一種番茄植株頂芽內(nèi)源激素含量的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及農(nóng)學(xué)中作物內(nèi)源激素技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于高效液相色譜法 (HPLC)測定番茄植株頂芽內(nèi)源激素含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 番前（Lycopersiconesculentum)是世界和中國主要設(shè)施作物之一，因其口味佳、 營養(yǎng)豐富而深受廣大消費(fèi)者的喜愛。我國設(shè)施番茄栽培面積及產(chǎn)量均居世界首位。目前關(guān) 于設(shè)施番茄的科學(xué)研宄，多集中在形態(tài)指標(biāo)、光合特性及干物質(zhì)分配等方面。通過分子機(jī)理 的研宄，深入認(rèn)識植物激素調(diào)控設(shè)施番茄生長、發(fā)育及其對環(huán)境適應(yīng)的機(jī)制，具有重要的科 學(xué)意義。
[0003] 植物激素（planthormone,PH)是指在植物體的某一部位合成，可轉(zhuǎn)移到其他部 位，并對植物的生長發(fā)育具有顯著調(diào)節(jié)作用的微量有機(jī)物，亦稱植物天然激素或內(nèi)源激素。 其特點是：（1)內(nèi)源性：植物自身合成；（2)能從合成部位運(yùn)往作用部位；（3)在極低濃度下 發(fā)揮作用：參與細(xì)胞分裂與伸長、組織與器官分化、開花與結(jié)實、成熟與衰老、休眠與萌發(fā)等 生理過程。生長素、赤霉素、細(xì)胞分裂素和脫落酸是植物體內(nèi)四種重要的生長激素；植物內(nèi) 源激素種類多，含量甚微，且易被破壞。
[0004] 目前關(guān)于番茄頂芽和葉片的內(nèi)源激素測定方法有間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA) (生吉萍等，2000 ;喬志霞，2004 ;阮英，2005 ;朱延姝和馮輝，2005 ;賀忠群等，2010)，高效液 相色譜法（HighPerformanceLiquidChromatography，簡稱HPLC)是一種區(qū)別于經(jīng)典液相 色譜，基于儀器方法的高效能分離手段，因其高速、高效、高靈敏度、高自動化的特點，廣泛 用于各個領(lǐng)域，也是目前用于番茄內(nèi)源激素測定的重要方法。目前關(guān)于利用高效液相色譜 法測定番茄頂芽的內(nèi)源激素的方法未見報道，本發(fā)明主要解決了在利用高效液相色譜法測 定番茄頂芽激素時，探索番茄頂芽樣品前處理方法、流動相的選擇和色譜條件，對成功利用 HPLC測定植物激素提供一種可靠快速方法。
[0005] 已有番茄頂芽內(nèi)源激素測定方法是間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)，其基本方法是 將已知的抗原或抗體吸附在固相載體（聚苯乙烯微量反應(yīng)板）表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體 反應(yīng)在固相表面進(jìn)行，用洗滌法將液相中的游離成分洗除。但需要購買酶聯(lián)免疫試劑盒，對 試驗條件高。高效液相色譜法測定快速、高效、高靈敏度、高自動化的特點，但對配制流動 相、設(shè)置色譜條件要求較高，目前沒有一種適合高效液相色譜法測定番茄頂芽內(nèi)源激素的 樣品前處理、流動相、設(shè)置色譜條件的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明提供一種適合高效液相色譜 法測定番茄頂芽內(nèi)源激素含量的樣品前處理、流動相及設(shè)置色譜條件的方法，具有測定快 速、高效、高靈敏度、高自動化的特點。
[0007] 技術(shù)方案：為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0008] -種番茄植株頂芽內(nèi)源激素含量的測定方法，包括以下步驟：
[0009] 1)供試番茄頂芽樣品前處理；2)配制流動相、設(shè)置色譜條件；3)標(biāo)準(zhǔn)液的制備； 4)專屬性考察；5)線性關(guān)系考察；6)樣品含量測定；
[0010] 所述步驟1)的方法包括提取、石油醚萃取后進(jìn)行減壓蒸發(fā)，再調(diào)節(jié)pH，并經(jīng)乙酸 乙酯萃取后，最后經(jīng)二次減壓蒸發(fā)制成樣品待測液；
[0011] 所述步驟2)中流動相為甲醇與0. 075 %冰乙酸配制而成；
[0012] 所述標(biāo)準(zhǔn)液和所述樣品含量測定的植物激素包括IAA、ZT、ABA和GA3。
[0013] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟1)的具體方法包括：
[0014] 1-1)提?。汗┰嚪秧斞繕悠芳尤肜浼状贾?，于4°C下靜置16h浸提，抽濾得清液， 得粗提取液；
[0015] 1-2)石油醚萃取：將所述粗提取液用等體積石油醚萃取，棄去醚相，合并水相；
[0016] 1-3)減壓蒸發(fā)：將步驟1-2)所得的所述水相在37°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至所述水相體積 的1/3~1/4,得一次濃縮液；
[0017] 1-4)調(diào)節(jié)pH:將所述一次濃縮液調(diào)節(jié)pH至2. 75~2. 85之間；
[0018] 1-5)乙酸乙酯萃?。簩⒄{(diào)節(jié)好pH的一次濃縮液用等體積乙酸乙酯萃取，棄去水 相，合并酯相；
[0019] 1-6)二次減壓蒸發(fā)：將步驟1-5)所得的所述酯相在37°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至所述酯相 體積的1/4~1/5,得二次濃縮液，用甲醇定容至所述二次濃縮液體積的2倍，制成樣品待測 液，保存于4°C下棕色瓶中，待測。
[0020] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟2)中所述流動相為：甲醇與0. 075%冰乙酸按體 積比為45 :55配制流動相。
