異羥肟酸取代的氮雜吲哚啉-花菁染料和它的生物共軛物的制作方法
【專利說明】異羥肟酸取代的氮雜吲哚啉-花菁染料和它的生物共軛物
[0001] 相關(guān)申請的引用
[0002] 根據(jù)35U.S.C. § 119(e)，本申請案要求2012年10月24日提交的美國臨時專利 申請序列號61/717, 983的提交日期的優(yōu)先權(quán)；將該申請案的披露通過引用結(jié)合于此。
[0003] 引言
[0004] 對于多種應(yīng)用（包括組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)、和免疫學(xué)應(yīng)用）中的生物檢測而言，熒光探 針是有用的工具。確切地，在通過流式細(xì)胞術(shù)、熒光活化細(xì)胞分選法和熒光顯微鏡檢術(shù)在細(xì) 胞混合物中鑒定和分離細(xì)胞的亞群方面；在熒光免疫分析中確定結(jié)合部分（例如抗原-抗 體結(jié)合）的濃度方面；在通過染色在凝膠或其他支持物中定位物質(zhì)方面，熒光探針發(fā)現(xiàn)了 功用。熒光化合物可以被共價地或非共價地附接至其他材料以賦予熒光。明亮的熒光染料 允許以大的敏感性檢測或定位附接的材料。
[0005] 當(dāng)采用用于以上目的的熒光染料時，對于熒光染料的選擇存在很多注意事項。一 個注意事項是熒光染料的吸收和發(fā)射特征，因為在測試下的樣品（例如血液、尿、腦脊液） 中的很多配體、受體、和材料將發(fā)出熒光并且干擾熒光標(biāo)簽的熒光的準(zhǔn)確測定。這一現(xiàn)象稱 為自發(fā)熒光或背景熒光。另一注意事項是熒光染料共軛至配體和受體以及其他生物的和非 生物的材料的能力，以及此類共軛對分子特性的潛在作用，例如熒光染料的熒光量子效率 方面的變化。還可能的是，與熒光染料共軛將滅活標(biāo)記的分子的功能。第三個注意事項是 針對敏感的檢測，熒光染料的量子效率應(yīng)該是高的。第四個注意事項是熒光染料的光吸收 能力、或消光系數(shù)還應(yīng)該盡可能地大。還感興趣的是，當(dāng)極為貼近時，無論熒光分子是否將 彼此相互作用，這將導(dǎo)致自淬滅。第五個注意事項是標(biāo)記染料的光穩(wěn)定性，這是由于為了最 佳檢測，染料共軛物通常經(jīng)受反復(fù)照射。一個另外注意事項是無論通過自身或共軛與熒光 染料共軛的化合物，是否存在熒光染料與其他化合物或容器壁的非特異性結(jié)合。
[0006] 因此，具有一個或多個特性（例如高量子效率、良好的光穩(wěn)定性、在更長波長的吸 收和發(fā)射、更高共軛產(chǎn)率、低非特異性干擾、低淬滅和低自聚集）的熒光染料和共軛物是感 興趣的。
[0007] 概述
[0008] 提供了異羥肟酸取代的氮雜吲哚啉-花菁染料、其生物共軛物和使用它的方法。 主題染料包括具有氮雜吲哚啉環(huán)的花菁染料結(jié)構(gòu)，其中吡啶鎗部分被并入吲哚啉環(huán)結(jié)構(gòu)以 形成氮雜吲哚啉環(huán)，并且異羥肟酸部分作為一個取代基被附接至氮雜吲哚啉環(huán)。在一些情 況下，異羥肟酸部分在氮雜吲哚啉環(huán)的位置5被并入。該染料進(jìn)一步包括在多個位置中的 一個或多個處的反應(yīng)基部分（RGM)。
[0009] 本發(fā)明的方面包括反應(yīng)性異羥肟酸取代的氮雜吲哚啉-花菁染料和它們的共軛 物，其中主題染料被共軛至感興趣的底物。在一些情況下，底物包括特異性結(jié)合至感興趣的 分析物的結(jié)合部分。在某些情況下，染料共軛物是串聯(lián)共軛物，其中染料被共軛至熒光蛋 白。該染料會能夠進(jìn)行使用共軛的熒光蛋白的FRET。染料熒光蛋白共軛物可以被進(jìn)一步共 軛至特異性結(jié)合感興趣的分析物的結(jié)合部分。
