn)換成一個或多個數(shù)字圖像，其數(shù)值與入射到檢測裝置的每個像素上的熒光輻射強度成正比。在這一步，因為穿過視野的成像系統(tǒng)的非均勻響應(yīng)而進行了一個校正，其中被剔除數(shù)據(jù)的背景被稱作平面場的文件分割。第二，一個二進制位圖從這些數(shù)字圖像之一產(chǎn)生，其中所有滿足某一標(biāo)準(zhǔn)的值用1代替，所有不滿足某一標(biāo)準(zhǔn)的值用0代替。在一個實施例，該標(biāo)準(zhǔn)包括由圖像自身確定的閾值。第三，搜索該位圖以查找相鄰的1值像素組。在一個實施例中，該組還被相對于最小和/或最大尺寸標(biāo)準(zhǔn)進行測試。第四，對于合格的組，總和并記錄在相同圖像或另一圖像中對應(yīng)像素的值，確定和記錄該總和的平均值和其它統(tǒng)計特性。下面將描述適合各種分析的、在這種基本程序上的添加和變異。
分析下面描述的該分析方法的許多變異可根據(jù)本發(fā)明進行實踐。一般來講，用一個或多個熒光標(biāo)記種類的特征空間和/或瞬間分布來量化該分析。優(yōu)點是，熒光是使用線掃描共焦顯微鏡從基本上是平面的表面被觀察的。這個截面通過一般根據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)分析程序的復(fù)雜性增加程度的分析類型而被組織。然而，這種組織并不嚴(yán)格，因為該分析算法常?？梢杂迷诓恢挂粋€分析類型中。結(jié)合分析根據(jù)本發(fā)明的方法可以很容易地操作的第一型分析是結(jié)合分析。一般來說，用公開的線掃描共焦顯微鏡圖像系統(tǒng)獲得的、包含至少靶物質(zhì)和標(biāo)記配體的樣本的一個或多個熒光圖像，量化熒光素標(biāo)記配體與被研究的靶物質(zhì)的結(jié)合度。使用的配體包括熒光基團結(jié)合的天然或合成肽和蛋白質(zhì)、糖、脂類、核酸序列、病毒質(zhì)粒、抗菌素質(zhì)粒、天然和合成毒素、已知藥劑、有機小分子或神經(jīng)遞質(zhì)的合成類似物、或自發(fā)熒光小分子、肽或蛋白質(zhì)、從組合庫中合成的化合物、cDNA文庫的隨機肽、蛋白質(zhì)，和肽(peptidomimetics)(見Haugland R.P.熒光探針和研究化合物6th Ed.Chap.18)，但不僅僅限于此。靶物質(zhì)包括細(xì)胞提取物或受體純化試劑、配體門控或離子門控通道蛋白質(zhì)、酶、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架蛋白、抗體和從病毒、細(xì)菌、抗菌素、無脊椎和脊椎動物細(xì)胞衍生的物質(zhì)，但不僅僅限于此。示例性的受體包括如乙酰膽堿、腎上腺素(α和β)、蕈毒堿、多巴胺、甘氨酸、谷氨酸鹽、復(fù)合氨、天冬氨酸鹽、γ-氨基酪氨酸(GABA)、嘌呤(purinergic)、組氨酸、去加腎上腺素、P物質(zhì)、神經(jīng)肽Y、腦啡肽、神經(jīng)加壓素、縮膽囊素(CCK)、內(nèi)啡肽(阿片樣肽)、黑色素(melanocriotin)/ACTH促腎上腺皮質(zhì)激素、生長激素抑制素、甲狀旁腺激素、生長激素、促甲狀腺素、甲狀腺素、細(xì)胞分裂素、(chemokine)、胰島素、胰島素樣生長因子(IGF)、干細(xì)胞因子、黃體生成素釋放激素、促性腺激素、血管緊張素、內(nèi)皮素、神經(jīng)加壓素、干擾素、緩激肽、抗利尿激素、催產(chǎn)素、血管活性腸肽(VIP)、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、神經(jīng)營養(yǎng)素、紅細(xì)胞生成素、前列腺素、白三烯、凝血惡烷A2、降鈣素、T細(xì)胞、LDL/HDL、表皮生長因子(EGF)、雌激素和半乳糖酸(galainan)，但不僅僅限于這些。
基于硅珠的結(jié)合(bingding)圖15(a)-15(f)描述了可以根據(jù)本發(fā)明操作的受體結(jié)合分析的實施例的步驟。在圖15(a)中，由細(xì)胞或組織制備的、包含靶受體212的膜210被加入到包含液體230的孔220中。在圖15(b)中，熒光素標(biāo)記配體214被加入到孔220中；這些配體結(jié)合膜受體212。在圖15(c)中，硅珠224被加入到孔220中。另外，15(b)到15(c)的順序可以顛倒，在一個優(yōu)選實施例中，膜包被的硅珠是在加入孔里之前已經(jīng)被分開制備好。硅珠224的直徑范圍大約是1-20μm，被敷有一層物質(zhì)例如小麥胚凝集素，使膜220能粘附其上，或有一個表面允許膜直接共價或非共價結(jié)合。
前述步驟除了用熒光素標(biāo)記代替放射性標(biāo)記以外，均與圖1(a)-1(f)描述的現(xiàn)有技術(shù)SSA的相應(yīng)步驟一樣。但是，在本發(fā)明中，硅珠224是不發(fā)光的，它們有一定密度因此它們會沉降到孔的底部，或被磁化從而在使用外部磁鐵時可以使它們在孔底移動。在圖15(d)中，熒光素標(biāo)記被使用例如描述為元件240的線掃描共焦顯微鏡成像。在圖15(e)中，一個待測化合物218被加入孔中。如現(xiàn)有技術(shù)的分析一樣，本分析的目的是判斷待測化合物從膜受體212置換熒光素標(biāo)記214的程度。在圖15(f)中，仍然結(jié)合在膜210上的熒光素標(biāo)記被成像。通過比較兩個熒光圖像，可以確定待測化合物的活性。
在圖15(a)-(f)描述的分析的另一個實施例中，在圖15(d)描述的成像步驟可以省略，待測化合物的活性可通過將圖15(f)獲得的圖像與對照孔圖像，或與已知加入孔中的熒光素標(biāo)記配體量和已知它們與受體的親和力而獲得的預(yù)期圖像相比來確定。
在圖15(a)-(f)描述的分析的一個特別實施例中，受體是可識別配體的抗體，熒光素標(biāo)記與包含不定量未標(biāo)記配體的樣本一同加入進行反應(yīng)。如現(xiàn)有的放射免疫測定技術(shù)一樣，本分析的目的是通過測定從抗體受體中被置換的熒光素標(biāo)記配體214的程度來確定樣本中未標(biāo)記配體的濃度。
表面結(jié)合圖16(a)-16(f)描述了根據(jù)本發(fā)明的受體結(jié)合試驗的第二實施例的步驟。在圖16(a)中，由細(xì)胞或組織制備的，包含靶受體252的膜250被加入到包含液體270的孔260中?？椎撞?62涂有一層物質(zhì)例如可使膜粘附其上的小麥胚凝集素。在圖16(b)中，顯示了膜250結(jié)合在這層物質(zhì)上。在圖16(c)中，熒光素標(biāo)記配體254被加入到孔260中并結(jié)合該膜受體252。另外，16(b)和16(c)的順序可以顛倒。
在圖16(d)中，熒光素標(biāo)記的熒光被使用例如描述為元件280的線掃描共焦顯微鏡成像。在圖16(e)中，一個待測化合物258被加入孔260中。在圖16(f)中，仍然結(jié)合在膜250上的熒光素標(biāo)記被成像，并與第一個圖像比較，確定待測化合物258的活性。
在圖16(a)-(f)描述的分析的另一個實施例中，在圖16(d)的成像步驟可以省略，待測化合物的活性可通過將圖16(f)步獲得的圖像與對照孔圖像，或與已知加入孔中的熒光素標(biāo)記配體量和已知它們與受體的親和力而獲得的預(yù)期圖像相比來確定。
基于細(xì)胞的結(jié)合在另一個實施例中，通過收集表達靶物質(zhì)的細(xì)胞能夠很容易地分析配體-靶物質(zhì)結(jié)合。一般來說，用掃描化合物進行基于細(xì)胞的結(jié)合有很多優(yōu)點。特別是在競爭和代償這兩種影響化合物生物活性的細(xì)胞程序都存在時，測量研究物的活性。在細(xì)胞分析中，從細(xì)胞系或組織制備的細(xì)胞被放在組織培養(yǎng)孔中或顯微鏡的載玻片上，細(xì)胞可以存活和不受損害，或者可被諸如地高辛一類的試劑滲透，或可用甲醛固定。一個或多個熒光素標(biāo)記的配體和任何分析所需的無熒光素的試劑一起被加入細(xì)胞；熒光素標(biāo)記配體結(jié)合一個或多個細(xì)胞內(nèi)化合物。然后把待測化合物加入細(xì)胞。另外，熒光素配體和化合物的加入順序可以顛倒。使用例如元件240描述的線掃描共焦顯微鏡成像熒光素標(biāo)記。本分析的目的是測定待測化合物從受體中置換的熒光素標(biāo)記配體的濃度。成像在有或沒有待測化合物存在的情況下仍然結(jié)合在細(xì)胞上的熒光素標(biāo)記，通過比較這兩個熒光圖像，可以確定待測化合物的活性。
