酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及暗場(chǎng)成像的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及暗場(chǎng)成像中的應(yīng) 用，屬于納米材料及生物醫(yī)學(xué)納米技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 惡性腫瘤居高不下的死亡率和高昂的治療費(fèi)用給患者和家屬都帶來(lái)巨大的痛苦 和壓力，準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法不僅可以實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期診斷，也能更好地給患者提供個(gè)體 化醫(yī)療，降低患者的痛苦。
[0003] 現(xiàn)今，免疫酶標(biāo)法以其定位準(zhǔn)確、對(duì)比度高等優(yōu)點(diǎn)已成為臨床腫瘤診斷中不可缺 少的重要診斷手段。其基本原理是先以功能性酶標(biāo)記的抗體與細(xì)胞或組織上的待測(cè)物質(zhì)直 接或間接結(jié)合，接著加入酶的顯色底物，生成有色的不溶于水的產(chǎn)物，利用光學(xué)顯微鏡或電 子顯微鏡觀察，對(duì)細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)的待測(cè)抗原成分進(jìn)行定位研宄。自2007年閻錫蘊(yùn)研宄 組首次提出氧化鐵納米顆粒模擬酶的概念，許多納米材料的類酶特性被相繼發(fā)現(xiàn)，其中金 納米顆粒作為一類功能性納米顆粒，因其獨(dú)特的表面等離子體共振、表面化學(xué)特性和催化 活性，在生物和化學(xué)檢測(cè)中被格外關(guān)注。金的氧化還原電位為+1. 68,具有極強(qiáng)的奪電子能 力。對(duì)于有氧化還原電位較小的生物大分子參加的生化反應(yīng)，具有很強(qiáng)的催化作用，能明顯 提高生物大分子的活性，可催化H202氧化底物發(fā)生顯色反應(yīng)。但無(wú)論是傳統(tǒng)的酶標(biāo)二抗還 是新興的金屬模擬過(guò)氧化物酶，催化活性都很有限，這就大大限制了臨床檢測(cè)的靈敏度，同 時(shí)，目前的免疫組化檢測(cè)為人工讀片，主觀性較強(qiáng)，準(zhǔn)確性得不到保證。
[0004] 暗場(chǎng)顯微鏡以其分辨能力高等優(yōu)點(diǎn)成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域新的表征技術(shù)之一，金納米 顆粒又以其優(yōu)越的暗場(chǎng)散射性質(zhì)在腫瘤成像方面的應(yīng)用獲得了科學(xué)家的認(rèn)可，國(guó)內(nèi)外很多 研宄組利用金納米顆粒的暗場(chǎng)散射性質(zhì)實(shí)現(xiàn)了惡性腫瘤的檢測(cè)。但金納米顆粒的散射強(qiáng) 度有限，當(dāng)單獨(dú)使用金納米顆粒標(biāo)記腫瘤細(xì)胞或組織進(jìn)行暗場(chǎng)觀察難以達(dá)到臨床檢測(cè)的要 求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于酶標(biāo)抗體-金納米 探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及協(xié)同增強(qiáng)暗場(chǎng)成像中的應(yīng)用。該方法通過(guò)將金納米顆粒 作為大量酶標(biāo)二抗的載體同時(shí)利用其本身的類酶活性和暗場(chǎng)散射特性，以及催化產(chǎn)物DAB 聚合體的暗場(chǎng)散射特性，提高該方法的暗場(chǎng)散射強(qiáng)度。
[0006] 技術(shù)方案：本發(fā)明提供的酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及暗場(chǎng) 成像中的應(yīng)用。
[0007] 其中，所述酶標(biāo)抗體-金納米探針（GNP-Ab-HRP)采用以下方法制得：選用辣根過(guò) 氧化物酶（HRP)標(biāo)記的兔鼠通用酶標(biāo)二抗構(gòu)建酶標(biāo)抗體-金納米探針（GNP-Ab-HRP)，采 用靜電吸附法將鼠兔通用型酶標(biāo)二抗偶聯(lián)到金納米顆粒上，并用1 %BSA封閉，離心即得 GNP-Ab-HRP探針。
[0008] 本發(fā)明還提供了一種免疫組化檢測(cè)試劑盒，包括以下組份：
[0009] 包括彼此獨(dú)立的一抗溶液、酶標(biāo)抗體-金納米探針溶液、DAB顯色液和洗滌液；
[0010] 所述一抗溶液包括：一抗、防腐劑和磷酸鹽緩沖液（pH= 7-8);
[0011] 所述酶標(biāo)抗體_金納米探針溶液包括：10-500yg/ml酶標(biāo)抗體-金納米探針、 0. 1-5%
[0012] 封閉蛋白和磷酸鹽緩沖液（pH= 8-10);
[0013] 所述DAB顯色液包括彼此獨(dú)立的DAB顯色液I、DAB顯色液II和1-60%過(guò)氧化氫， 使
[0014] 用前按1:1:1混合；
[0015] 所述洗滌液包括質(zhì)量百分比為0. 01-2 %吐溫-20和磷酸鹽緩沖液（pH= 7-8);
