本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，具體涉及一種用于鑒定川貝母及偽品的熒光pcr檢測(cè)引物、探針組合物及檢測(cè)方法與應(yīng)用。屬于分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：藥用川貝母為百合科(liliaceae)貝母屬(fritillarial.)川貝母、暗紫貝母、甘肅貝母、梭砂貝母或太白貝母、瓦布貝母的干燥鱗莖。按藥材性狀不同分別習(xí)稱“松貝”、“青貝”和“爐貝”。川貝母具有清熱化痰、潤(rùn)肺止咳的功效，藥用價(jià)值極高，由于川貝母生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、資源緊缺，已成為中藥材中價(jià)格最昂貴的根莖類藥材之一。隨著需求量的增加，伊犁貝母、平貝母、輪葉貝母等作為川貝母的混偽品頻繁出現(xiàn)，甚至葫蘆科有毒植物土貝母的鱗莖也被發(fā)現(xiàn)冒充川貝母出售，藥材質(zhì)量極不穩(wěn)定，直接影響到川貝母的用藥安全與人的生命安全。因此對(duì)川貝母藥材進(jìn)行更深入的鑒定研究對(duì)于保證川貝母藥材的質(zhì)量及用藥安全具有重要意義。傳統(tǒng)的鑒定方法有性狀鑒別、顯微結(jié)構(gòu)法和化學(xué)鑒定方法。但由于市場(chǎng)上貝母類藥材品種多，藥源植物來(lái)源不一、種植環(huán)境、產(chǎn)地和加工等因素的存在使得傳統(tǒng)的鑒定方法具有一定的局限性，很難將川貝母與其偽品區(qū)分開(kāi)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使得中藥材dna成分含量的定量溯源成為可能。目前利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)酶切瓊脂糖凝膠電泳(pcr-rflp)法鑒別川貝母已經(jīng)納入2015版《藥典》，該方法基于dna條形碼技術(shù)準(zhǔn)確、專屬性強(qiáng)，可有效鑒別川貝母真?zhèn)危瑫r(shí)也存在周期長(zhǎng)，開(kāi)管操作易污染等缺點(diǎn)；申請(qǐng)?zhí)枮?01610234695.9的專利，使用sybrgreenⅰ法用于鑒定川貝母，但該方法產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物較多，會(huì)導(dǎo)致高背景和假陽(yáng)性。而本發(fā)明則克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)川貝母及偽品的通用引物及各自特異探針，利用多重多色實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)，一管反應(yīng)同時(shí)鑒別川貝母真?zhèn)?，大大提高了檢測(cè)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，使得川貝母鑒定結(jié)果更加特異、快速、準(zhǔn)確、直觀。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用于鑒定川貝母及偽品的熒光pcr檢測(cè)引物、探針組合物及檢測(cè)方法與應(yīng)用。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：一種用于鑒定川貝母及偽品的熒光pcr通用檢測(cè)引物，其核苷酸序列如下：通用上游引物fritillariaf：5'-gcagaatcccgtgaaccatc-3'，如seqidno.1所示；通用下游引物fritillariar：5'-tccgtccaccactcgtcg-3'，如seqidno.2所示。一種用于鑒定川貝母及偽品的探針組合物，包括：(1)川貝母的特異探針，其核苷酸序列如下：川貝母的特異探針fritillariap1：5'-ccaatgacccttcgggtgcg-3'，如seqidno.3所示；(2)貝母的通用探針，其核苷酸序列如下：貝母的通用探針fritillariaup：5'-ctcgtgtgcggcgggctt-3'，如seqidno.4所示；(3)偽品貝母的特異探針，其核苷酸序列如下：偽品貝母的特異探針fritillariawp：5'-actggccctccgtgcctcgt-3'，如seqidno.5所示。作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，上述探針組合物中3種探針序列的5’端修飾有報(bào)告基團(tuán)，3’端修飾有淬滅基團(tuán)，其中所述報(bào)告基團(tuán)為fam、hex、tamra、rox、cy5中的任一種，所述淬滅基團(tuán)為dabcyl、bhq1，bhq2中的任一種，上述3種探針選需用不同的熒光修飾標(biāo)記。一種用于鑒定川貝母及偽品的pcr檢測(cè)試劑盒，包括上述熒光pcr通用檢測(cè)引物、探針組合物和實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系。所述實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系采用20μl反應(yīng)體系，包括：2×taqmanmastermix(ph值為8.9，鎂離子濃度為2.5mm，4種dntp的終濃度各為250μm，taq酶的用量為1u/反應(yīng))，引物組終濃度0.1～0.5μm，探針組合物終濃度0.05～0.25μm，dna用量0.5～50ng/μl取2μl，用雙蒸水補(bǔ)足20μl。所述pcr檢測(cè)試劑盒還包括川貝母陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品和空白對(duì)照品。上述引物、探針組合物或試劑盒在鑒定川貝母及偽品中的應(yīng)用。一種用于鑒定川貝母及偽品的檢測(cè)方法，具體步驟如下：(1)提取待測(cè)樣本模板dna并進(jìn)行質(zhì)量鑒定，選擇靶基因，設(shè)計(jì)引物；(2)配制pcr反應(yīng)液，在4通道或4通道以上的熒光定量pcr儀上，使用上述pcr檢測(cè)試劑盒進(jìn)行pcr擴(kuò)增；(3)結(jié)果判讀：設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給出第n個(gè)循環(huán)時(shí)的熒光增加值δrn與擴(kuò)增曲線ct值，根據(jù)不同探針熒光信號(hào)及擴(kuò)增曲線ct值來(lái)判定是否為川貝母正品。