薄層石墨烯熒光猝滅結(jié)合納米金屬陣列進(jìn)行單分子熒光觀測(cè)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物物理單分子觀測(cè)表面處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種單分子熒光觀測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單分子實(shí)驗(yàn)是目前生物應(yīng)用方面?zhèn)涫懿毮康挠^測(cè)技術(shù)，例如利用熒光染料或熒光蛋白標(biāo)記并觀測(cè)單個(gè)目標(biāo)分子等方法，可以得到過(guò)去在多分子實(shí)驗(yàn)中被平均化而煙沒(méi)的信息。但是，目前為止要在玻璃為襯底的納米結(jié)構(gòu)陣列上實(shí)現(xiàn)透射型單分子觀測(cè)遇到了很大的問(wèn)題。通常來(lái)說(shuō)，要進(jìn)行納米結(jié)構(gòu)陣列上的透射型單分子熒光觀測(cè)，需要具備以下條件:I)襯底透明，不會(huì)過(guò)多損耗激勵(lì)光及熒光信號(hào)，從而完成透射型觀測(cè)；2)需要對(duì)表面進(jìn)行處理從而避免熒光分子非特異性結(jié)合在除目標(biāo)位置(納米結(jié)構(gòu)陣列)外的其他區(qū)域，影響單分子熒光觀測(cè)；3)對(duì)表面不同區(qū)域的處理操作不會(huì)相互干擾(例如為增加特異性結(jié)合效率而對(duì)目標(biāo)位置進(jìn)行的表面處理不會(huì)破壞其他區(qū)域的已有結(jié)構(gòu))。
[0003]為滿(mǎn)足第一條要求，通常選用玻璃作為襯底進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，相應(yīng)的為了防止非特異性的熒光分子的結(jié)合，通常使用修飾后的聚乙二醇等聚合物，通過(guò)自組裝的方式在玻璃表面形成可防止熒光分子結(jié)合的薄膜。但這樣的方式也面臨著一些問(wèn)題:1.首先聚合物分子成膜的條件較為苛刻，環(huán)境PH值、溫度、濃度等因素都會(huì)影響其成膜的質(zhì)量，從而影響其阻止結(jié)合的功能；2.其次，在進(jìn)一步加工制作納米結(jié)構(gòu)陣列時(shí)，對(duì)于陣列表面的處理通常因?yàn)榫酆衔锉∧ひ妆黄茐亩y以實(shí)現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種高效率的單分子熒光觀測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明提出的單分子熒光觀測(cè)方法，使用薄層石墨烯為襯底，結(jié)合納米金屬陣列，在猝滅非特異性結(jié)合的熒光分子的同時(shí)可不影響對(duì)納米金屬的再修飾，從而進(jìn)行高效率的單分子熒光觀測(cè)。具體步驟為:
Cl)單分子熒光觀測(cè)區(qū)域表面的處理:
Ca)選用玻璃薄片(一般玻片厚度約為0.15-0.20mm),用濃硫酸及雙氧水混合物(一般兩者重量比為2:1至4:1)對(duì)其進(jìn)行表面清洗；
(b)用高純氮?dú)獯蹈刹ＡП∑?，然后使用透明膠帶將石墨烯轉(zhuǎn)移至玻片表面，轉(zhuǎn)移的石墨烯在玻片表面有一部分為薄層(其厚度小于3層原子層)；
(2)在上述石墨烯襯底上制備納米金屬有序陣列:
(a)在上述玻片表面，用旋涂法涂覆膠層PMMA (即聚甲基丙烯酸甲酯)，于光學(xué)顯微鏡下在膠層上劃出薄層石墨烯的位置，用電子束法蒸鍍鋁膜(膜厚為5-10nm)，然后在薄層石墨烯位置處進(jìn)行電子束曝光(EBL )，寫(xiě)出設(shè)計(jì)的納米結(jié)構(gòu)陣列； (b)用化學(xué)溶液浸泡經(jīng)上述處理的物品，去掉鋁膜，所用化學(xué)溶液為3038正膠顯影液和去離子水的混合液，3038正膠顯影液與去離子水的重量比為1:3到1:5 ;
(c)用顯影液顯去PMMA:顯影液預(yù)冷至0-4°C，低溫顯影約30-40min，所用顯影液為MIBK和IPA的混合液，混合液中，MIBK和IPA的重量比為1:2到1:4 ;
(d)用電子束法蒸鍍一金屬層(具體材料取決于實(shí)驗(yàn)選用的熒光物質(zhì)及使用方法，一般為金或銀)，用以隔開(kāi)熒光分子和石墨烯，該金屬層厚度為15-20nm，優(yōu)選為約18nm ;再用丙酮浸泡，超聲除去多余的金屬膜及PMMA ；
Ce)電鏡下拍照，確定陣列完整性等情況。