在基于細(xì)胞的受體結(jié)合試驗的另一個實施例中，可以省略沒有化合物情況下的成像步驟，待測化合物的活性可通過將存在化合物時獲得的圖像與對照孔圖像，或與已知加入孔中的熒光素標(biāo)記配體量和已知它們與受體的親和力而獲得的預(yù)期圖像相比來確定。
線掃描共焦顯微鏡在結(jié)合分析中的優(yōu)勢在第一實施例，用一個激發(fā)波長和一個發(fā)射波長執(zhí)行配體-靶物質(zhì)結(jié)合。圖24提供的數(shù)據(jù)示例了本發(fā)明的速度和敏感性。下面將描述涉及現(xiàn)有技術(shù)的它的性能的詳細(xì)分析，其中配體用放射性標(biāo)記以便于檢測。現(xiàn)有技術(shù)的受體-配體分析包括SSA形式，以及用物理方法將結(jié)合和未結(jié)合配體分開，并用加入液體閃爍劑測定結(jié)合到受體上的配體量的形式。
首先，本發(fā)明可用于小容量孔，例如1μL。在使用放射性標(biāo)記配體的受體-配體結(jié)合分析，每個放射性標(biāo)記，例如3H，僅一次就會衰減，每次衰減產(chǎn)生最多90個光子，每秒衰減率小于10-8。一個單一熒光素分子總共可產(chǎn)生104～107個光子，它每秒將發(fā)射103到106之間的光子。因此，相對于3H的熒光素標(biāo)記的計數(shù)率大約是1011。因此，在本發(fā)明，每孔只需要很少的標(biāo)記、膜和硅珠。例如，當(dāng)氚SSA需要每孔107個硅珠時，本發(fā)明每孔僅需要不到103個硅珠。結(jié)果，本發(fā)明僅在μL-容量孔和非常短的時間就可執(zhí)行。另外，在SSA很難改變成像時間，因為放射性標(biāo)記以固定速率衰減。相反，可增加熒光素標(biāo)記的激發(fā)速率以增加光子的發(fā)射率，從而減少了所需的成像時間。然而，激發(fā)速率不可能無限制地增加。實際上，在本申請中，存在所謂熒光激發(fā)率的飽和極限，這就是線掃描優(yōu)于點掃描之處。第二，本發(fā)明勿需時間和花費來處理放射性物質(zhì)。第三，因為本發(fā)明可在小容量孔中操作，化合物和試劑的耗費比SSA大大減少，進一步降低了費用。最后，本發(fā)明不需要涂布有發(fā)光劑的硅珠或底部，費用進一步降低。
本發(fā)明使用線掃描共焦顯微鏡來成像孔內(nèi)樣本的熒光。顯微鏡的共焦特征允許光學(xué)分割，即從樣本所處的平面檢測熒光，減少從大批溶液中檢測熒光。這省去了要除去未結(jié)合熒光標(biāo)記配體的沖洗步驟。這一步除了在SSA中不需要外，在其它任何受體-配體結(jié)合分析中仍需要，包括不用閃爍珠的RIA。該顯微鏡的共焦特征還排除了可能出現(xiàn)的待測化合物自發(fā)熒光的干擾問題。線掃描特性允許樣本在沒有丟失值得注意的背景反射時能以比傳統(tǒng)點掃描快的速度成像。速度的增加依賴于熒光基團強度、橫向分辨率、視野、硬件參數(shù)包括物鏡NA、檢測靈敏度和照相機讀出率。理論上講，速度的增加可達到每行像素的數(shù)目，這在本發(fā)明的優(yōu)選實施例是1000。實際上這個增加大約是100X。
為了量化這些優(yōu)點，下面將描述一個樣本示例。分析是基于細(xì)胞的，其中熒光的定位可精確到1μm。因此1mm直徑樣本區(qū)的成像將由～103像素的～103線構(gòu)成。被研究物體的熒光信號可能發(fā)自細(xì)胞表面的配體或細(xì)胞內(nèi)固定的源，例如核受體。在另一種情況下，熒光基團的局部濃度是一個重要的參數(shù)。對于一個基因工程(engineered)細(xì)胞系每細(xì)胞表達～105個受體，細(xì)胞平均濃度(cell-averaged)是-1μM。定位于核內(nèi)的幾千個受體導(dǎo)致可觀的局部濃度。符合所需的1μm橫向分辨率，每像素大約有～2×103的熒光基團。假定細(xì)胞背景自身的熒光基團少于標(biāo)記熒光，但在一個數(shù)量級，所需的信噪比最小是10。考慮進信號的閃粒噪聲和背景及高頻固態(tài)檢波器的讀噪聲，檢測到的光子的數(shù)目幾乎需要高達103。本發(fā)明使用約0.7NA的物鏡、阻擋濾光器和固態(tài)照相機的收集和檢測率是～1％。需要每像素約105光子，或每分子～102光子被發(fā)射?？稍诓坏揭幻?，更好的是幾分之一秒的時間內(nèi)獲得成像。如果以系列方式獲得像素，則像素滯留時間必須小于1μs，需要每秒每分子大于108的光子發(fā)射率。這超過了熒光基團典型的106的最大飽和值。重要的是，需要達到飽和的流量105～106W/cm2，同樣也足夠驅(qū)動非線性光子誘導(dǎo)的熒光基團去色。結(jié)果，在系列掃描中需要的數(shù)據(jù)速率下不能使用最高效的檢測裝置。相反，如果103像素被同步照射，則每個熒光基團的發(fā)射率僅需要105。點掃描共焦的背景熒光干擾(rejection)的增加不能克服掃描速度劇降的缺點。
圖24例舉的數(shù)據(jù)展示了所闡述的系統(tǒng)有足夠的靈敏度，以量化每珠數(shù)萬個熒光基團，同時在不到一秒的時間內(nèi)清楚地分析數(shù)百個單獨的硅珠。在cell-bassed結(jié)合試驗可獲得同等的數(shù)據(jù)，下面將舉例說明。
數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析程序與基于細(xì)胞的還是基于硅珠的或者是兩者同時都有密切相關(guān)，下面將描述。數(shù)據(jù)可用下面的程序分析，最簡單的是閾值分析算法。該程序的目的是判斷以連續(xù)的或點狀的方式定位的熒光標(biāo)記種類的量，以超過最小熒光強度，但不要超過最大熒光強度。在一個實施例中，該分析被用來分析化合物的活性。
該算法步驟如下1．獲得該標(biāo)記種類的數(shù)字化圖像。
2．逐行打開文檔和?。畯膱D像中減去照相機偏移值。
ⅱ．圖像中的每一行乘以平面場圖像文檔中對應(yīng)行的倒數(shù)。
3．任選地，將該圖像做成直方圖以確定背景標(biāo)準(zhǔn)。
4．建立包括最小值和任選地最大值的選擇標(biāo)準(zhǔn)。通過統(tǒng)計分析背景直方圖峰值寬度或使用預(yù)定值來確定該值，例如是平均背景標(biāo)準(zhǔn)的固定倍數(shù)，或是平均背景標(biāo)準(zhǔn)之上的計數(shù)的固定數(shù)目。
5．將圖像中的每個像素與選擇標(biāo)準(zhǔn)比較。如果圖像中的每個像素都符合標(biāo)準(zhǔn)，則添加該值到運行總數(shù)。報告符合標(biāo)準(zhǔn)的像素總數(shù)和平均強度。
這個程序被很方便地用在處理與圖24中相似的數(shù)據(jù)，其中單個硅珠被很清楚地從背景或人為假象中分辨出來，因為成堆的硅珠或細(xì)胞較小。這樣的程序同樣適合膜結(jié)合到孔底部的分析類型。
第二個可應(yīng)用于分析結(jié)合數(shù)據(jù)的程序是局域分析算法，它需要另外的分析程序。與閾值程序一樣，該程序的目的是判斷以連續(xù)的或點狀的方式定位的熒光標(biāo)記種類的量，在一個實施例中，該分析被用來分析化合物的活性。
該算法步驟如下1．獲得該標(biāo)記種類的數(shù)字化圖像。
2．逐行打開文檔和?。畯膱D像中減去照相機偏移值。
ⅱ．圖像中的每一行乘以平面場圖像文檔中對應(yīng)行的倒數(shù)。
3．任選地，將該圖像做成直方圖和總和像素值。
