一種適合于毛細管的微米級區(qū)帶進樣方法與裝置的制造方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于分析化學中的分離分析領域，涉及一種適合于毛細管的微米級區(qū)帶進樣方法與裝置。
【背景技術】
[0002]利用毛細管可以進行分離和其他分析。但在做超微量分析時，需要超短的進樣技術。其中影響最大的毛細管分析方法是毛細管電分離(CES)，包括毛細管電泳、毛細管電色譜等。作為一種以毛細管為分離通道的高效微量的液相分離分析方法，CES早已在核酸、糖、蛋白質等重大生物分子的分離分析中表現(xiàn)出了巨大優(yōu)越性，但在向復雜樣品分析的推進過程中，卻正面臨新的巨大挑戰(zhàn)，其中如何能進一步加快分離的速度并有效減省樣品的預處理步驟，是提高其復雜樣品分析能力的關鍵環(huán)節(jié)。
[0003]復雜樣品因組成的特殊性，其分離通常都十分困難，耗時甚長。為了提高毛細管電分離的速度，常采用提高分離電壓及縮短分離長度的策略。提高分離電壓在一定范圍內有效，但受制于焦耳熱效應，當分離效果達到極值后會迅速下降，不可一味升高，須得適可而止。于是用縮短的毛細管來做CES (SCES)成為另外一種出路。該法可在維持電場強度不變的條件下，縮短分離時間，提高分析通量。但要求同時縮短樣品區(qū)帶，以保持分離效率。這對進樣方法提出了新的要求，即必須將盡可能短的樣品區(qū)帶引入縮短的毛細管中。這是目前常規(guī)的毛細管電分離進樣方法無法實現(xiàn)的。
[0004]常用的成熟進樣方法如電動進樣或壓力進樣等，引入的初始區(qū)帶在毫米級水平或更長，為此國際上早在上世紀90年代初就已對此問題展開了研宄，發(fā)展出了光控(Anal.Chem.(1991)63:802-807)和流控(Anal.Chem.(1993)65:1576-1581)門進樣術，可以將區(qū)帶控制在微米級甚至更短，能夠由此實現(xiàn)秒級或更短級別的快速分離。但裝置比較復雜，操控難度大、成本高，不易實施和推廣。后來，國內的方群研宄組提出了利用毛細現(xiàn)象的流體自動進樣方法(Anal.Chem.(2009) 81:3693-3698)，簡化了進樣控制，能實現(xiàn)pL級的進樣，但只適用于溶液進樣，不適用于干樣，且其進樣量會因毛細管壁狀態(tài)的不同而發(fā)生不易調控的變化。因此，為深化SCES研宄，還需要進一步發(fā)展可面對更多樣品種類和易于操控的超短區(qū)帶進樣方法。
[0005]另外，復雜樣品的來源通常都十分有限，但往往又要經(jīng)過一系列前處理過程，以獲得可用的分析結果。例如，血液的檢測一般需先將血液滴于濾紙上，然后剪裁特定大小的濾紙進行萃取，最后進行分析(z Rechtsmed(1989) 103:21-25)。汗液的檢測則需先使用汗液收集貼片收集汗液，萃取后再進樣分析(Phys1l Rep(2014)2,el2007)o農(nóng)藥殘留的檢測亦需經(jīng)過勻漿、萃取、清潔等樣品前處理過程才能進行分析(J AOAC Int.(2007)90:485-520)。這種前處理不僅會延長整個分析過程，還會增加樣品在處理過程中的損失，加劇了一些珍貴樣品分析的難度。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種適合于毛細管的微米級區(qū)帶進樣方法與裝置。
[0007]本發(fā)明提供的進樣裝置，包括毛細管、加樣板、位移控制機構和毛細管清洗機構；
[0008]其中，所述毛細管的一端為取樣端，所述取樣端磨平或磨尖，并垂直指向所述加樣板，另一端與所述毛細管清洗機構相連；
[0009]所述加樣板置于所述位移控制機構上；
[0010]所述位移控制機構用于控制所述加樣板沿所述毛細管的長軸或短軸方向水平移動。
[0011]上述進樣裝置也可只由上述各部件組成。