[0021] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟2)中，色譜條件設(shè)置為檢測波長210nm，流速為 0? 7mL/min，進(jìn)樣量為 20yL。
[0022] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，步驟3)中，所述標(biāo)準(zhǔn)液包括：0.lg/L的IAA標(biāo)準(zhǔn)液、 0. 001g/L的ZT標(biāo)準(zhǔn)液、0. 001g/L的ABA標(biāo)準(zhǔn)液和0. 01g/L的GA3#準(zhǔn)液；將所述標(biāo)準(zhǔn)液按 照不同濃度配比，配制成系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，4°C保存。
[0023] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟4)中，在步驟2)所述的色譜條件下，專屬性考察 包括對所述番茄頂芽樣品中的IAA、ZT、ABA和GA3進(jìn)行HPLC分離檢測。
[0024] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟5)的具體方法為：分別量取經(jīng)所述步驟3)制成 的IAA、ZT、ABA和GA#準(zhǔn)液各lmL，在IOmL的棕色容量瓶中用甲醇定容，過濾、進(jìn)樣并檢 測，以4種混標(biāo)峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸分析。
[0025] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，所述步驟6)的具體方法為：將步驟1)制成的所述樣品待 測液，過濾進(jìn)樣，按外標(biāo)法以峰面積計算所述番茄頂芽樣品中IAA、ZT、ABA和6^的含量。
[0026] 進(jìn)一步的，在本發(fā)明中，完成所述步驟6)后，進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗，具體方法為： 分別配制0. 〇lg/L的IAA、ZT、ABA和GA3二號標(biāo)準(zhǔn)液，4°C保存；將步驟1)制成的所述樣品 待測液中分別加入等體積的所述二號標(biāo)準(zhǔn)液，按外標(biāo)法以峰面積測定植物激素含量，計算 加標(biāo)回收率。
[0027] 有益效果：本發(fā)明提供的高效液相色譜法測定番茄頂芽內(nèi)源激素含量的方法，可 快速、準(zhǔn)確、同時測定4種植物內(nèi)源激素（IAA、ZT、ABA和GA3)的含量，具有測定快速、高 效、高靈敏度、高自動化的特點，填補(bǔ)了現(xiàn)有技術(shù)中缺乏高效液相色譜法測定番茄頂芽激素 的測定方法的空白，為此領(lǐng)域的技術(shù)人員提供了應(yīng)用基礎(chǔ)和提示；此外，進(jìn)行加標(biāo)回收率實 驗，平均回收率為99. 85%，RSD小于1. 56%，符合激素測定要求。
【附圖說明】
[0028] 圖1為本發(fā)明的測定方法流程圖；
[0029] 圖2為本發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)液的色譜測試結(jié)果圖；
[0030] 圖3為本發(fā)明的樣品待測液的色譜測試結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作更進(jìn)一步的說明。
[0032] 如圖1所示為本發(fā)明的測定方法流程圖，一種番茄植株頂芽內(nèi)源激素含量的測定 方法，包括以下步驟：
[0033] 1)供試番茄頂芽樣品前處理，包括提取、石油醚萃取后進(jìn)行減壓蒸發(fā)，再調(diào)節(jié)pH， 并經(jīng)乙酸乙酯萃取后，最后經(jīng)二次減壓蒸發(fā)制成樣品待測液；具體方法包括：
[0034] 1-1)提?。汗┰嚪秧斞繕悠稩g加入80%冷甲醇中，于4°C下靜置16h浸提，抽 濾得清液，得粗提取液；
[0035] 1-2)石油醚萃?。簩⒋痔崛∫河玫润w積石油醚萃取，棄去醚相，合并水相；
[0036] 1-3)減壓蒸發(fā)：將步驟1-2)所得的水相在37°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至水相體積的1/3~ 1/4,得一次濃縮液；
[0037] 1-4)調(diào)節(jié)pH:將一次濃縮液調(diào)節(jié)pH至2. 75~2. 85之間；
[0038] 1-5)乙酸乙酯萃?。簩⒄{(diào)節(jié)好pH的一次濃縮液用等體積乙酸乙酯萃取，棄去水 相，合并酯相；
[0039]1-6)二次減壓蒸發(fā)：將步驟1-5)所得的酯相在37°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至所述酯相體積 的1/4~1/5,得二次濃縮液，用甲醇定容至所述二次濃縮液體積的2倍，制成樣品待測液， 保存于4°C下棕色瓶中，待測；
[0040] 2)配制流動相、設(shè)置色譜條件：采用甲醇與0. 075%冰乙酸按體積比為45 :55配 制流動相；色譜條件設(shè)置為檢測波長210nm，流速為0. 7mL/min，進(jìn)樣量為20yL;
[0041] 3)標(biāo)準(zhǔn)液的制備：植物激素的標(biāo)準(zhǔn)液包括0.lg/L的IAA標(biāo)準(zhǔn)液、0. 001g/L的ZT 標(biāo)準(zhǔn)液、0. 〇〇lg/L的ABA標(biāo)準(zhǔn)液和0. 01g/L的GA3#準(zhǔn)液；將標(biāo)準(zhǔn)液按照不同濃度配比，配 制成系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液，4°C保存；
[0042] 4)專屬性考察：在步驟2)的色譜條件下，專屬性考察包括對番茄頂芽樣品中的 IAA、ZT、ABA和GA3進(jìn)行HPLC分離檢測；
[0043] 5)線性關(guān)系考察：分別量取經(jīng)步驟3)制成的IAA、ZT、ABA和GA#準(zhǔn)液各lmL，在 IOmL的棕色容量瓶中用甲醇定容，過濾、進(jìn)樣并檢測，以4種混標(biāo)峰面積與相應(yīng)質(zhì)量濃度進(jìn) 行線性回歸分析；
[004