[0010] 提供了檢測樣品中的分析物的方法。該方法的方面包括使樣品與檢測試劑接觸。 在一些情況下，檢測劑是染料共軛物，該染料共軛物包括特異性地結(jié)合分析物的特異性結(jié) 合部分。在一些情況下，檢測劑是共軛至分析物的反應(yīng)性染料。該方法的方面進(jìn)一步包括 用熒光檢測分析物。在定位或檢測樣品中的分析物或配體的相互作用或存在方面，染料化 合物和染料共軛物找到了用途。還提供的是組合物，例如試劑盒等，將這樣的染料或染料共 軛物并入有助于它們在此類方法中的應(yīng)用。
[0011] 附圖簡要說明
[0012] 圖1示出了在PBS緩沖液（pH= 7.4)中，化合物26(右）和Cy5(左）的吸收光 譜。與Cy5相比，化合物26的最大吸收波長紅移了約63nm。
[0013] 圖2示出了在PBS緩沖液（pH= 7.4,在630nm激發(fā)）中，化合物26(右）和 Cy5(左）的熒光光譜。與Cy5相比，化合物26的最大熒光波長紅移了約66nm。
[0014] 圖3說明了在PBS緩沖液（pH= 7. 4)中，化合物12、48和55與AlexaFluor? 700NHS酯的光穩(wěn)定性比較（實例43)。
[0015] 圖4說明了在PBS緩沖液（pH=7. 4)中，APC化合物12、48、50、53和54串聯(lián)物 與APC-AlexaFluor?700串聯(lián)物的光穩(wěn)定性比較（實例43)。
[0016] 圖5示出了包括附接至異羥肟酸的接頭反應(yīng)基部分（L-RGM)的異羥肟酸取代的氮 雜吲哚啉-花菁染料的合成方案。
[0017] 圖6示出了包括L-RGM取代的吲哚啉環(huán)的異羥肟酸取代的氮雜吲哚啉-花菁的合 成。
[0018] 圖7示出了包括分別位于異羥肟酸和吲哚啉部分的兩個L-RGM基團(tuán)的異羥肟酸取 代的氮雜吲哚啉-花菁的合成。
[0019] 圖8示出了與CD8-AlexaFluor.?700共軛物相比，使用CD8抗體分別與化合物12 和48的染料-抗體共軛物所獲得的免疫染色數(shù)據(jù)。
[0020] 圖9示出了與APC-H7相比，使用⑶20抗體與化合物12的染料-抗體共軛物所獲 得的免疫染色數(shù)據(jù)。
[0021] 圖10示出了與APC-Cy5. 5和APC-AlexaF!u〇r?700相比，使用標(biāo)記有APC化合 物12的CD8抗體的串聯(lián)染料-抗體共軛物所獲得的免疫染色數(shù)據(jù)。
[0022] 圖11示出了與⑶19抗體標(biāo)記的AlexaFluor?相比，使用標(biāo)記有APC化合物12 串聯(lián)物的CD19抗體的染料-抗體共軛物所獲得的免疫染色數(shù)據(jù)。
[0023] 圖12示出了化合物12 (R700)串聯(lián)物和直接的CD8共軛物對比APC和APC-H7共 軛物的亮度比較。與R700直接共軛物和傳統(tǒng)染料共軛物二者相比，APC-R700串聯(lián)共軛物 要更加明亮。
[0024] 圖13示出與Alexa700染料相比，化合物12 (R700)的串聯(lián)共軛物具有更少％溢 出進(jìn)入APC和APC-Cy7、以及PerCP-Cy5. 5共軛物。
[0025] 定義
[0026] 以下術(shù)語具有以下意義，除非另外指明。任何未定義的術(shù)語都具有它們的本領(lǐng)域 公認(rèn)的意義。
[0027] "烷基"是指具有從1至10個碳原子并且例如是1至6個碳原子、或1至5、或1 至4、或1至3個碳原子的一價飽和脂肪族烴基。通過舉例，這一術(shù)語包括直鏈的和支鏈的 烴基，例如甲基（CH3-)、乙基（CH3CH2-)、正丙基（CH3CH2CH2-)、異丙基（(CH3) 2CH-)、正丁基 (CH3CH2CH2CH2-)S((CH3)2CHCH2-)S((CH3) (CH3CH2)CH-)S((CH3) 3C-)>iE 戊基（CH3CH2CH2CH2CH2-)、和新戊基（(CH3)3CCH2-)。