4．建立包括最小值和任選地最大值的選擇標(biāo)準(zhǔn)。通過統(tǒng)計分析背景直方圖峰值寬度或使用預(yù)定值來確定該值，例如為平均背景標(biāo)準(zhǔn)的固定倍數(shù)，或為平均背景標(biāo)準(zhǔn)之上的計數(shù)的固定數(shù)目。
5．將圖像中的每個像素與選擇標(biāo)準(zhǔn)比較。所有符合標(biāo)準(zhǔn)的像素都被賦值為1，其它被賦值為0，因此實現(xiàn)16到1位的壓縮。
6．通過將在具有接觸邊緣元素的二進制掩碼中的全部值為1的鄰接像素設(shè)置成0，來“清除”圖像邊緣。
7．搜索物品位圖，定義連續(xù)的組為值1的像素，通過1．以逐行的方式搜索圖像以發(fā)現(xiàn)值1的像素。
2．判斷所有值1的像素與在ⅰ中識別的像素連續(xù)。
3．任選地在物品上使用最小和最大尺寸濾光器，該尺寸已經(jīng)被預(yù)定。
4．如果物品合格，進行第8步，否則轉(zhuǎn)換所有物品中的1值像素為0并繼續(xù)搜索下一個物品。
5．如果到達最后一個位圖，則運行步驟9。
8．對每個通過濾光器標(biāo)準(zhǔn)的物品1．任選地創(chuàng)建一個含有擴展邊界的新矩形位圖，該位圖的擴展邊界包括從物品邊緣的每一個方向加上n個額外0像素的目標(biāo)。n是下面將運行的、并已經(jīng)預(yù)定好的擴張步驟的數(shù)目。
2．如果步驟8.ⅰ被執(zhí)行，通過應(yīng)用擴張步驟n次來擴張物品，其中接觸1值像素的0值像素被設(shè)定為1。
3．如果8.ⅰ步驟沒有執(zhí)行，則對于在擴張位圖或在初始位圖的1值像素的每次集合，總和與平均來自該圖像的相應(yīng)像素，以便在掩膜下計算平均像素強度。
4．轉(zhuǎn)換在初始位像中的所有像素成0，并返回到步驟7，以便搜索更多的物品。
9．在所有物品都被計數(shù)后，對圖像中所有物品，計算每個物品的熒光標(biāo)記種類的平均強度，和定位的種類的總強度的任意一部分，并把它與諸如標(biāo)準(zhǔn)差之類的統(tǒng)計信息一同報告。
在這個程序中所有下列算法共用的操作之間的區(qū)別是步驟4-6的二進制掩膜的創(chuàng)建。對于該掩膜的物品選擇標(biāo)準(zhǔn)可包括最小和最大值、尺寸和形狀。例如，在一個實施例，用于基于珠程(基于硅珠的)分析的分析程序包括步驟7ⅲ中的圓濾光器。
在第二實施例，同步檢測由一個或多個照明波長激發(fā)的兩個或多個熒光標(biāo)記種類的發(fā)射。如在結(jié)合分析中應(yīng)用的一樣，第一熒光標(biāo)記種類被用來識別第二熒光標(biāo)記種類結(jié)合的物品。在圖21和23提供了兩個二色基于細(xì)胞的結(jié)合分析。一個可用來分析這種圖像的程序示例是共-局域分析程序(Co-localization Analysis)，它設(shè)計用來判斷相對于第二熒光標(biāo)記種類定位的第一熒光標(biāo)記種類。在一個實施例，該分析被用來分析化合物的活性，例如在活性依賴于亞細(xì)胞定位的被研究化合物。
該算法步驟如下1．分別獲得第一和第二種標(biāo)記的數(shù)字圖像。
2．逐行打開文檔和?。畯拿總€圖像中減去照相機偏移值。
ⅱ．每個圖像中的每一行乘以平面場圖像文檔中對應(yīng)行的倒數(shù)。
3．任選地將第一圖像做成直方圖以判斷背景標(biāo)準(zhǔn)并總和第二種類的圖像強度。
4．建立包括最小值和任選地最大值的選擇標(biāo)準(zhǔn)。通過統(tǒng)計分析背景直方圖峰值寬度或使用預(yù)定值來確定該值，例如為平均背景標(biāo)準(zhǔn)的固定倍數(shù)，為平均背景標(biāo)準(zhǔn)之上的計數(shù)的固定數(shù)目。
5．將第一種類圖像中的每個像素與選擇標(biāo)準(zhǔn)比較。所有符合標(biāo)準(zhǔn)的像素都被賦值為1，其它被賦值為0，因此實現(xiàn)16到1位的壓縮。
6．通過將在具有接觸邊緣元素的二進制掩碼中的全部值為1的鄰接像素設(shè)置成0，來“清除”圖像邊緣。
7．搜索物品位圖，定義為連續(xù)的值1的像素組，通過1．逐行的方式搜索圖像以發(fā)現(xiàn)值1的像素。
2．判斷所有值1的像素與在ⅰ中識別的像素連續(xù)。
3．任選的在物品上使用最小和最大尺寸濾光器，該尺寸已經(jīng)被預(yù)定。
4．如果物品合格，進行第8步，否則轉(zhuǎn)換所有物品中的1值像素為0并繼續(xù)搜索下一個物品。
5．如果到達最后一個位圖，則運行步驟9。
8．對每個通過濾光器標(biāo)準(zhǔn)的物品1．任選地創(chuàng)建一個含有擴展邊界的新矩形位圖，該位圖的擴展邊界包括從物品邊緣的每一個方向加上n個額外0像素的物品。n是下面將運行的、并已經(jīng)預(yù)定好的擴張步驟的數(shù)目。
2．如果步驟8.ⅰ被執(zhí)行，通過應(yīng)用擴張步驟n次來擴張物品，其中接觸1值像素的0值像素被設(shè)定為1。
3．如果8.ⅰ步驟沒有執(zhí)行，則對于在擴張位圖或在初始位圖的1值像素的每次集合，總和與平均來自第二種類的圖像的相應(yīng)像素，以便在掩膜下計算平均像素強度。
4．轉(zhuǎn)換在初始位像中的所有像素成0，并返回到步驟7、以便搜索更多的物品。
9．在所有物品都被計數(shù)后，對圖像中所有物品，計算每個物品的第二熒光標(biāo)記的種類的平均強度和與第一種類共同定位的第二種類的總強度的任意一部分，并把它與諸如標(biāo)準(zhǔn)差之類的統(tǒng)計信息一同報告。
這個更詳細(xì)程序的優(yōu)點是，該物品不論它是細(xì)胞還是硅珠都能被獨立地識別出來。如圖21的示例不是所有的細(xì)胞都有反應(yīng)。例如，細(xì)胞的單獨識別將使反應(yīng)與不反應(yīng)細(xì)胞的比率與那些反應(yīng)者中反應(yīng)的程度一同制成表格。這個算法，不管它的別的復(fù)雜性，可以在PentiumЦ平臺上執(zhí)行以在一秒時間內(nèi)分析1兆像素。
易位分析根據(jù)第二實施例可容易執(zhí)行另外的分析類型，即由一個或多個照明波長激發(fā)的兩個或多個熒光標(biāo)記種類的發(fā)射被同步檢測的易位分析。在這些分析中，被研究物質(zhì)的易位是一個或多個種類，它可以是蛋白質(zhì)、脂類、或其它分子復(fù)合物或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)如囊泡，從一個細(xì)胞的輪廓分明的區(qū)域到另一個。這包括但并不僅限于突觸(synaptin)(囊泡膜蛋白)、轉(zhuǎn)錄因子(NK-kB,NFAT,AP-1)，激素受體，LDL/HDL受體，T細(xì)胞受體，和PTH受體。
原型的易位分析是共-局域化測定的一個特殊情況。例如，第一和第二種類的共-局域化被相對于第一種類的第二種類共-局域化的那一部分量化，或者第二種類與第一種類和存在于細(xì)胞別處的共-局域化的比率量化。下面提供比較適合用于處理易位圖像數(shù)據(jù)的擴展分析程序。
該標(biāo)記定位于細(xì)胞核，該標(biāo)記是對DNA特異的熒光，例如Hoechst33342。其它對核酸特異的染料是本領(lǐng)域共知的(如Haugland,R.P.熒光探針和研究化學(xué)，第六版，第8章)。第二種是轉(zhuǎn)錄因子，它從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核的遷移是分析的對象。這種蛋白可用多種方法標(biāo)記，包括與GFP融合的表達，接觸對轉(zhuǎn)錄因子蛋白特異的熒光標(biāo)記抗體的樣本。
下面易位數(shù)據(jù)分析程序(translocation Data Analysis)可被用來判斷以與第二種熒光標(biāo)記相關(guān)或不相關(guān)的方式分布的第一種熒光標(biāo)記的量。在一個實施例，該分析被用來分析化合物的活性。