作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(1)基于dna條形碼技術(shù)原理，選擇its2基因作為靶基因。作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)所述pcr反應(yīng)液的反應(yīng)體擴(kuò)增體系如表1所示：表1pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系試劑名稱工作濃度用量(μl)終濃度taqmanmastermix2×101×引物組2～10μm10.1～0.5μm探針組合物1～5μm10.05～0.25μmdna模板0.5～50ng/μl21～100ng雙蒸水6總體積20作為優(yōu)選的技術(shù)方案之一，步驟(2)所述pcr擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃，2min：95℃，10s；58℃，35s，在此收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)；所述的熒光定量pcr儀為任何型號(hào)的熒光定量pcr儀，根據(jù)不同型號(hào)的pcr儀的相應(yīng)要求對(duì)標(biāo)記熒光號(hào)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明以貝母的一對(duì)通用引物對(duì)待測(cè)樣本dna提取物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以川貝母的特異探針、貝母通用探針及偽品貝母特異探針，利用多重多色實(shí)時(shí)熒光pcr技術(shù)，一管反應(yīng)，直觀、快速地鑒定出川貝母真?zhèn)巍Ｏ鄬?duì)于sybrgreeni法可能會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增或存在引物二聚體有影響的情況，產(chǎn)生的非特異性產(chǎn)物較多，會(huì)導(dǎo)致高背景和假陽(yáng)性，本發(fā)明以特異探針與模板配對(duì)，具有高度的特異性與專一性，并且具有擴(kuò)增效率高，靈敏度高，準(zhǔn)確率高，重現(xiàn)性好，檢測(cè)周期短的特點(diǎn)，能在1.5小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，且能實(shí)時(shí)檢測(cè)dna擴(kuò)增反應(yīng)，具有很高的可行性與應(yīng)用前景，對(duì)中草藥川貝母市場(chǎng)的健康穩(wěn)定發(fā)展具有重要的意義。附圖說(shuō)明圖1是當(dāng)fam、joe熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足ct≤35說(shuō)明待檢樣本為川貝母；圖2是當(dāng)rox、joe熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足ct≤35說(shuō)明待檢樣本為偽品貝母；圖3是川貝母特異探針特異性擴(kuò)增曲線圖，其他偽品貝母只有joe熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線；圖4是偽品貝母特異探針特異性擴(kuò)增曲線圖，其他川貝母只有joe熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線；圖5是川貝母模板分別為50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng時(shí)的靈敏度擴(kuò)增曲線圖；圖6是貝母通用探針在貝母模板分別為50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng時(shí)的靈敏度擴(kuò)增曲線圖；圖7是偽品貝母特異探針在偽品貝母模板分別為50ng、10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng時(shí)的靈敏度擴(kuò)增曲線圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的闡述，應(yīng)該說(shuō)明的是，下述說(shuō)明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對(duì)其內(nèi)容進(jìn)行限定。本發(fā)明中所用實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器如下：實(shí)驗(yàn)材料：暗紫貝母、平貝母、輪葉貝母、伊犁貝母、藍(lán)花貝母、青貝、松貝、爐貝、白術(shù)、人參、黨參、生地、石斛、山藥、雞血藤、枸杞、柴胡等植物。所用試劑：植物dna提取試劑盒，dna分子量makerdl2000、電泳上樣緩沖液等pcr反應(yīng)試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；引物與探針由生工生物工程(上海)有限公司負(fù)責(zé)合成；2×taqmanmastermix為dbibioscience品牌；dna測(cè)序由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)中心測(cè)序中心完成。所用儀器：abi7500熒光定量pcr儀為abi公司產(chǎn)品；takarapcr儀為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；5424d型高速離心機(jī)為eppendorf公司產(chǎn)品。實(shí)施例11、川貝母樣品及偽品樣本dan提?。翰捎弥参飀an提取試劑盒提取，具體操作步驟見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。提取的基因組dna經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定其純度和濃度。