一種細(xì)菌的現(xiàn)場快速可視化檢測方法及其試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別涉及一種細(xì)菌的現(xiàn)場快速可視化檢測方法及其試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌是一類重要的病原體，它們侵入機(jī)體后會分泌產(chǎn)生大量的生物毒素，從而破 壞機(jī)體的結(jié)構(gòu)和功能，造成宿主感染，引發(fā)諸如破傷風(fēng)、肺結(jié)核、膿毒癥等多種疾病。細(xì)菌種 類繁多，包括金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌等多個菌屬，且分布廣泛，與人類生 活關(guān)系密切。近年來，由于飲用水、食物及生物醫(yī)療制劑的污染，由病原細(xì)菌引起的感染疾 病已成為危害人類身體健康的重要因素，引起了全球性的廣泛關(guān)注。因此為開展相關(guān)疾病 的早期診斷，保護(hù)人民的身體健康，研宄細(xì)菌的快速分析檢測技術(shù)具有非常重要的意義。
[0003] 目前，細(xì)菌的檢測技術(shù)主要有細(xì)菌培養(yǎng)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR)法。細(xì)菌培養(yǎng)法是目前檢測細(xì)菌最常用的分析方法，主要依據(jù)細(xì)菌的形態(tài)及 生理生化反應(yīng)特征來完成待檢細(xì)菌的分析檢測。PCR法是通過對待檢細(xì)菌染色體分子的擴(kuò) 增和DNA分型來實(shí)現(xiàn)細(xì)菌的分析檢測。
[0004] 然而，細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR法都存在著各自的缺點(diǎn)。細(xì)菌培養(yǎng)法的耗時較長（幾天 時間），且操作繁瑣，靈敏度低，穩(wěn)定性差，尤其是較長的培養(yǎng)時間給早期細(xì)菌感染疾病的臨 床診斷和指導(dǎo)用藥帶來了嚴(yán)重不便。PCR法的成本及技術(shù)水平要求高，且操作繁瑣，需經(jīng)過 細(xì)菌裂解、核酸提取及擴(kuò)增等多個步驟。另外，雖然相比傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法，PCR法已大大 縮短了細(xì)菌的檢測周期（6-10小時），但還是難以滿足實(shí)際臨床現(xiàn)場快速檢測的需求。
[0005] 因此，針對上述細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR法存在的不足之處，建立了一種簡便的細(xì)菌現(xiàn) 場快速可視化檢測技術(shù)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種細(xì)菌的現(xiàn)場快速可視化檢測方法及其試劑盒。該檢 測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，與細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR法相比，本發(fā)明所建立的細(xì)菌檢測技術(shù)具 有快速、操作簡單及結(jié)果肉眼可見的優(yōu)點(diǎn)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0008] 本發(fā)明提供了一種細(xì)菌的檢測方法，包括如下步驟：
[0009] 將檢測樣品與Cu2+、炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒（AuNPs)混合，孵育，觀 察溶液顏色的變化，獲得細(xì)菌濃度。
[0010] 細(xì)菌代謝的相關(guān)研宄發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌表面存在著一系列的氧化還原體系，可以快速完 成不同價態(tài)金屬離子（如Cu2+到Cu+)間的轉(zhuǎn)化，從而避免過高濃度的高價態(tài)金屬離子對其 本身產(chǎn)生毒害作用。本發(fā)明利用細(xì)菌此獨(dú)特的氧化還原性質(zhì)，通過細(xì)菌還原Cu2+引發(fā)點(diǎn)擊 反應(yīng)（Cu+催化的疊氮-炔基環(huán)加成反應(yīng)）的策略，促使炔基及疊氮基團(tuán)修飾的金納米顆粒 間發(fā)生交聯(lián)團(tuán)聚，進(jìn)而通過納米金溶液顏色的變化（由紅到藍(lán)）實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的現(xiàn)場快速可 視化檢測。
[0011] 本發(fā)明通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了本發(fā)明提供的檢測方法可檢測出IO3CFUAiL及以上的細(xì)菌 濃度。檢測細(xì)菌濃度的方法為：
[0012] 溶液顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色，檢測樣品的細(xì)菌濃度彡IO3CFUAiL ;
[0013] 溶液顏色無肉眼可識別的變化，檢測樣品的細(xì)菌濃度< 103CFU/mL。
[0014] 作為優(yōu)選，Cu2+的濃度為1~10 μ Μ。
[0015] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，Cu2+的濃度為5 μ Μ。
[0016] 作為優(yōu)選，炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒的濃度為1~20ηΜ。
[0017] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒的濃度為 5· 4ηΜ〇
[0018] 作為優(yōu)選，孵育的時間為10~30min。
[0019] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，孵育的時間為20min。
[0020] 作為優(yōu)選，孵育的溫度為20~40°C。
[0021] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，孵育的溫度為室溫（25°C )。
[0022] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒的制備方法 為：
[0023] 采用有機(jī)合成方法制得巰基修飾的炔基功能分子；
[0024] 采用有機(jī)合成方法制得巰基修飾的疊氮功能分子；
[0025] 疏基修飾的炔基功能分子、疏基修飾的疊氮功能分子分別和金納米顆粒通過疏基 置換反應(yīng)制得炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒。
[0026] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，巰基修飾的炔基功能分子的一端為巰基，另一端 為炔基基團(tuán)。
[0027] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，巰基修飾的疊氮功能分子的一端為巰基，另一端 為萱氣基團(tuán)。
[0028] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，巰基修飾的炔基功能分子的制備方法為：
[0029] 三苯基氯甲烷與巰基烷酸反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物1 ;