1 分別獲得第一和第二種標(biāo)記的數(shù)字圖像。
2 逐行打開文檔和?。畯拿總€圖像中減去照相機偏移值。
ⅱ．每個圖像中的每一行乘以平面場圖像文檔中對應(yīng)行的倒數(shù)。
3 任選地將第一種類圖像做成直方圖以判斷背景標(biāo)準(zhǔn)并總和第二種類的圖像強度。
4 建立包括最小值和任意最大值的選擇標(biāo)準(zhǔn)。通過統(tǒng)計分析背景直方圖峰值寬度或使用預(yù)定值來確定該值，例如為平均背景標(biāo)準(zhǔn)的固定倍數(shù)，為平均背景標(biāo)準(zhǔn)之上的計數(shù)的固定數(shù)目。
5 將第一種類圖像中的每個像素與選擇標(biāo)準(zhǔn)比較。所有符合標(biāo)準(zhǔn)的像素都被賦值為1，其它被賦值為0，因此實現(xiàn)16到1位的壓縮。
6．通過將在具有接觸邊緣元素的二進制掩碼中的全部值為1的鄰接像素設(shè)置成0，來清除圖像邊緣。
7 搜索物品位圖，定義為連續(xù)的值1的像素組，通過1 逐行的方式搜索圖像以發(fā)現(xiàn)值1的像素。
2 判斷所有值1的像素與在ⅰ中識別的像素連續(xù)。
3 任選的在物品上使用最小和最大尺寸濾光器，該尺寸已經(jīng)被預(yù)定。
4 如果物品合格，進行第8步，否則轉(zhuǎn)換所有物品中的1值像素為0并繼續(xù)搜索下一個物品。
5 如果到達最后一個位圖，則運行步驟9。
8．對每個通過濾光器標(biāo)準(zhǔn)的物品1 創(chuàng)建一個含有擴展邊界的新矩形位圖，該位圖的擴展邊界包括從物品邊緣的每一個方向加上n個額外0像素的物品。n是下面將運行的、并已經(jīng)預(yù)定好的擴張步驟的數(shù)目。
2 通過應(yīng)用擴張步驟n次來擴張物品，其中接觸1值像素的0值像素被設(shè)定為1。
3 比較擴展位圖與初始實際大小位圖。設(shè)置在擴展為途中的所有像素即在初始位圖中對應(yīng)區(qū)域的1值為0。這樣產(chǎn)生一個環(huán)形掩膜，保證在擴展期間位圖邊緣增加時只有一個物品被捕獲。
4 從原始物品創(chuàng)建另一個位圖，通過設(shè)置接觸0值像素的1值像素為0侵蝕它m次。M等同于n，已在前面確定。
5 對于在環(huán)形或在侵蝕的位圖的1值像素的每次集合，總和與平均來自第二種類的圖像的相應(yīng)像素，以在侵蝕的或環(huán)形掩膜下計算平均像素強度。
6 計算每個物品侵蝕的對環(huán)形位圖的比率并存儲在表中。
7 轉(zhuǎn)換在初始位像中的所有物品像素成0，并返回到步驟7、以便搜索更多的物品。
9 在所有物品都被計數(shù)后，計算圖像中所有物品的平均強度比率，并把它與諸如標(biāo)準(zhǔn)差之類的統(tǒng)計信息一同報告。
這個程序區(qū)別于上述程序的新特征是在第8步兩個子掩膜的創(chuàng)建，一個是原始掩膜的環(huán)形擴展，一個是原始掩膜的侵蝕的樣式。在這個例子中，后一種被用來量化種類2和種類1，轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞核(實際上是DNA)的共-局域化。前一個掩膜被用來量化沒有共-局域化的種類2。在當(dāng)前例子中，這兩種量化的比率是在逐個細(xì)胞基礎(chǔ)上形成，將結(jié)果制成一個表。
根據(jù)本發(fā)明的方法，數(shù)據(jù)的采集和分析幾乎可以在1秒鐘時間內(nèi)完成。為了比較，這里引用兩個現(xiàn)有技術(shù)的例子。在Ding等(J.Biol.Chem,273,28897-28905(1998))中，執(zhí)行了一個二色易位分析。本發(fā)明的優(yōu)點包括1)每圖像通道幾乎50X的快速圖像獲取，2)同步二色圖像獲取，3)大約10X的高敏性，允許低染色標(biāo)準(zhǔn)。4)共焦檢測，允許省卻沖洗步驟，5)對比大約30秒的聚焦時間，本發(fā)明僅需0.1秒聚焦時間。6)對比3-6s/幀的數(shù)據(jù)分析時間，它僅需0.2s/幀，7)連續(xù)圖像獲取?，F(xiàn)有技術(shù)的第二個例子是Deptala等(Cytometry,33,376-382,(1998))。本發(fā)明提供1)高空間分辨率，約為4X，2)大約為16X的高像素獲取率，3)快速數(shù)據(jù)分析，4)微量滴定板上可操作的自動聚焦系統(tǒng)，和5)對比3-6s/幀的數(shù)據(jù)分析時間，它僅需0.2s/幀。
胞吞、胞吐和受體螯合一般來講，胞吞、胞吐、受體螯合和再循環(huán)是可以根據(jù)第一或第二實施例以及上述的相關(guān)圖像分析方案分析的特殊的附加程序。熒光標(biāo)記可以根據(jù)各種已知的方法來完成。例如，由Tarasova等公開的包括受體和配體標(biāo)記的一流試驗。本圖像分析系統(tǒng)每圖像通道可快50X，可同步獲得兩個圖像。另外，本分析方案，例如共-局域化算法可被用來實時處理螯合圖像數(shù)據(jù)?，F(xiàn)有技術(shù)中沒有這樣的例子。
現(xiàn)有技術(shù)中已知許多其它分析需要類似的圖像和分析能力。例如，吞噬作用和相關(guān)的細(xì)胞活動，(例如J.Immunology,(1983)130,1910；J,Leukocyte Biol.(1988)43,304)；另外包括受體介導(dǎo)的和非受體介導(dǎo)的胞吞和胞吐分析(例如Neuron 14,983(1995)；J.Physiol.460,287(1993)和Science 255,200(1992)),包括低密度脂蛋白復(fù)合物(Low-Density Lipoprotein Complexes)(見J.Cell Biol.121,1257(1993)和脊椎動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染傳遞(見Cell 49,423(1994))；熒光標(biāo)記的表皮生長因子的內(nèi)吞和橫向運動性的成像(見Proc.Natl.Acad.Sci.USA75,2135(1975)；J Cell Biol.109,2105(1989))；有熒光葡聚糖胞吞作用監(jiān)測胞吐物質(zhì)的攝取和內(nèi)部處理(見J.Biol.Chem.269,12918(1994)),用親水性染料在激活神經(jīng)元過程中的胞吞介導(dǎo)的突觸小泡再循環(huán)的成像(見Nature 314,357(1985))。另外,細(xì)胞系表達綠色熒光蛋白(GFP)與位于胞吐和分泌小泡中的蛋白(見J.Cell Sci.110,1453(1997))融合的遺傳工程或定位于分化的神經(jīng)細(xì)胞生長錐的tPA(見Mol.Biol.Cell 9:2463(1998))允許監(jiān)測胞吐作用。眾多的熒光標(biāo)記可以用于這樣的分析(見Haugland,R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊，第六版，第17章)。
離子通道本發(fā)明的第三個實施例，在圖9描述的樣式之一可被用來成像在每秒約30幀的速率下一個或多個熒光標(biāo)記種類的時間依賴的反應(yīng)。這允許捕獲諸如開啟或關(guān)閉離子通道的瞬態(tài)現(xiàn)象。示例的離子通道包括K+-門控電壓、Na+-門控電壓、Ca++-門控電壓、Cl-、Na+/K+ATP酶和P糖蛋白。
下面的動態(tài)成像數(shù)據(jù)分析(Kinetic Imaging Data Analysis)算法定義和跟蹤一幀一幀的單個細(xì)胞，能夠同步動力學(xué)分析足夠數(shù)目的細(xì)胞以獲得滿意的有統(tǒng)計學(xué)意義的數(shù)據(jù)。該算法步驟如下1 獲得一個(僅僅指示劑)、二個(標(biāo)記物和指示劑或兩個指示劑)或多個數(shù)字圖像作為時間的函數(shù)。
2 逐行打開文檔和?。畯拿總€圖像中減去各個照相機偏移值。
