高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及動物組織和排泄物的檢測領(lǐng)域，特別是一種高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]樣品前處理是分析檢測過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，是濃縮被測定的痕量組分，提高方法的靈敏度，及除去對分析系統(tǒng)有干擾的物質(zhì)的重要手段。萃取是從樣品集體中分離出目標(biāo)化合物的一項(xiàng)技術(shù)，是樣品預(yù)處理中最重要的方法之一。目前，液液萃取仍然是應(yīng)用最廣泛的樣品制備方法之一，但是，傳統(tǒng)的液液萃取的操作繁瑣費(fèi)時、有機(jī)溶劑消耗量大，而且容易出現(xiàn)乳化現(xiàn)象的缺陷，使得在實(shí)際應(yīng)用中具有一定的局限性。
[0003]1998年，科學(xué)家提出了在傳統(tǒng)的液液萃取的基礎(chǔ)上，利用一種具有吸附性和較大的比表面積的惰性多空填料作為介質(zhì)，建立的一種新型高效樣品的制備方法-介質(zhì)液液萃取(supported liquid extract1n簡稱SLE)，SLE萃取技術(shù)就是選用一種多孔性惰性材料-煅燒硅藻土作為介質(zhì)，取代分液漏斗，增大了兩相接觸時的作用面積，實(shí)現(xiàn)高效、快速的萃取過程。
[0004]當(dāng)水溶液樣品加樣到固定的聚丙烯注射管中的煅燒硅藻土上后，經(jīng)過一定時間(一般分為幾分鐘)，水相溶液以一層薄薄的液膜形式分布在填料表面，之后，將有機(jī)溶劑從柱管上端加入，當(dāng)互不相溶的兩相在硅藻土表面接觸的同時萃取立即發(fā)生，最后萃取液在重力作用下流出，必要情況下，可以施加較小的壓力，而水相保留在介質(zhì)中。盛接的流出液直接將溶劑吹干，復(fù)溶后，即可用于下一步分析檢測。
[0005]農(nóng)業(yè)部1025號公告-11-2008公開了豬尿中β -受體激動劑多殘留檢測，其采用酶解后異丙醇-乙酸乙酯進(jìn)行萃取，并通過內(nèi)標(biāo)法可以得到相關(guān)的檢測結(jié)果，但是在實(shí)際應(yīng)用中，采用酶解后然后在采用傳統(tǒng)方法萃取后通過色譜檢測有時無法檢出殘留項(xiàng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種分離效率高、操作簡單的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:一種高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法，包括以下步驟:
[0008]步驟1:樣品預(yù)處理；收集豬尿，首先加入β -鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶進(jìn)行酶解，酶解結(jié)束后加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4倍豬尿體積的Ph范圍為5.5?6的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液；
[0009]步驟2:將上清液加入到SLE柱后，靜置2?4分鐘；
[0010]步驟3:采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫至少兩次，接收洗脫液，得到含有萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇的洗脫液；[0011 ] 步驟4:采用高效液相色譜法對步驟3得到的洗脫液進(jìn)行檢測，所述的高效液相色譜法的具體參數(shù)為:
[0012]色譜柱:C18柱，150mm*3.9mmID
[0013]柱溫:室溫
[0014]流動相:0.05%磷酸水溶液和乙腈的混合液，其中0.05%磷酸水溶液和乙腈的體積比為100:12 ；
[0015]檢測器:UV檢測器；
[0016]檢測波長:217nm;
[0017]其中，所述的二元洗脫劑為正丁醇和乙酸甲酯的混合物，其中正丁醇和乙酸甲酯的重量比為4:1?5:1。
[0018]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中，所述的豬尿?yàn)?ml，緩沖溶液為4ml，步驟2中所取的上清液為0.5ml，所述的步驟3中，每次洗脫時所用的洗脫劑為0.5ml。
[0019]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中，每毫升的尿液中加入β -鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶12 μ Lo
[0020]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中，所述的三氯乙酸和豬尿的質(zhì)量比為1:98?100。
[0021]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中，所述的步驟I中，漩渦混合器混合處理的時間為0.5?1.5分鐘。
[0022]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中，所述的步驟I中，所述的離心處理的具體操作為:將經(jīng)混合處理的溶液在離心機(jī)中以9000?11000轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心0.5?1.5分鐘。
[0023]在上述的高精度測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇含量的方法中，所述的SLE柱為奧秘山東科技有限公司生產(chǎn)的介質(zhì)液液萃取SLE柱。
[0024]本發(fā)明的有益效果如下:
[0025]采用SLE法分離豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇，先進(jìn)行酶解使蛋白質(zhì)和萊克多巴胺分離，采用緩沖溶液進(jìn)行混合，然后通過SLE柱分離出萊克多巴胺，萃取劑為正丁醇和乙酸甲酯，本發(fā)明的分離效率好、分離時間短，同時結(jié)合HPLC法測量萃取得到的洗脫液，能夠準(zhǔn)確的測量豬尿中的萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇的含量。特別是本發(fā)明采用正丁醇和乙酸甲酯分離三種受體激動劑，可以保證其在色譜柱上有效出峰，相比于傳統(tǒng)的檢測方法，其檢出難度降低，檢測精度升高。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0027]實(shí)施例1
[0028]步驟1:取豬尿lg，首先加入12 μ L β -鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶進(jìn)行酶解，酶解時間為3-4小時，酶解結(jié)束后加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4ml的Ph為5.6的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質(zhì)量比為1:99。
[0029]步驟2:將上清液加入到SLE柱后，靜置3分鐘；
[0030]步驟3:采用二元洗脫劑對SLE柱洗脫2次，接收洗脫液，得到含有萊克多巴胺、克侖特羅、沙丁胺醇的洗脫液；每次消耗的洗脫劑為0.5ml，所述的二元洗脫劑為正丁醇和乙酸甲酯的混合物，異丙醇和乙酸甲酯的重量比為4:1。
[0031]實(shí)施例2
[0032]步驟1:取豬尿lg，首先加入12 μ L β -鹽酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶進(jìn)行酶解，酶解時間為3-4小時，酶解結(jié)束后加入三氯乙酸沉淀豬尿中的蛋白質(zhì)，加入4ml的Ph為5.8的乙酸銨緩沖液，漩渦混合器混合后離心；取離心后的上清液0.5ml ;三氯乙酸和豬尿的質(zhì)量比為1:100。