[0030] NHS(N-羥基琥珀酸亞胺）、DCC(二環(huán)己基碳二亞胺）與中間產(chǎn)物1反應(yīng)，得到中 間產(chǎn)物2 ;
[0031] 中間產(chǎn)物2與2, 2' -(乙烯二氧）雙乙胺反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物3 ;
[0032] 丙炔酸、EDC(l-(3_二甲氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺）與中間產(chǎn)物3反應(yīng)，得到 中間產(chǎn)物4 ;
[0033] 中間產(chǎn)物4經(jīng)巰基脫保護(hù)后獲得巰基修飾的炔基功能分子。
[0034] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，巰基烷酸為巰基十一烷酸。但本發(fā)明所用巰基烷 酸并非限定于此，巰基烷酸可用其他不同C鏈的巰基烷酸代替，C鏈長度從6 (巰基己烷酸） 到11(巰基十一烷酸）均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0035] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，巰基修飾的疊氮功能分子的制備方法為：
[0036] 3-溴丙酸和疊氮化鈉反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物5 ;
[0037] 中間產(chǎn)物5與EDC、中間產(chǎn)物3反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物6 ;
[0038] 中間產(chǎn)物6經(jīng)巰基脫保護(hù)后獲得巰基修飾的疊氮功能分子。
[0039] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，細(xì)菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌 或銅綠假單胞菌中的一種或兩者以上的混合物。但本發(fā)明能夠檢測的細(xì)菌并非限定于此， 由于細(xì)菌的表面均存在氧化還原體系，因此本發(fā)明同樣適用于其它種類的細(xì)菌。
[0040] 作為優(yōu)選，金納米顆粒采用化學(xué)還原法、微乳液法或晶種生長法合成。
[0041] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，金納米顆粒采用化學(xué)還原法合成。
[0042] 本發(fā)明還提供了一種細(xì)菌檢測試劑盒，包括Cu2+、炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米 顆粒。
[0043] 作為優(yōu)選，Cu2+的濃度為1~10 μ M。
[0044] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，Cu2+的濃度為5 μ Μ。
[0045] 作為優(yōu)選，炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒的濃度為1~20ηΜ。
[0046] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒的濃度為 5· 4ηΜ〇
[0047] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒的制備方法 為：
[0048] 采用有機(jī)合成方法制得巰基修飾的炔基功能分子；
[0049] 采用有機(jī)合成方法制得巰基修飾的疊氮功能分子；
[0050] 疏基修飾的炔基功能分子、疏基修飾的疊氮功能分子分別和金納米顆粒通過疏基 置換反應(yīng)制得炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒。
[0051] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，巰基修飾的炔基功能分子的制備方法為：
[0052] 三苯基氯甲烷與巰基烷酸反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物1 ;
[0053] NHS、DCC與中間產(chǎn)物1反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物2 ;
[0054] 中間產(chǎn)物2與2, 2' -(乙烯二氧）雙乙胺反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物3 ;
[0055] 丙炔酸、EDC與中間產(chǎn)物3反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物4 ;
[0056] 中間產(chǎn)物4經(jīng)巰基脫保護(hù)后獲得巰基修飾的炔基功能分子。
[0057] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，巰基烷酸為巰基十一烷酸。但本發(fā)明所用巰基烷 酸并非限定于此，巰基烷酸可用其他不同C鏈的巰基烷酸代替，C鏈長度從6 (巰基己烷酸） 到11(巰基十一烷酸）均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0058] 在本發(fā)明提供的一些實(shí)施例中，巰基修飾的疊氮功能分子的制備方法為：
[0059] 3-溴丙酸和疊氮化鈉反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物5 ;
[0060] 中間產(chǎn)物5與EDC、中間產(chǎn)物3反應(yīng)，得到中間產(chǎn)物6 ;
[0061] 中間產(chǎn)物6經(jīng)巰基脫保護(hù)后獲得巰基修飾的疊氮功能分子。
[0062] 本發(fā)明提供了一種細(xì)菌的現(xiàn)場快速可視化檢測方法及其試劑盒。該檢測方法包 括：將檢測樣品與Cu2+、炔基和疊氮基團(tuán)功能化的金納米顆粒（AuNPs)混合，孵育，觀察溶液 顏色的變化，獲得細(xì)菌濃度。本發(fā)明至少具有如下優(yōu)勢之一：
[0063] 由于點(diǎn)擊反應(yīng)及細(xì)菌還原Cu2+的過程都具有很強(qiáng)的選擇性，因此，通過此點(diǎn)擊反 應(yīng)輔助的納米金比色法可以大大提高細(xì)菌的檢測特異性，不受樣品介質(zhì)的影響；
[0064] 由于極其微量的Cu+就可以引發(fā)點(diǎn)擊反應(yīng)，因此相比于普通的納米金比色法，此方 法也具有更高的細(xì)菌檢測靈敏度，檢測限可達(dá)IO3CFUAiL ;
[0065] 與細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR法相比，本發(fā)明所建立的細(xì)菌檢測技術(shù)具有快速（20分鐘）、 操作簡單（簡單混合，無需復(fù)雜儀器輔助）及結(jié)果肉眼可見（通過AuNPs溶液顏色的變化） 的優(yōu)點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)對細(xì)菌的現(xiàn)場快速可視化檢測。
【附圖說明】
[0066] 圖1示實(shí)施例1制備得到的AuNPs的透射電鏡圖；
[0067] 圖2示本發(fā)明基于點(diǎn)擊反應(yīng)輔助的納米金比色法的細(xì)菌現(xiàn)場快速可視化檢測結(jié) 果；
[0068] 圖3示E. coli樣品的現(xiàn)場快速可視化檢測；其中，A示孵育前溶