[0006]薄層石墨烯可猝滅表面一定區(qū)域內(nèi)的熒光分子且本身較透明，不會(huì)損耗過(guò)多的激勵(lì)光和熒光信號(hào)。熒光分子可正常結(jié)合在石墨烯襯底上的納米金屬陣列上，且因不在石墨烯猝滅范圍內(nèi)而正常發(fā)出熒光。通過(guò)控制熒光分子濃度及結(jié)合條件即可實(shí)現(xiàn)單分子熒光觀測(cè)，具體的觀測(cè)實(shí)施方式如圖4所示。
[0007]實(shí)驗(yàn)表明，石墨烯厚度小于3層且金屬層厚度大于等于18nm時(shí)，納米結(jié)構(gòu)上吸附的熒光分子不會(huì)被石墨烯猝滅，可以正常進(jìn)行單分子觀測(cè)。觀測(cè)方式如圖4所示。
【附圖說(shuō)明】
[0008]圖1為石墨烯的形貌圖。其中，左圖為明場(chǎng)下單層石墨烯的形貌圖(圖中箭頭標(biāo)示的部分有單層石墨烯覆蓋)，右圖為T(mén)IRF下觀察的圖像。
[0009]圖2所示為T(mén)IRF下的觀察結(jié)果。其中，a及b中箭頭指示的為石墨烯碎片，c為IFP1.4同樣濃度下玻璃表面/ (3nm Cr + 15nm Au)表面/ (石墨稀碎片+3nm Cr + 15nmAu)表面分別的熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)值，d圖每一組柱狀圖(相鄰的條紋柱形和全填充柱形)為同一位置的石墨烯碎片處及附近僅金層處的熒光強(qiáng)度平均值，每一組的石墨烯厚度存在差升。
[0010]圖3為薄層石墨烯表面制備完成的納米金結(jié)構(gòu)陣列圖示。其中，a為約40倍放大下微納制作完成后的陣列位置明場(chǎng)示意圖，圖中方形框框出的部分即為納米陣列所在位置，b圖為a圖中圓圈圈定區(qū)域在SEM下的放大圖像，c圖及d圖分別為SEM下分辨率為Ium及200nm的放大圖像。
[0011]圖4為單分子觀測(cè)方式圖示。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0013]實(shí)施例1:石墨烯對(duì)熒光的猝滅
1、首先通過(guò)化學(xué)氣相沉積方法轉(zhuǎn)移單層石墨烯至清潔后的玻璃玻片表面，石墨烯覆蓋面積約為Icm2;
2、在石墨烯表面加熒光蛋白溶液(此處使用的是IFP1.4熒光蛋白，濃度約400nM)，沖洗掉多余的熒光蛋白后在全內(nèi)反射熒光顯微鏡(TIRF)下觀察。
[0014]如圖1所示，左圖為明場(chǎng)下單層石墨烯的形貌圖(圖中紅色箭頭標(biāo)示的部分有單層石墨烯覆蓋)，右圖為T(mén)IRF下觀察的圖像。從右圖可以看出，有單層石墨烯覆蓋的地方?jīng)]有明顯熒光信號(hào)，說(shuō)明直接粘附在石墨烯上的熒光分子被猝滅，無(wú)法發(fā)出熒光。
[0015]實(shí)施例2:石墨烯厚度對(duì)熒光猝滅的影響
1、首先通過(guò)透明膠帶將石墨烯轉(zhuǎn)移到清洗過(guò)后的玻片上；
2、在步驟I處理后的玻片上蒸鍍3nmCr + 15nm Au，用以隔開(kāi)焚光分子和石墨?。?br> 3、在玻片上加IFP1.4的溶液(濃度約400nM)，一段時(shí)間后沖洗去多余的熒光分子，在TIRF下觀測(cè)有石墨烯碎片的區(qū)域。
[0016]圖2所示為T(mén)IRF下的觀察結(jié)果，a及b圖中紅色箭頭指示的為石墨烯碎片，可見(jiàn)這一薄層碎片覆蓋的區(qū)域仍能明顯觀察到IFP1.4的熒光信號(hào)，說(shuō)明薄層石墨烯并不影響熒光觀察。c圖為IFP1.4同樣濃度下玻璃表面/ (3nm Cr + 15nm Au)表面/ (石墨烯碎片+3nm Cr + 15nm Au)表面分別的焚光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)值，可以看出不同厚度的石墨稀碎片上的熒光強(qiáng)度的平均值確實(shí)低于僅有鉻金層玻片的對(duì)照組，但從后面的d圖(每一組黑色及紅色柱狀圖為同一位置的石墨烯碎片處及附近僅金層處的熒光強(qiáng)度平均值，每一組的石墨烯厚度存在差異)可以看出，不同厚度的石墨烯碎片對(duì)于熒光物質(zhì)的猝滅范圍不同，石墨烯越厚能夠猝滅熒光的范圍越大，相應(yīng)觀測(cè)到的熒光強(qiáng)度越小。而薄層石墨烯能夠猝滅的范圍較小，從而觀測(cè)到的熒光強(qiáng)度較大(如d圖藍(lán)色框出的一組石墨烯薄層即對(duì)應(yīng)于a及b圖所示的石墨稀薄層)。
[0017]實(shí)施例3:在石墨烯薄層上制備納米金結(jié)構(gòu)陣列，以用于單分子熒光觀測(cè)實(shí)驗(yàn)