[0028] 術(shù)語"取代的烷基"是指如在此定義的烷基，其中烷基鏈中的一個或多個碳原子已 經(jīng)任選地被以下取代：雜原子（例如-〇-、-N-、-S-)，-S(0)n-(其中n是0至2)，-NR-(其 中R是氫或烷基），并且具有從1至5個選自下組的取代基，該組由以下各項組成：烷氧基、 取代的烷氧基，環(huán)烷基，取代的環(huán)烷基，環(huán)烯基，取代的環(huán)烯基，?；?，酰氨基，酰氧基，氨基， 氨?；?，氨基酰氧基，氧氨基?；?，疊氮基，氰基，鹵素，羥基，氧代，硫酮（thioketo)，羧基， 竣烷基，硫代芳氧基，硫代雜芳氧基，硫代雜環(huán)氧基，硫醇，硫代烷氧基，取代的硫代烷氧基， 芳基，芳氧基，雜芳基，雜芳基氧基，雜環(huán)基，雜環(huán)氧基，羥氨基，烷氧基氨基，硝基，-so-烷 基，-so-芳基，-so-雜芳基，-SO2-烷基，-SO2-芳基，-SO2-雜芳基，以及-NRaRb,其中R'和 R"可以是相同的或不同的并且選自氫，任選取代的烷基，環(huán)烷基，烯基，環(huán)烯基，炔基，芳基， 雜芳基和雜環(huán)。
[0029] "亞烷基"是指二價脂肪族烴基，該烴基具有直鏈的或支鏈的優(yōu)選從1至6個 并且更優(yōu)選1至3個碳原子，并且該烴基任選地被選自以下項的一個或多個基團(tuán)中 斷：-0-、-NR1(I-、-NRltlC(0)-、-C(O)NRltl-等。通過舉例，這一術(shù)語包括亞甲基（-CH2-)、亞 乙基（-CH2CH2-)、正亞丙基（-CH2CH2CH2-)、異亞丙基（-CH2CH(CH3)-)、（(-C(CH3) 2CH2CH2-)、 (-C(CH3) 2CH2C(0)-)、（-C(CH3) 2CH2C(0)NH-)、（-CH(CH3)CH2-)、等。
[0030] "取代的亞烷基"是指如在以下"取代的"定義中對碳所做描述，具有I至3個氫被 取代基取代的亞烷基。
[0031] 如在此定義，術(shù)語"烷烴"是指烷基和亞烷基。
[0032] 術(shù)語"烷基氨基烷基"、"烷基氨基烯基"和"烷基氨基炔基"是指基團(tuán)R'NHR"一 其中R'是如在此定義的烷基并且R"是如在此定義的亞烷基、亞烯基或亞炔基。
[0033] 術(shù)語"烷芳基"或"芳烷基"是指基團(tuán)-亞烷基-芳基和-取代的亞烷基-芳基， 其中在此定義了亞烷基、取代的亞烷基和芳基。
[0034] "烷氧基"是指基團(tuán)-0-烷基，其中烷基如在此定義。通過舉例，烷氧基包括甲氧 基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、等。術(shù)語"燒氧 基"還指基團(tuán)烯基 _〇_、環(huán)烷基_〇_、環(huán)烯基_〇 _、和炔基_〇_，其中烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基、和塊 基如在此定義。
[0035] 術(shù)語"取代的烷氧基"是指基團(tuán)取代的烷基-0-、取代的烯基-0-、取代的環(huán)烷 基-〇-、取代的環(huán)烯基-〇-、和取代的炔基-〇-，其中取代的烷基，取代的烯基，取代的環(huán)烷 基，取代的環(huán)烯基和取代的炔基如在此定義。
[0036] 如在此定義，術(shù)語"烷氧基氨基"是指基團(tuán)-NH-烷氧基，其中在此定義了烷氧基。
[0037] 術(shù)語"鹵代烷氧基"是指基團(tuán)烷基-0_，其中烷基上的一個或多個氫原子已經(jīng)被鹵 素基團(tuán)取代，并且通過舉例，包括基團(tuán)，例如三氟甲氧基等。