ⅱ．每個圖像中的每一行乘以各個平面場圖像文檔中對應(yīng)行的倒數(shù)。從每個圖像中減去各個照相機偏移值。
3 任選地將第一種類圖像做成直方圖以判斷背景標(biāo)準(zhǔn)。
4 建立包括最小值和任意最大值的選擇標(biāo)準(zhǔn)。通過統(tǒng)計分析背景直方圖峰值寬度或使用預(yù)定值來確定該值，例如為平均背景標(biāo)準(zhǔn)的固定倍數(shù)，為平均背景標(biāo)準(zhǔn)之上的計數(shù)的固定數(shù)目。
5 將第一種類圖像中的每個像素與選擇標(biāo)準(zhǔn)比較。所有符合標(biāo)準(zhǔn)的像素都被賦值為1，其它被賦值為0，因此實現(xiàn)16到1位的壓縮。
6 通過將在具有接觸邊緣元素的二進制掩碼中的全部值為1的鄰接像素設(shè)置成0，來“清除”圖像邊緣。
7 搜索物品位圖，定義為連續(xù)的組值1像素，通過?。鹦械姆绞剿阉鲌D像以發(fā)現(xiàn)值1的像素。
ⅱ．判斷所有值1的像素與在ⅰ中識別的像素連續(xù)。
ⅲ．任選的在物品上使用最小和最大尺寸濾光器，該尺寸已經(jīng)被預(yù)定。
ⅳ．如果物品合格，進行第8步，否則轉(zhuǎn)換所有物品中的1值像素為0并繼續(xù)搜索下一個物品。
ⅴ．如果到達最后一個位圖，則運行步驟9。
8．對每個通過濾光器標(biāo)準(zhǔn)的物品將時間序列中的每個圖像的對應(yīng)像素平均。如果使用單一指示劑，記錄這個強度。如果使用輻射測量的指示劑，將時間序列中的每個圖像用另一個圖像的值來劃分一個圖像的值，并記錄結(jié)果。
9 在所有物品都被分析后，報告步驟8的每個物品的分析結(jié)果。報告每個物品的包括沖洗時間、衰減時間和振幅的動態(tài)參數(shù)，作為從一批動力學(xué)分析和從固定時間的一套所有物品衍生的統(tǒng)計信息。
圖19和20提供了使用本發(fā)明以成像和分析與離子通道相關(guān)的瞬態(tài)動作的兩個例子。這些分析使用Ca++敏染料、Fluo-3來指示細(xì)胞內(nèi)Ca++濃度變化。在第一個試驗中，變化是由于乙酰膽堿受體的激活促發(fā)的Ca++第二信號引起。在第二個試驗，該變化是由電壓門控Ca++通道的激活引起的。
離子通道是近些年研究的熱點領(lǐng)域。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點在下面的比較后會變得很明顯。
在化合物篩選應(yīng)用中，引用背景技術(shù)部分的現(xiàn)有技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，是在美國專利號5,335,215中公開的。這個裝置最初用來檢測細(xì)胞內(nèi)Ca++的感應(yīng)變化，包括一個用于促發(fā)瞬態(tài)動作的分配器。本發(fā)明優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的主要點如下1)成像和分析容許通過與該孔的平均反應(yīng)水平比較來判斷單個細(xì)胞的反應(yīng)。2)敏感性的增加，只需要添加少量的試劑和低的光照強度，所需樣本量也減少。3)以視頻速率獲得圖像，可與每秒1點的最大率相比。
在研究應(yīng)用中，在生物共焦顯微鏡手冊(Handbook of BiologicalConfocal Microscopy)J.B.Pawley,ed.,Plenum出版社，紐約，1995,pp.459-478中公開的Tsien系統(tǒng)和合作者做為標(biāo)準(zhǔn)。它已顯示具有以超過本發(fā)明的速率成像的能力。然而，這個不能用在現(xiàn)在研究的樣本?，F(xiàn)有技術(shù)需要在一個可比的信噪比，每像素102-103較大的熒光基團以達到本發(fā)明的速率。另外，本發(fā)明可在12-或16-位分辯率，給出4-16X較大的動態(tài)范圍情況下獲得圖像。
研究系統(tǒng)的第二個例子在Sun等,J.Physiology,509,67-80,1998.中被公開。根據(jù)Sun，使用傳統(tǒng)的點掃描共焦顯微鏡，可在速率高達650Hz/600像素線，以5微秒/像素積分時間產(chǎn)生數(shù)據(jù)。只能產(chǎn)生一維圖像。可以監(jiān)測位于掃描線上的物品的瞬時現(xiàn)象。另外，這個速率只有在1μs像素積分時間才可以達到，需要102-103大的熒光濃度以達到可與本發(fā)明相比的圖像質(zhì)量。
本發(fā)明成像和分析細(xì)胞內(nèi)離子濃度應(yīng)答外部刺激變化的能力在化合物篩選和一般生物研究應(yīng)用中有多重應(yīng)用(例如見J.Cell Biol.137(3),633-648(1997)；J.Biol.Chem.271(9),4999-5006(1996)；Science280,69-76(1998)；Biochem,J.324,645-651(1997))。許多熒光指示劑被用在對特定離子敏感的試驗中(見Haugland,R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊，第六版，第18、22和24章)。這些指示劑容許Mg2+、Zn2+、Ca2+、Na+、Fe2+、Hg2+、Pb2+、Cd2+、Ni2+、Co2+、Al3+、Ga2+、Eu3+、Tb3+、Sm3+和Dy3+的濃度測定。另外，即使在有其它生理濃度的單價陽離子存在的情況下也可以分析Na+和K+(見J.Biol.Chem.264,19449(1989))，包括分析各種細(xì)胞例如血細(xì)胞、腦細(xì)胞和肌肉細(xì)胞中Na+水平或Na+的流動(見J.Biol.Chem.268,18640(1993)；J.Neurosi.14,2464(1994)；Am J.Physiol.267,H568(1994))，和精子細(xì)胞、神經(jīng)末梢突觸體及淋巴細(xì)胞中K+的變化。另外，本發(fā)明可被用在分析在囊泡、脂質(zhì)體和活細(xì)胞中Cl-的濃度(見Am.J.Physio.259,c375(1990))。
另外，本發(fā)明還可用來分析細(xì)胞和細(xì)胞器上膜電位的變化。迅速地成像膜電位的變化是分析細(xì)胞和細(xì)胞器的生存力、神經(jīng)沖動的產(chǎn)生、肌肉收縮、細(xì)胞信號和離子門孔通道的關(guān)結(jié)合(見Biophys J.67,208(1994)；Neuron 13,1187(1994)；J Membrane Biol.130,1(1992))。熒光標(biāo)記可用來對可興奮細(xì)胞如神經(jīng)元、心肌細(xì)胞和無損傷的腦細(xì)胞產(chǎn)生快速(微秒)膜電位變化應(yīng)答(見Haugland,R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊，第六版，第25章)。應(yīng)答快速跨膜電位變化的熒光探針僅僅顯示一般為每100mV約2-10％的熒光基團變化。細(xì)胞等離子膜有大約-70mv的跨膜電位，一些細(xì)胞器例如線粒體的跨膜電位可保持-150mV。因此，包括這種快速變化的分析需要高靈敏度，快速的數(shù)據(jù)采集能力，這對于本發(fā)明的各種實施例來說很平常。