1、首先選用玻璃薄片(厚度僅約0.17_)，用濃硫酸及雙氧水混合物(7:3)進(jìn)行表面清洗；
2、高純氮?dú)獯蹈珊?，使用透明膠帶將石墨烯轉(zhuǎn)移至玻片表面，轉(zhuǎn)移的石墨烯在玻片表面有一部分為薄層(小于3層厚度)；
3、在玻片表面旋轉(zhuǎn)涂膠(PMMA)，光學(xué)顯微鏡下在膠層上劃出薄層石墨烯的位置，電子束蒸鍍鋁膜(約7nm)后在薄層石墨烯位置處進(jìn)行電子束曝光(EBL)寫(xiě)出設(shè)計(jì)的納米結(jié)構(gòu)陣列；
4、在化學(xué)溶液中浸泡去掉鋁膜，化學(xué)溶液為3038正膠顯影液:去離子水=1:4
5、在顯影液中顯去PMMA，顯影液需預(yù)冷至O°C，低溫顯影約30-40min，顯影液為MIBK:1PA=1:3;
6、電子束蒸鍍3nmCr + 15nm Au，丙酮浸泡超聲除去多余的PMMA ;
7、電鏡下拍照確定陣列完整性等情況。
[0018]圖3所示即為薄層石墨烯表面制備完成的納米金結(jié)構(gòu)陣列。b圖為a圖中圈定區(qū)域在SEM下的放大圖像，c圖及d圖分別是SEM下分辨率為Ium及200nm的放大圖像。結(jié)果表明在石墨烯上可以完整制備出百納米量級(jí)的結(jié)構(gòu)陣列。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種薄層石墨烯熒光猝滅結(jié)合納米金屬陣列進(jìn)行單分子熒光觀測(cè)的方法，其特征在于:使用薄層石墨烯為襯底，結(jié)合納米金屬陣列，在猝滅非特異性結(jié)合的熒光分子的同時(shí)可不影響對(duì)納米金屬的再修飾，從而進(jìn)行高效率的單分子熒光觀測(cè)；具體步驟為: (1)單分子熒光觀測(cè)區(qū)域表面的處理: Ca)選用玻璃薄片，用濃硫酸及雙氧水混合物對(duì)其進(jìn)行表面清洗； (b)用高純氮?dú)獯蹈刹ＡП∑缓笫褂猛该髂z帶將石墨烯轉(zhuǎn)移至玻片表面，轉(zhuǎn)移的石墨烯在玻片表面有一部分為薄層，其厚度小于3原子層； (2)在上述石墨烯襯底上制備納米金屬有序陣列: (a)在上述玻片表面，用旋涂法涂覆膠層PMMA，于光學(xué)顯微鏡下在膠層上劃出薄層石墨烯的位置，用電子束法蒸鍍鋁膜，然后在薄層石墨烯位置處進(jìn)行電子束曝光，寫(xiě)出設(shè)計(jì)的納米結(jié)構(gòu)陣列； (b)用化學(xué)溶液浸泡經(jīng)上述處理的物品，去掉鋁膜，所用化學(xué)溶液為3038正膠顯影液和去離子水的混合液，3038正膠顯影液與去離子水的重量比為1:3到1:5 ; (c)用顯影液顯去PMMA:顯影液預(yù)冷至0-4°C，低溫顯影30-40min，所用顯影液為MIBK和IPA的混合液，混合液中，MIBK和IPA的重量比為1:2到1:4 ； Cd)用電子束法蒸鍍一金屬層，該金屬層厚度為15-20nm ;再用丙酮浸泡，超聲除去多余的金屬膜及PMMA ； Ce)電鏡下拍照，確定陣列完整性情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述金屬層材料為金或銀。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物物理單分子觀測(cè)表面處理技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種薄層石墨烯熒光猝滅結(jié)合納米金屬陣列進(jìn)行單分子熒光觀測(cè)的方法。本發(fā)明具體步驟包括：?jiǎn)畏肿訜晒庥^測(cè)區(qū)域表面的處理；在上述石墨烯襯底上制備納米金屬有序陣列。本發(fā)明利用薄層石墨烯可猝滅其表面一定區(qū)域內(nèi)的熒光分子，同時(shí)擁有良好的透過(guò)性，使得激勵(lì)光和熒光信號(hào)的損耗較小的性質(zhì)；在薄層石墨烯上的金屬納米結(jié)構(gòu)可正常結(jié)合熒光分子，而金屬層縱向上拉開(kāi)了熒光分子和石墨烯的距離，使得熒光分子不在石墨烯猝滅范圍內(nèi)而能夠正常發(fā)出熒光。通過(guò)控制熒光分子濃度及結(jié)合條件即可實(shí)現(xiàn)單分子熒光觀測(cè)。
【IPC分類(lèi)】G01N21-64
【公開(kāi)號(hào)】CN104568876
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410813396
【發(fā)明人】趙文琦, 劉帆, 田筱超然, 邱孟, 周磊, 譚硯文, 張遠(yuǎn)波
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年4月29日
【申請(qǐng)日】2014年12月24日