[0012]上述進樣裝置中，構成所述毛細管的材料不限，所述毛細管的內徑不限。
[0013]在實際操作中，可依據(jù)樣品的親或疏水性質，對所述毛細管進行反親或反疏水表面修飾，以減少表面對樣品的吸附或黏附或克服交叉污染。另外，也可根據(jù)后面分離的需要而填充不同的緩沖液或功能性可溶化合物或顆粒性填料；為便于控制，可以增加能對毛細管進行沖洗和溶液更換的正壓或真空機構；
[0014]所述進樣裝置還可包括毛細管支架；
[0015]所述毛細管支架用于支撐所述毛細管保持水平。
[0016]所述加樣板是可拆卸的；為便于進樣，加樣板可以設計成含有加樣槽陣列的方形或圓形可旋轉、可電動控制位移或轉動位置的機構；
[0017]所述毛細管清洗機構具體可為注射器；
[0018]所述加樣板上設置有加樣槽或樣品夾；
[0019]構成所述加樣板的材質為玻璃。
[0020]所述加樣槽或樣品夾的個數(shù)至少為一個。
[0021]所述加樣槽可用于加載液態(tài)樣品；所述加樣槽的深度具體可為0-200 μπι，且不為O;所述加樣槽的表面可經(jīng)過修飾以抑制液態(tài)樣品吸附并使液態(tài)樣品鋪展成膜。
[0022]本發(fā)明還提供了一種利用前述本發(fā)明提供的進樣裝置進行進樣的方法。該進樣的方法包括如下步驟:將樣品固定于所述加樣板上，并將所述加樣板固定于所述位移控制機構上，將能夠溶解樣品的溶液由所述毛細管清洗機構注射入所述毛細管中至滿，移動所述位移控制結構和所述毛細管，使所述毛細管的取樣端與所述樣品接觸，實現(xiàn)所述樣品的進樣。
[0023]該進樣方法的原理是液-液或固-液接觸界面上的物質溶解和濃度梯度所引起的擴散，無論樣品處于固態(tài)、液態(tài)或其它任何狀態(tài)，其可溶解成分都能通過溶解-擴散機制，從高濃度區(qū)域進入低濃度或零濃度區(qū)域，因而當樣品與充滿良溶劑或緩沖液的空或填充毛細管入口接觸時，樣品就會經(jīng)溶解-擴散而進入毛細管，由此實現(xiàn)進樣。
[0024]所述進樣方法的進樣量Q取決于毛細管入口與樣品接觸時間的長短，其與毛細管入口橫截面積S、樣品濃度C、溶解速度Udis與擴散速度υ dif、進樣時間t的關系是:Q =cS( υ dis+ υ dif) to當接觸時間為秒級時，進樣區(qū)帶長度可控制在20微米以內，進樣體積可低至皮升級。
[0025]上述方法中，所述樣品為液態(tài)樣品、固態(tài)樣品或介于液態(tài)和固態(tài)之間的樣品。所述樣品均不需要進行預處理即可直接完成進樣。
[0026]對于液態(tài)樣品，進樣量由液膜厚度和接觸時間控制；
[0027]對于固態(tài)樣品，進樣量由接觸時間控制。
[0028]所述樣品為液態(tài)樣品時，可將所述液態(tài)樣品置于所述加樣槽中；
[0029]所述樣品為固態(tài)樣品時，可將所述固態(tài)樣品用所述樣品夾固定于所述加樣板上。
[0030]所述能夠溶解樣品的溶液為所述樣品的良溶劑或緩沖溶液。
[0031]為了使該進樣裝置能夠與毛細管電色譜法聯(lián)用，所述能夠溶解樣品的溶液中還可包含填料；所述填料具體可為納米顆粒填料，更具體可為粒徑為800nm的二氧化娃顆粒；
[0032]所述納米顆粒填料的粒徑具體可為50nm_5 μ m，具體可為800nm ；
[0033]所述接觸步驟中，接觸的時間為Os-lOOs，且不為0，具體可為0.2s。
[0034]另外，由于上述本發(fā)明提供的進樣裝置可直接與毛細管電分離系統(tǒng)并用，進樣毛細管同時也是分離毛細管，因而能夠實現(xiàn)原位進樣與在線分離分析。因而，上述本發(fā)明提供的進樣裝置在分離樣品中的應用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。其中，所述分離樣品的方法為電泳法、電色譜法和高效液相色譜法中的至少一種；所述電泳法具體可為毛細管電泳法，所述電色譜法具體可為毛細管電色譜法。