基于熒光共振能傳遞的測定本發(fā)明可很容易地用來執(zhí)行包括熒光共振能傳遞(FRET)的分析。當(dāng)一個熒光基團，供體，吸收一個光子并將該吸收的能量非放射性地轉(zhuǎn)移給另一個熒光基團，受體，則發(fā)生FRET。然后，該受體以它的特征波長發(fā)射該能量。供體和受體分子必須非常接近，小于10nm，以利于有效能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生。(見Methods Enzymol.211,353-388(1992)；Methods Enzymol.246,300-334(1995))。這種所需的鄰近可被用來創(chuàng)立對于供體-受體對之間的小間隙敏感的分析。FRET典型的需要單一激發(fā)波長和兩個發(fā)射波長，一個分析包括供體和受體發(fā)射強度的比率。FRET供體-受體對可被用來創(chuàng)立不但基于硅珠的而且基于細(xì)胞的分析。幾種顯示增強的熒光和改變的發(fā)射波長的綠色熒光蛋白(GFP)突變體可通過將GFP FRET供體與一個蛋白融合，GFP FRET受體與相同的蛋白融合或同在同一個細(xì)胞內(nèi)表達的另一個蛋白融合，而與FRET基于細(xì)胞的分析配對。這樣的FRET對可用來分析分子內(nèi)變化，如Ca2+的Ca2+-調(diào)鈣素結(jié)合或分子間相互作用，如受體二聚化作用。上面公開的動態(tài)成像算法可以優(yōu)先使用。
瞬時轉(zhuǎn)染基于圖像的測定中，最顯著的優(yōu)勢是不但有機會觀察到一般情況下會丟失的珍貴的事件，而且可以規(guī)格化在逐個物品的基礎(chǔ)上的一級反應(yīng)成為二級反應(yīng)。這兩個特征在使用具有瞬時轉(zhuǎn)染的靶物質(zhì)的細(xì)胞系的分析中都很重要。轉(zhuǎn)染之后的基因表達和繼發(fā)的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生常常是無效且瞬時的(見Bio Techniques 24；478-482(1998))。根據(jù)本發(fā)明可以很容易地使用的監(jiān)測轉(zhuǎn)染效率的方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如，被研究基因可與綠色熒光蛋白(GFP)基因一起轉(zhuǎn)染，這樣這兩個蛋白將會作為融合蛋白表達或分開的實體表達。本發(fā)明可用來檢測存在于一個波長處的指示劑的量以及在另一處與靶物質(zhì)相關(guān)的反應(yīng)。前面的信號可被用來規(guī)格化后面的對所存在的靶物質(zhì)量的反應(yīng)。這容許本發(fā)明執(zhí)行對靶物質(zhì)的分析，這種靶物質(zhì)因為它不穩(wěn)定以至于不能用當(dāng)前使用的篩選方法和不能檢測僅僅百分之幾的轉(zhuǎn)染率。上面公開的動態(tài)成像算法可被用來分析這樣的數(shù)據(jù)，這里只需要一個圖像幀。可以監(jiān)測細(xì)胞的病毒感染，要么直接通過病毒蛋白的表達，要么間接通過獲得新的表型，即使僅僅只有很少的細(xì)胞被感染。最后，本發(fā)明提供用于檢測珍貴事件，例如獲得新表型，這種新表型是由于整個細(xì)胞群被不同cDNAs文庫轉(zhuǎn)染結(jié)果導(dǎo)致單個細(xì)胞或一群細(xì)胞轉(zhuǎn)染特異的cDNA而獲得。
酶分析本發(fā)明可被用于進行一般酶活性的分析。示例性的細(xì)胞內(nèi)酶包括碳酸酐酶、鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白(G蛋白)、腺苷酸環(huán)化酶、調(diào)鈣素、PI、PIP和PIP2激酶、酪氨酸蛋白激酶、蛋白磷酸酶、β-內(nèi)酰胺酶、β-牛乳糖、二氫葉酸還原酶、磷酸二脂酶、鈣長石(caspase)、蛋白體蛋白酶、氮氧化物合酶、胸腺嘧啶脫氧核苷激酶、核苷脫氨酶、谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶、脂氧合酶和磷脂酶，但不僅限于此。
圖17(a)-17(b)描述了根據(jù)本發(fā)明的酶分析的第一實施例的步驟。在圖17(a)中，包被有已知數(shù)量的熒光標(biāo)記肽312的硅珠310被加入到含有液體330的孔320中。硅珠310具有的密度使它們沉積到孔的底部。在圖17(b)中，待測化合物314被加入到孔中。在圖17(c)中，酶316被加入到孔中。除了在沒有待測化合物之前孔里不能加入肽或酶之外，圖17(a)、17(b)和圖17(c)描述的步驟的順序可以互換。如果沒有限制，則酶316將分裂肽312，并且將熒光標(biāo)記混勻到液體中。另一方面，如果待測化合物314限制酶316，典型的是封閉了酶的活性位點，酶316將不能分裂熒光標(biāo)記。在圖17(d)中，仍然包被在硅珠上的熒光標(biāo)記，例如，使用如圖中描述的340元件即線掃描共焦顯微鏡成像。從這個圖像中，可以判斷待測化合物的活性。
在圖17(a)-17(d)描述的酶分析的另一實施例中，待測化合物的活性可以通過將在圖17(d)中獲得的圖像與在圖17(a)或17(b)中成像熒光標(biāo)記的熒光獲得的圖像或?qū)φ战M圖像比較而確定。
圖18(a)-18(d)描述了根據(jù)本發(fā)明的酶分析的第二實施例的步驟。在圖18(a)中，包被有已知數(shù)量的熒光標(biāo)記肽352涂布在孔360中。在圖18(b)中，待測化合物354被加入到孔中。在圖18(c)中，酶356被加入到孔中。在圖18(d)中，仍然涂布在孔底部的熒光標(biāo)記，例如，使用如圖中描述的380元件即線掃描共焦顯微鏡成像，以判斷待測化合物354的活性。
在圖18(a)-18(d)描述的酶分析的另一實施例中，待測化合物的活性可以通過將在圖18(d)中獲得的圖像與在圖18(a)或18(b)中成像熒光標(biāo)記的熒光獲得的圖像或?qū)φ战M圖像比較而確定。
可以根據(jù)本發(fā)明實行的另一個分析的示例是酪氨酸激酶分析。酪氨酸激酶磷酸化底物肽中的酪氨酸殘基。底物肽中既有酪氨酸殘基又有熒光標(biāo)記。在這個分析中，一側(cè)末端被選擇為磷酸化殘基的抗體，以另一末端結(jié)合到諸如硅珠或孔底部表面。酪氨酸激酶和有酪氨酸殘基的熒光標(biāo)記肽被加入孔中。如果酪氨酸激酶磷酸化該肽，該磷酸化的酪氨酸將結(jié)合到抗體上。從而將熒光標(biāo)記定位于抗體附著物的表面。如果酪氨酸激酶沒有磷酸化該肽，在肽上的熒光標(biāo)記將分散于孔中。通過測定粘結(jié)在表面的熒光基團可以判斷該肽磷酸化的程度。這種分析還可被用作對由酶作用于熒光底物產(chǎn)生的熒光產(chǎn)品特異的抗體上。
另外，根據(jù)本發(fā)明還可以進行活細(xì)胞酶分析?，F(xiàn)有技術(shù)已知有許多可以分析活細(xì)胞的酶活性的技術(shù)(見Biolchem.Histochem。70,243(1995)，J.Fluorescence 3,119(1993))，用酶作用于可以產(chǎn)生熒光的底物上(見Haugland，R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊，第六版，第10章)。一般來講，這些分析使用被動地進入細(xì)胞繼而被細(xì)胞內(nèi)酶作用產(chǎn)生留存在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)品的探針。其它底物產(chǎn)生不溶性熒光產(chǎn)品沉積在酶活性位點。本發(fā)明可分析酶活性度和使用這樣的探針判斷酶活性的準(zhǔn)確空間位點。使用本發(fā)明進行多種酶分析所用的探針包括磷酸酶、ATP酶、5｀核苷酸酶、DNA和RNA多聚酶、肽酶、蛋白酶、酯酶和過氧化物酶，但不僅限于此。
酶活性分析可以根據(jù)上面公開的第一或第二示例性實施例和相關(guān)的圖像分析方案。