測(cè)定od260/od280值均為1.8～1.9左右，濃度在10ng/μl以上，說(shuō)明dna純度較高，濃度適中，符合pcr擴(kuò)增要求。2、靶基因的選擇和引物組、探針組合物的設(shè)計(jì)及篩選：基于dna條形碼技術(shù)，選擇its2基因作為靶基因，設(shè)計(jì)貝母通用引物及通用探針、川貝母特異探針，平貝母、伊犁貝母、輪葉貝母等偽品貝母的特異探針。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一系列貝母的通用探針、川貝母及偽品貝母特異性探針，經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)的不斷優(yōu)化和篩選，最終篩選出特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高的最優(yōu)探針組合物，引物及篩選出的探針組合物的核苷酸序列見(jiàn)表2。表2引物和探針序列3、熒光檢測(cè)：選用20μl的實(shí)時(shí)熒光pcr反應(yīng)擴(kuò)增體系，反應(yīng)體系見(jiàn)表3。表3pcr反應(yīng)體系試劑名稱工作濃度用量(μl)終濃度taqmanmastermix2×101×通用上游引物fritillariaf5μm10.25μm通用下游引物fritillariar5μm10.25μm川貝母特異探針fritillariap11μm10.05μm偽品貝母特異探針fritillariawp2μm10.10μm貝母通用探針fritillariaup5μm10.25μmdna模板0.5～50ng/μl21～100ng雙蒸水6總體積204、pcr擴(kuò)增條件為：95℃，2min；95℃，10s；58℃，35s，在此收集熒光信號(hào)，40個(gè)循環(huán)。5、結(jié)果分析：每次試驗(yàn)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及空白對(duì)照，試驗(yàn)結(jié)束后打開(kāi)分析軟件，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，給出δrn(第n個(gè)循環(huán)時(shí)的熒光增加值)與擴(kuò)增曲線ct值，根據(jù)探針熒光信號(hào)及擴(kuò)增曲線ct值來(lái)判定待測(cè)樣品是否為川貝母。結(jié)果見(jiàn)圖1，fam、joe熒光修飾探針有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足ct≤35說(shuō)明待檢樣本為川貝母正品；圖2顯示rox、joe熒光修飾探針同時(shí)有擴(kuò)增曲線時(shí)，且滿足ct≤35說(shuō)明待檢樣本為偽品貝母。實(shí)施例2特異性驗(yàn)證利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針組合物，分別以暗紫貝母、平貝母、新疆貝母、伊犁貝母、藍(lán)花貝母、青貝、松貝、爐貝、白術(shù)、人參、黨參、生地、石斛、山藥、雞血藤、枸杞、柴胡等植物總基因組dna為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)，驗(yàn)證其引物和探針的特異性。其結(jié)果見(jiàn)表4及圖3和圖4，結(jié)果表明本研究所設(shè)計(jì)的探針組合物及引物具有很強(qiáng)的特異性。表4特異性驗(yàn)證試驗(yàn)注：n為陰性實(shí)施例3靈敏度實(shí)驗(yàn)將川貝母的基因組dna定量到50ng，按5×梯度稀釋，每個(gè)梯度均取2.0μl為模板量，(即：10ng、2ng、0.4ng、0.08ng、0.016ng)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)，評(píng)估本發(fā)明的檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)圖5、圖6、圖7，表明本方法定量檢測(cè)限為0.08ng，說(shuō)明本發(fā)明所提供的方法具有很高的靈敏度。實(shí)施例4實(shí)際樣本測(cè)試使用本發(fā)明提供的試劑盒及檢測(cè)方法對(duì)18份貝母樣品檢測(cè)，并用測(cè)序結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示本方法與測(cè)序結(jié)果完全一致，本發(fā)明設(shè)計(jì)的方法，能夠在1.5小時(shí)內(nèi)完成對(duì)樣本的準(zhǔn)確快速鑒別，且靈敏度高，相比形態(tài)學(xué)及液相方法更加準(zhǔn)確可靠，靈敏、快速。實(shí)際樣本測(cè)試統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。表5實(shí)際樣本測(cè)試注：n為陰性上述雖然結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。sequencelisting<110>山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心<120>一種用于鑒定川貝母及偽品的熒光pcr檢測(cè)引物、探針組合物、試劑盒及檢測(cè)方法與應(yīng)用<130>2017<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gcagaatcccgtgaaccatc20<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<400>2tccgtccaccactcgtcg18<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3ccaatgacccttcgggtgcg20<210>4<211>18<212>dna<213>人工序列<400>4ctcgtgtgcggcgggctt18<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5actggccctccgtgcctcgt20當(dāng)前第1頁(yè)12