一種測定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物留醇檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種測定甘蔗中不同形式植物留醇含量 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物甾醇是自然界中的一類甾族化合物，屬于飽和（或不飽和）的仲醇。植物甾 醇因具有降膽固醇功效，近年來受到廣泛的關(guān)注。此外，植物留醇還具有抑制腫瘤、防治心 臟病、抗癌、調(diào)節(jié)免疫功能的作用，被科學(xué)界譽為"生命的鑰匙"。
[0003] 植物留醇在甘蔗中主要以游離態(tài)（FS)和結(jié)合態(tài)存在，其中，結(jié)合態(tài)包括與脂肪 酸結(jié)合成的酯（SE)、與糖類的羥基形成糖苷鍵的配糖類物質(zhì)（SG)以及?；涮穷惢衔?(ASG) 〇
[0004]目前，留醇的主要分析方法有稱重法、高效液相色譜法、氣相色譜法、毛細(xì)管電泳 法等，但是，對于甘蔗中不同形式留醇的檢測方法還鮮有報道。
[0005] 2007年武曉云在其碩士論文中，利用皂化法對甘蔗糖廠濾泥中的植物留醇進(jìn)行了 提取和測定，粗植物留醇的提取率為8. 4~15. 5%。。目前國內(nèi)大部分研宄，針對甘蔗中植物 甾醇提取方法進(jìn)行研宄，對植物留醇含量精確測定鮮有報道。2009年韓軍花等人利用氣相 色譜對50種常見食用植物藥材及中草藥植物中留醇的含量進(jìn)行測定。然而，利用氣相色譜 需對植物留醇進(jìn)行衍生化等操作，檢測過程較繁瑣。
[0006] 上述文獻(xiàn)中測定留醇含量的方法主要采用先進(jìn)行留醇提取，后對提取液進(jìn)行測定 的技術(shù)路線，造成提取的留醇不完整，留醇含量測定不準(zhǔn)確，而且耗費較多溶劑和檢測時 間。此外，上述分析方法只包含堿式皂化，不能破壞糖苷鍵，SG或ASG因結(jié)合了葡萄糖分子 而使其不能同時與FS溶解在非極性的萃取劑中，使得SG和ASG在測定中往往被低估。
[0007] 因此，有必要探宄一種新的植物留醇檢測方法，以解決上述問題，實現(xiàn)不同形式植 物甾醇含量的準(zhǔn)確測定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明提供了一種測定甘蔗中不同形式植物甾醇含量的方法，該方法能夠準(zhǔn)確測 定甘蔗中自由態(tài)和結(jié)合態(tài)植物留醇的含量，具有提取率高、檢測速度快、檢測準(zhǔn)確度高、溶 劑消耗量少的特點。
[0009] -種測定甘蔗中不同形式植物留醇含量的方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴通過乙醇浸提，從甘蔗粉末中提取得到游離態(tài)甾醇提取物；
[0011] (2)通過堿式皂化反應(yīng)，將甘蔗粉末中酯態(tài)留醇轉(zhuǎn)化為游離態(tài)留醇，并萃取得到含 游離態(tài)留醇以及酯態(tài)留醇對應(yīng)當(dāng)量留醇的總提取物；
[0012] ⑶將甘蔗粉末置于酸性溶液中進(jìn)行酸水解反應(yīng)，再向酸解反應(yīng)液中加入堿性溶 液進(jìn)行皂化反應(yīng)，將甘蔗粉末中酯態(tài)留醇、配糖類留醇和酰基配糖類留醇轉(zhuǎn)化為游離態(tài)甾 醇，并萃取得到含游離態(tài)留醇以及酯態(tài)留醇、配糖類留醇和?；涮穷惲舸紝?yīng)當(dāng)量甾醇 的總提取物；
[0013] (4)利用高效液相色譜技術(shù)測定步驟（1)~（3)中提取物的含量，計算得到甘蔗中 酯態(tài)留醇的含量以及糖類留醇和?；涮穷惲舸嫉目偤?。
[0014] 酸式水解指利用鹽酸乙醇溶液，通過水解反應(yīng)破壞結(jié)合態(tài)留醇中的糖苷鍵，使配 糖類留醇和?；涮穷惲舸嫁D(zhuǎn)化為游離態(tài)留醇；堿式皂化指利用KOH乙醇溶液進(jìn)行皂化反 應(yīng)，破壞結(jié)合態(tài)留醇中的酯鍵，使酯態(tài)留醇轉(zhuǎn)化為游離態(tài)甾醇。
[0015] 步驟⑴中，乙醇浸提的溫度為30°C，浸提時間為4小時，浸提過程中不斷振蕩頻 率為130次/min，以提高浸提效率和提取物含量。浸提結(jié)束后，過濾，收集濾液，蒸干后溶解 在甲醇中，濾膜過濾待測。
[0016] 步驟（2)中，采用的堿性溶液為氫氧化鉀-乙醇溶液，皂化反應(yīng)的溫度為70°C，時 間為lh，并采用乙醚萃取，獲得提取物。