形態(tài)學(xué)本發(fā)明的方法還可以被用來進行那些需要判斷細(xì)胞的或亞細(xì)胞的形態(tài)，包括軸突和細(xì)胞器的分析，但不僅限于此。為進行這樣的分析，通過直接顯微注射或使用可以被代謝或被改變從而能夠滯留在研究物結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞滲透劑接觸細(xì)胞，將熒光探針導(dǎo)入研究物例如細(xì)胞或細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)內(nèi)。如果被用于活細(xì)胞，該熒光標(biāo)記必須是無毒的和無生物學(xué)活性的。有很多商業(yè)化的可以用于該分析的合適的染料(見Haugland,R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊，第六版，第15章)，例如，包括毛細(xì)血管連續(xù)流、神經(jīng)元細(xì)胞連接性，通過縫隙連接、細(xì)胞分裂和細(xì)胞溶解以及脂質(zhì)體融合的染料易位。另外，這些跟蹤劑可用于跟蹤在培養(yǎng)、組織或無損傷有機物中的標(biāo)記細(xì)胞的運動。現(xiàn)有技術(shù)中有很多已知的用熒光示蹤劑分析細(xì)胞或亞細(xì)胞形態(tài)或運動的技術(shù)，包括使用生物素右旋糖苷共軛體、熒光素微滴、或蛋白和蛋白共軛體(見Meth.Cell.Biol.29,153(1989)；Cytometry 21,230(1995)；Cell 84,381(1996)；Biolchem.Biophys.Acta 998,319(1989)；Cytometry 14,747(1993))。當(dāng)使用于這些類型的分析時本發(fā)明的各種實施例具有明顯的優(yōu)勢。本發(fā)明容許具有極好的空間分辨率的多種參數(shù)快速成像。
核酸本發(fā)明還可用于進行核酸的分析。受益于本發(fā)明的空間分辨力和多波長成像能力的特定DNA分析是熒光原位雜交(FISH)。FISH是用于定位和判斷在細(xì)胞、組織、間期細(xì)胞核和中期染色體中特定核酸序列的相對含量，用于臨床診斷和基因定位的重要的技術(shù)(見Histo-chem J.27,4(1995)；Science 247,64(1990)；Trends Genet.9,71(1993)和Science 250,559(1990))。多種熒光雜交探針被用于彩色熒光DNA和RNA雜交技術(shù)(見Haugland,R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊，第六版，第8.4章)。另一種技術(shù)通過使用AT或GC選擇性DNA染料并核酸復(fù)染來判斷染色體分帶。這種技術(shù)被廣泛用于核型分析和染色體結(jié)構(gòu)研究(見Human Genet.57,1(1981))。
活性氧類本發(fā)明還可被用于分析各種活性氧種類如單肽氧、過氧化物和氮氧化物的水平。這些活性氧種類的重要性才剛剛被發(fā)現(xiàn)(見BiplchemPharmcol 47,373(1994),J.Cell Biol.126,901(1994))。已知由活性氧引起的生理損傷的一大部分是由單態(tài)氧引起(見J.Photochem.Photobiol.11,241(1991)).Nitric Oxide(NO))，特別是，現(xiàn)在知道它在包括神經(jīng)傳遞和血壓調(diào)節(jié)的很多生理過程中起到關(guān)結(jié)合的分子介導(dǎo)的作用(見Current Biology 2,437(1995),J.Med.Chem.38,4343(1995),Cell 78,919(1994))?，F(xiàn)有技術(shù)已知的是使用間接的方法分析NO。例如，在生理條件下，NO被氧化成亞硝酸鹽，這可以通過監(jiān)測它在548nm處的吸光率或使用一個與亞硝酸鹽反應(yīng)的探針以形成可確認(rèn)的熒光基團產(chǎn)品而檢測(見Haugland，R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊，第六版，第21章)。
pH本發(fā)明還可被用于執(zhí)行包括測定細(xì)胞內(nèi)或無細(xì)胞介質(zhì)中pH變化的分析。細(xì)胞內(nèi)pH所起作用的重要性在包括細(xì)胞增生、凋亡、受精、壞死、多重抗藥性、離子轉(zhuǎn)運、溶酶體沉積病和早老年性癡呆等很多種不同的生理和病理過程中早已被認(rèn)識到(見Cell Physiol.Biochem.2,159(1992)；J.Biol.Chem.270,6235(1995)；Biophys.J.68,739(1995)；J.Biol.Chem.270,19599(1995)；Cancer Res.54,5670(1994))。用于分析在生理范圍內(nèi)的pH變化的熒光探針可以購買到(見Haugland,R.P.熒光探針和研究化學(xué)手冊，第六版，第23章)。
示例這里描述和申明的發(fā)明通過參考以下的示例能夠更容易地被本領(lǐng)域的普通熟練技術(shù)人員所理解。這些示例僅僅是為了說明本發(fā)明的幾個方面，而不能解釋為對本發(fā)明的任何限制。
轉(zhuǎn)錄因子易位細(xì)胞在96孔板中生長、固定、用Texas Red標(biāo)記的抗體孵育成轉(zhuǎn)錄因子蛋白、沖洗、然后用5μM Hoechst 33342緩沖液染色。
圖像按0.5×0.5mm2的矩形進行觀察，該矩形中的像素點大小為1.08×1.08μm2。Texas Red輻射在568nm處被激發(fā)，由600-nm長的過濾器檢測。Hoechst輻射在364nm處被激發(fā)，由420-480-nm的帶通濾波器檢測。圖像獲取時間為0.9秒。每幅圖像有～150個細(xì)胞。
不活動的一個視野中的細(xì)胞的圖像在固定以前獲得。在細(xì)胞核中的Texas Red的強度比細(xì)胞質(zhì)中的要低。產(chǎn)生用Texas Red標(biāo)記的抗體和Hoechst 33342染色的細(xì)胞圖像的一幅合成圖。
不活動的一個視野中的細(xì)胞的圖像在固定以前獲得。由于色標(biāo)的原因，如果細(xì)胞核不飽和，則難于看到細(xì)胞質(zhì)。產(chǎn)生用Texas Red標(biāo)記的抗體和Hoechst 33342染色的細(xì)胞圖像的一幅合成圖。
該數(shù)據(jù)分析按照以下方法執(zhí)行。該Hoechst圖像的一種二進制表示通過施加適當(dāng)?shù)拈撝诞a(chǎn)生。大于閾值的那些值設(shè)置成1，而小于閾值的那些值設(shè)置成0。這用作原始掩模。然后產(chǎn)生兩個下一代掩模，一個是通過腐蝕原始掩模產(chǎn)生，另一個是通過膨脹原始掩模和減掉原來的掩模以形成環(huán)狀掩模來產(chǎn)生。Texas Red輻射圖乘以被腐蝕的二值掩模，和這些像素總和起來作為該細(xì)胞核中被標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子的量度。類似地，Texas Red輻射圖乘以環(huán)狀掩模，和這些像素總和起來作為在該細(xì)胞質(zhì)中被標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄因子的量度?；罨潭仁褂眉?xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)的強度比來評估。
蕈毒堿受體和電壓門控通道刺激的瞬時鈣成象圖19和20的細(xì)胞是來源于成神經(jīng)細(xì)胞瘤系。它們在標(biāo)準(zhǔn)介質(zhì)內(nèi)生長并成像。這些細(xì)胞表達可以被碳酰膽堿刺激，產(chǎn)生作為第二信使的大的細(xì)胞內(nèi)鈣離子釋放的蕈毒堿乙酰膽堿受體。另外，這些細(xì)胞表達電壓門控的“L”鈣通道，它被細(xì)胞外K+濃度較大變化導(dǎo)致的細(xì)胞膜去極化刺激，受異搏定抑制。
一般來說，通過快速加入100μL生長液試劑到96孔板中100μL生長液中的細(xì)胞可促發(fā)圖像序列。由加入該體積液體導(dǎo)致的攪動引起細(xì)胞形狀小的變形。這個變形作為一個分布在每個細(xì)胞上的鈣熒光瞬時變化在加入后的第一圖像幀是可見的。