[0035]本發(fā)明涉及一種可應用于毛細管特別是毛細管電分離(如電泳和電色譜等)的微米級超短區(qū)帶進樣方法及裝置。該進樣方法利用原位溶解和擴散原理來轉移樣品成分。將灌有良溶劑或緩沖液的毛細管(包括填充毛細管)的一個端口直接與樣品表面接觸，目標成分便會在溶解和濃差擴散的共同作用下轉移到毛細管內，形成10-20微米的初始區(qū)帶，特別適用于短毛細管的快速高效電泳或電色譜分離和檢測。該進樣方法可應用于液體樣品、固體及其過渡狀態(tài)樣品的原位直接進樣，可減少樣品預處理步驟；進樣區(qū)帶僅微米級，是短毛細管分離技術所急需的進樣法；進樣控制簡便，裝置易于設計制作；能實現(xiàn)短毛細管的快速電分離，效率高，具有重要的應用價值。
【附圖說明】
[0036]圖1為本發(fā)明提供的進樣裝置結構示意圖；
[0037]圖2為實施例2所得液態(tài)樣品和固態(tài)樣品的照片及進樣區(qū)帶照片；
[0038]圖3為進樣裝置與短毛細管電泳分離裝置聯(lián)用的結構示意圖；
[0039]圖4為固態(tài)和液態(tài)樣品連續(xù)八次進樣的電泳譜圖；
[0040]圖5為實施例5和6不同樣品狀態(tài)的進樣與電泳分離效果；
[0041]圖6為實施例7定量工作曲線與腎上腺素注射液電泳譜圖；
[0042]圖7為實施例8固體奶片直接進樣-短毛細管電泳譜圖；
[0043]圖8為實施例9混合氨基酸超短進樣-毛細管電色譜分離譜圖。
【具體實施方式】
[0044]下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原材料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得。
[0045]實施例1、進樣裝置
[0046]本發(fā)明提供的進樣裝置的結構如圖1所示，由石英毛細管1、可拆卸的加樣板2、位移控制機構3、毛細管清洗機構也即注射器5和毛細管支架4組成；
[0047]其中，石英毛細管I的內徑為50 μ m，外徑為375 μ m，長為5cm ;毛細管的一端為磨尖的取樣端，并用十八烷基氯化硅進行疏水化修飾；該石英毛細管垂直指向加樣板，另一端與毛細管清洗機構也即注射器相連；
[0048]加樣板2為玻璃片，置于位移控制機構上，其上用HF刻蝕出lcmXlcmX200 ym的凹槽作為加樣槽；加樣槽的個數(shù)為三個；
[0049]位移控制機構3用于控制加樣板2沿石英毛細管I的長軸或短軸方向水平移動；
[0050]毛細管支架4用于支撐石英毛細管I保持水平。
[0051]實施例2、FITC液態(tài)樣品的進樣與效果
[0052]I)利用實施例1的進樣裝置，使用前用毛細管清洗機構也即注射器5清洗毛細管的內壁，然后將能溶解樣品的緩沖液吸入或壓入毛細管中至填滿整管。
[0053]將加樣板2經(jīng)Piranha溶液清洗并用空氣等離子體處理，使其具備親水性。
[0054]2)按照如下方法配置FITC液態(tài)樣品:
[0055]以5mM pH值為9.2的硼砂水溶液為溶劑，將FITC溶于該溶劑中至其濃度為0.1mM ;取上述溶液I μ L，作為FITC液態(tài)樣品；
[0056]3)將步驟2)所得FITC液態(tài)樣品滴于加樣板2上IcmX IcmX 200 μ m的加樣槽內，使其鋪展開，得到厚度為10 μ m的樣品液膜，如圖2 (左上)所示；
[0057]將加樣板2固定到位移控制機構3上，石英毛細管內填滿20mM硼砂水溶液，滑動位移控制機構3使樣品液膜接觸石英毛細管I進樣口實施進樣，接觸時間為0.2s。
[0058]利用熒光顯微鏡觀測進樣區(qū)帶，可知該進樣區(qū)帶的長度為15 μ m，如圖2 (右上)，由此計算得進樣體積