[0038] 術(shù)語"鹵烷基"是指如以上所述的取代的烷基，其中烷基上的一個或多個氫原子已 經(jīng)被鹵素基團(tuán)取代。此類基團(tuán)的實例包括但不局限于氟烷基，例如三氟甲基、二氟甲基、三 氣乙基等。
[0039] 術(shù)語"烷基烷氧基"是指基團(tuán)-亞烷基_〇_烷基、亞烷基 _〇_取代的烷基、取代的 亞烷基-o-烷基、和取代的亞烷基-o-取代的烷基，其中烷基、取代的烷基、亞烷基和取代的 亞烷基如在此定義。
[0040] 術(shù)語"烷基硫代烷氧基"是指基團(tuán)_亞烷基_S_烷基、亞烷基-S-取代的烷基、取 代的亞烷基-S-烷基、和取代的亞烷基-S-取代的烷基，其中烷基、取代的烷基、亞烷基和取 代的亞烷基如在此定義。
[0041] "烯基"是指直鏈的或支鏈的烴基，該烴基具有從2至6個碳原子并且優(yōu)選是2至 4個碳原子，并且具有至少1個并且優(yōu)選是從1至2個位點的雙鍵不飽和度。通過舉例，這 一術(shù)語包括二_乙烯基、烯丙基、以及丁 -3-烯-1-基。包括在這一術(shù)語內(nèi)的是順反異構(gòu)體 或這些異構(gòu)體的混合物。
[0042] 術(shù)語"取代的烯基"是指具有選自以下項的從1至5個取代基、或從1至3個取代 基的如在此定義的烯基：烷氧基、取代的烷氧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán) 烯基、?；Ⅴ０被?、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基?；?、疊氮基、 氛基、鹵素、羥基、氧代、硫麗（thioketo)、竣基、竣烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜 環(huán)氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環(huán)基、 雜環(huán)氧基、羥氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-so-芳基、-so-雜芳 基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、-SO2-芳基和-SO2-雜芳基。
[0043] "炔基"是指直鏈的或支鏈的一價烴基，該烴基具有從2至6個碳原子并且優(yōu)選是 2至3個碳原子，并且具有至少1個并且優(yōu)選是從1至2個位點的三鍵不飽和度。此類炔基 的實例包括乙炔基（-C=CH)、和炔丙基（-CH2C=CH)。
[0044] 術(shù)語"取代的炔基"是指具有選自以下項的從1至5個取代基、或從1至3個取代 基的如在此定義的炔基：烷氧基、取代的烷氧基、環(huán)烷基、取代的環(huán)烷基、環(huán)烯基、取代的環(huán) 烯基、?；?、酰氨基、酰氧基、氨基、取代的氨基、氨酰基、氨基酰氧基、氧氨基?；?、疊氮基、 氛基、鹵素、羥基、氧代、硫麗（thioketo)、竣基、竣烷基、硫代芳氧基、硫代雜芳氧基、硫代雜 環(huán)氧基、硫醇、硫代烷氧基、取代的硫代烷氧基、芳基、芳氧基、雜芳基、雜芳基氧基、雜環(huán)基、 雜環(huán)氧基、羥氨基、烷氧基氨基、硝基、-SO-烷基、-SO-取代的烷基、-so-芳基、-so-雜芳 基、-SO2-烷基、-SO2-取代的烷基、SO2-芳基和-SO2-雜芳基。
[0045] "炔氧基"是指基團(tuán)-0-炔基，其中炔基如在此定義。通過舉例，炔氧基包括乙炔 氧基、丙塊氧基、等。
[0046] "醜基"是指基團(tuán)H-C(O) _、烷基-C(O) _、取代的烷基-C(O) _、烯基-C(O) _、取代 的烯基_C(0) _、炔基-C(O) _、取代的炔基-C(O) _、環(huán)烷基-C(O) _、