在圖19顯示了在幀之間1.2秒的電影。圖像序列由快速加入100μM碳酰膽堿促發(fā)。最后一幅圖像是二元掩模，用來識別和列舉圖像中的熒光物品，它是從注射前幀中產(chǎn)生的。盡管注射前圖像顯得很模糊，但它卻很明亮。該掩模被用在序列中的每一幅圖像、每一個物品，整合的強度被標(biāo)準(zhǔn)化成注射前圖像，被繪制成相對于時間的表，如圖25a所示。掩膜并不被處理成覆蓋整個細(xì)胞。例如，物品1可能多于一個細(xì)胞，但顯示無反應(yīng)。物品7可能是2個覆蓋的細(xì)胞，顯示一次延遲反應(yīng)。
圖20a-h是從一個電影中挑選出來的幀，顯示通過加入50mM KCl引起電壓門控“L”通道開放促發(fā)去極化事件的成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞的反應(yīng)。分析程序如聯(lián)系圖25a已在上面描述。結(jié)果顯示在圖25b。注意靈敏度的增加的獲得是使用“細(xì)胞平均”而不是“圖像平均”。
活細(xì)胞G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合圖21a-c到22a-c顯示的圖像是從96孔板中的活細(xì)胞獲得的。這些細(xì)胞已經(jīng)用G蛋白偶聯(lián)受體轉(zhuǎn)染，它的天然肽配體是已知的。成像之前，這些細(xì)胞用包含10％血清的標(biāo)準(zhǔn)生長液中天然未標(biāo)記配體孵育37℃，20分鐘，之后是20nM熒光標(biāo)記配體和100nM LDS751反應(yīng)20分鐘，也是37℃。樣本不用沖洗。
圖像是0.5×0.5mm2,1.08×1.08μm2g個像素。熒光輻射在488nm處被激發(fā)，由45nm的帶通濾波器，中心點在535nm處檢測。LDS751輻射也在488nm處被激發(fā)，由40nm的帶通濾波器，中心點在690nm處檢測。圖像獲取時間為0.9秒。這些細(xì)胞大約有～100,000個受體/細(xì)胞，或25個受體/m2膜表面。
圖21a是細(xì)胞在用標(biāo)記配體孵育后的圖像。在成像之前不執(zhí)行沖洗步驟。受體活性的實際變化是明顯的。一些細(xì)胞結(jié)合非常少的配體，它們的顯像在背景中被淹沒。如圖21b所示，通過從LDS751輻射的成像制成掩模、非特異核酸染色，則逐個細(xì)胞的結(jié)合活性的分析變得很容易。該染色并非完全均一，但是細(xì)胞體積的大部分都被顯現(xiàn)出來。從圖21b的數(shù)據(jù)閾值和受體結(jié)合圖像產(chǎn)生的圖21c的二元掩模的覆蓋產(chǎn)生一個受體活性的偽色圖。高活性顯示為黃色，低活性顯示為橙紅色。
圖22顯示了三個圖像對應(yīng)的20nM標(biāo)記配體與未標(biāo)記配體的滴定曲線上的點。該曲線顯示在圖22。未標(biāo)記配體用AKi=3±1×1010M公式計算。
圖23a-d顯示了受體結(jié)合到不同哺乳類動物細(xì)胞系上的圖像。圖23a是用256nM Cy3標(biāo)記配體孵育的細(xì)胞的圖像。結(jié)合活性的范圍是可見的。圖23b顯示Cy3數(shù)據(jù)與同步獲得的1μM Hoechat 33342染色細(xì)胞核的圖像的疊加。后者可作為單個細(xì)胞的可靠的標(biāo)示。圖23c是用存在10μM未標(biāo)記配體的256nM Cy3標(biāo)記配體孵育的細(xì)胞的圖像，圖23d是顯示這個數(shù)據(jù)與1μM Hoechat 33342染色細(xì)胞核的圖像的疊加。在圖23c中用未標(biāo)記細(xì)胞置換的液體的效果是很明顯的。在圖23c和d之間的高相關(guān)性顯示了用它們的排除的體積識別細(xì)胞的有效性。
模擬基于硅珠的受體結(jié)合圖24a-d呈現(xiàn)了Cy5標(biāo)記的硅珠的圖像。該試驗是模擬受體結(jié)合分析，其中的熒光標(biāo)記配體結(jié)合到由微滴支撐的膜限定受體上。
硅微滴，直徑4μm，包被有聚氮丙烷和生物素NHS酯的生物素。硅珠的活性用熒光計通過量化從液體中除去的通過吸收已知量的硅珠的Cy5標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素來分析。每個硅珠被發(fā)現(xiàn)包含有1.3×106的抗生蛋白鏈菌素分子。通過將適當(dāng)比例的Cy5標(biāo)記和未標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素預(yù)先混勻并和硅珠一起孵育，使硅珠包被上已知量的Cy5分子。硅珠的荷載等于0.16,1.6和16 fmole/200μg聚氮丙烷硅珠。每個硅珠分別有平均17、170和1700個標(biāo)記。樣本被放入Costar 96孔板中成像。Cy5用647nm激光激發(fā)，發(fā)射的熒光用中心在690nm的40nm帶寬過濾器檢測。掃描圖像在1μm像素，大約0.7秒時間獲得。
荷載有170和1700分子的硅珠很容易被檢測到，17-fluro硅珠在構(gòu)成圖24的圖像中是可以辨認(rèn)的。那些僅僅荷載有未標(biāo)記的抗生蛋白鏈菌素的硅珠不能產(chǎn)生可見的強度。
權(quán)利要求
1．一個共焦成像系統(tǒng)，包括a)一個用于形成電磁輻射的細(xì)長束斑的部件，該光束沿輻射傳播的光軸橫向延伸；b)一個共焦成像系統(tǒng)，用于導(dǎo)引到該細(xì)長束斑到物品所在的第一平面的第一細(xì)長區(qū)上，并用于將該物品發(fā)射的電磁輻射導(dǎo)引到第二平面的第二細(xì)長區(qū)上；c)在該第二平面內(nèi)，或在與該第二平面共軛的第三平面內(nèi)的一個檢測裝置，它具有一個由檢測器元件組成的矩形陣列，在該陣列上電磁輻射是一致的；以及d)相對于該物品掃描細(xì)長束斑，使得在這些檢測器元件上，從被掃描的物品中產(chǎn)生電磁輻射，用檢測裝置將所述電磁輻射同步于所述的掃描轉(zhuǎn)換成代表電磁輻射的電信號。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的共焦成像系統(tǒng)，還包括在第二平面內(nèi)的一個細(xì)長空間過濾器，它具有一個與其中第二細(xì)長的區(qū)是一致的長軸。
3．根據(jù)權(quán)利要求2的共焦成像系統(tǒng)，其中所述空間過濾器具有可變的寬度。
4．根據(jù)權(quán)利要求1的共焦成像系統(tǒng)，其中檢測裝置包括由緊密擺放的多個檢測器元件組成的mxn陣列，其中m是該陣列中的第一維中的檢測器元件數(shù)目，n是該陣列中的第二維中的檢測器元件數(shù)目，并且n遠(yuǎn)大于m。
5．根據(jù)權(quán)利要求4的共焦成像系統(tǒng)，其中第二細(xì)長區(qū)具有一條長軸，檢測裝置放置在第二細(xì)長區(qū)，使得該長軸在與第二維同樣的方向上延伸。
6．根據(jù)權(quán)利要求4的共焦成像系統(tǒng)，其中在該陣列的第一維中延伸的各個列內(nèi)的至少某些檢測元件被集合在一起。
7．根據(jù)權(quán)利要求4的共焦成像系統(tǒng)，其中在該陣列的多個檢測元件被集合在一起。
8．根據(jù)權(quán)利要求4的共焦成像系統(tǒng)，其中檢測裝置是CCD陣列。
9．根據(jù)權(quán)利要求1的共焦成像系統(tǒng)，其中檢測裝置是矩形排列的CCD陣列。
10．根據(jù)權(quán)利要求1的共焦成像系統(tǒng)，其中從物品發(fā)射的輻射是熒光射線。
全文摘要
一個使用細(xì)長束斑的共焦成像系統(tǒng)。特別的實施例用于說明有電荷耦合器件(CCD)的儀器和用于觀察物品的熒光的儀器。
文檔編號G01N21/64GK1301357SQ99806221
公開日2001年6月27日 申請日期1999年3月16日 優(yōu)先權(quán)日1998年3月16日
發(fā)明者J·K·特勞特曼, T·D·哈里斯, R·L·漢森, W·卡斯, N·A·尼克勞斯 申請人:普雷勒克斯公司