[0016] 各組分用量如下表：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及協(xié)同增強(qiáng)暗場(chǎng)成像中的應(yīng)用。
2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于；所述酶標(biāo)抗體-金納米探針（GNP-Ab-HRP) 采用W下方法制得；選用辣根過(guò)氧化物酶（HR巧標(biāo)記的兔鼠通用酶標(biāo)二抗構(gòu)建酶標(biāo)抗 體-金納米探針（GNP-Ab-HRP)，采用靜電吸附法將鼠兔通用型酶標(biāo)二抗偶聯(lián)到金納米顆粒 上，并用1 %BSA封閉，離屯、即得GNP-Ab-HRP探針。
3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述所述酶標(biāo)抗體-金納米探針 (GNP-Ab-HR巧的粒徑為lO-lOOnm，每個(gè)酶標(biāo)抗體-金納米探針（GNP-Ab-HRP)表面有5-500 酶標(biāo)抗體。
4. 一種包括權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)中所述的酶標(biāo)抗體-金納米探針免疫組化檢測(cè)試劑 盒，其特征在于： 包括彼此獨(dú)立的一抗溶液、酶標(biāo)抗體-金納米探針溶液、DAB顯色液和洗漆液； 所述一抗溶液包括；一抗、防腐劑和磯酸鹽緩沖液（pH= 7-8); 所述酶標(biāo)抗體-金納米探針溶液包括；10-500yg/ml酶標(biāo)抗體-金納米探針、0. 1-5% 封閉蛋白和磯酸鹽緩沖液（pH= 8-10); 所述DAB顯色液包括彼此獨(dú)立的DAB顯色液I、DAB顯色液II和1-60 %過(guò)氧化氨，使用 前按1:1:1混合； 所述洗漆液包括質(zhì)量百分比為0. 01-2%吐溫-20和磯酸鹽緩沖液（pH= 7-8); 各組分用量如下表：
5. 權(quán)利要求3所述的免疫組化試劑盒在腫瘤細(xì)胞檢測(cè)中的應(yīng)用。 '
6. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：包括W下步驟： (1) 酶標(biāo)抗體-金納米探針的構(gòu)建 選用辣根過(guò)氧化物酶（HR巧標(biāo)記的兔鼠通用酶標(biāo)二抗構(gòu)建酶標(biāo)抗體-金納米探針 佑NP-Ab-HRP)，采用靜電吸附法將鼠兔通用型酶標(biāo)二抗偶聯(lián)到金納米顆粒上，并用1%BSA 封閉，離屯、即得GNP-Ab-HRP探針； (2) 暗場(chǎng)免疫組化檢測(cè)方法 GNP-Ab-HRP催化DAB顯色，再利用其進(jìn)行雙模態(tài)免疫組化檢測(cè)，并實(shí)現(xiàn)量化判讀； 將待測(cè)樣品按常規(guī)方法預(yù)處理后，先與一抗4°C解育過(guò)夜，再與酶標(biāo)抗體-金納米探針 佑NP-Ab-HRP) 37°C解育30min，用PBS-T洗漆后進(jìn)行DAB顯色，在暗場(chǎng)顯微鏡下觀察； (3) 判讀方法及標(biāo)準(zhǔn) 1)對(duì)暗場(chǎng)成像圖進(jìn)行取色； 。分析目標(biāo)顏色面積，計(jì)算紅色面積佩和紅色與黃綠色面積和做的比值N; 3) 通過(guò)將R值和N值和標(biāo)準(zhǔn)區(qū)間比對(duì)，確定目標(biāo)顏色面積處于哪種陰性/陽(yáng)性區(qū) 間；其中，區(qū)間判斷標(biāo)準(zhǔn)為；當(dāng)R<400時(shí)，為;當(dāng)400<R<10000且N<0. 26時(shí)，為" + 當(dāng) 400<R<10000 且 0. 26《N《0. 35 時(shí)，為"++'' ；當(dāng)S> 10000 且N〉0. 35 時(shí)，為"+++，' ； 4) 得出檢測(cè)結(jié)論； 5)輸出只含有目標(biāo)顏色的檢測(cè)圖片。
7.酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色反應(yīng)中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了酶標(biāo)抗體-金納米探針在二氨基聯(lián)苯胺催化顯色及暗場(chǎng)成像中的應(yīng)用。還提供了一種包括上述酶標(biāo)抗體-金納米探針免疫組化檢測(cè)試劑盒。本發(fā)明將酶標(biāo)抗體-金納米探針催化二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，從而可實(shí)現(xiàn)協(xié)同增強(qiáng)的暗場(chǎng)免疫組化檢測(cè)，并建立了量化判讀。
【IPC分類】G01N33-543, G01N33-535, G01N33-574
【公開(kāi)號(hào)】CN104849449
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510243543
【發(fā)明人】張宇, 范霖, 田艷艷, 婁豆豆, 張熙之, 馬明, 顧寧
【申請(qǐng)人】東南大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月13日