[0017] 步驟⑶中，所述酸性溶液為鹽酸-乙醇溶液，所述堿性溶液為氫氧化鉀-乙醇溶 液。通過實驗發(fā)現(xiàn)，采用鹽酸-乙醇溶液酸解、氫氧化鉀-乙醇溶液皂化的組合方式獲得的 提取物的含量能更加接近真實值。
[0018] 所述甘蔗是指甘蔗的各組織，如：甘蔗皮、甘蔗莖、甘蔗節(jié)和甘蔗鞘，本發(fā)明方法適 用于甘蔗單獨的某一組織，也可適用于完整的甘蔗。
[0019] 為進(jìn)一步提高提取效果，本發(fā)明對上述溶液的用量做了進(jìn)一步優(yōu)化，并得到最佳 的反應(yīng)條件。
[0020] 作為優(yōu)選，所述鹽酸-乙醇溶液的用量為32 X KT3~48 X l(T3mol/g。所述氫氧化 鉀-乙醇溶液的用量為64X KT3~96X l(T3m〇l/g。從實施例1、4、5可以看出，鹽酸-乙醇 溶液為40 X l(T3mol/g，氫氧化鉀-乙醇溶液為80 X l(T3mol/g時，提取物的檢測結(jié)果更接近 真實值。
[0021] 作為優(yōu)選，所述酸水解反應(yīng)的溫度為60~80°C，時間為1~I. 5h ;所述皂化反應(yīng) 的溫度為70~90°C，時間為1~I. 5h。
[0022] 經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，酸水解反應(yīng)與皂化反應(yīng)的反應(yīng)條件，尤其是反應(yīng)溫度，存在協(xié)同作 用，只有適宜的條件組合下才能使最終測定結(jié)果更接近真實值，進(jìn)一步優(yōu)選，所述酸水解反 應(yīng)的溫度為70°C，時間為Ih ;所述皂化反應(yīng)的溫度為70°C，時間為lh。
[0023] 采用內(nèi)標(biāo)法檢測提取產(chǎn)物可提高檢測的準(zhǔn)確度，作為優(yōu)選，步驟（3)中，酸性溶液 中還添加有內(nèi)標(biāo)物，所述內(nèi)標(biāo)物為6-酮膽留烷醇陽-ketocholestanol)。經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，以 5 α -膽留烷作為內(nèi)標(biāo)物時，5 α -膽留烷與雜質(zhì)峰重合，導(dǎo)致植物留醇濃度的低估；而采用 6-酮膽留烷醇作為內(nèi)標(biāo)物，出峰分離條件良好，回收率高，說明內(nèi)標(biāo)物的選擇對待測提取物 檢測的準(zhǔn)確性影響較大。
[0024] 作為優(yōu)選，步驟（3)中，萃取過程采用的萃取劑為乙醚。雖然乙醚為常規(guī)萃取劑的 一種，但不同萃取劑類型對提取效果以及最終的檢測結(jié)果有影響，與內(nèi)標(biāo)物的類型也有關(guān) 聯(lián)。從實施例1和9中，可以發(fā)現(xiàn)，采用乙醚效果最佳。
[0025] 色譜條件的確定是決定檢測結(jié)果優(yōu)劣的另一重要因素，各條件參數(shù)的略微調(diào)整， 對檢測結(jié)果都有巨大影響，作為優(yōu)選，步驟（4)中，高效液相色譜的條件為：色譜柱為Luan 5ymC18,流動相為甲醇：乙腈=4 : l，1.2mL/min，進(jìn)樣量20yL，柱溫30°C，檢測波長 210nm〇
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0027] (1)本發(fā)明方法將甘蔗樣品中植物留醇進(jìn)行酸式水解和堿式皂化后，萃取獲得含 有游離態(tài)留醇、酯態(tài)留醇、配糖類留醇和?；涮穷惲舸嫉奶崛∥铮⑴浜犀F(xiàn)有的植物甾醇 提取方法分別獲得含游離態(tài)留醇的提取物以及含游離態(tài)留醇和酯態(tài)留醇的提取物，通過 高效液相色譜技術(shù)獲得上述提取物的含量，并計算得到甘蔗樣品中不同形式植物留醇的含 量。
[0028] (2)本發(fā)明方法選擇鹽酸-乙醇溶液和氫氧化鉀-乙醇溶液的酸堿組合形式，確定 了先進(jìn)行酸式水解，后進(jìn)行堿式皂化的實驗操作順序，通過優(yōu)化條件，確定最佳反應(yīng)溫度、 反應(yīng)時間和反應(yīng)液用量，選擇6-酮膽留烷醇作為內(nèi)標(biāo)，乙醚作為萃取劑，并配合優(yōu)化的高 效液相色譜條件，顯著提高了提取效率和檢測的準(zhǔn)確性。
【附圖說明】
[0029] 圖1為實施例1甘蔗皮內(nèi)各形式植物甾醇的HPLC檢測圖譜；
[0030] A為游離態(tài)甾醇（FS) ;B為游離態(tài)甾醇（FS)和酯態(tài)甾醇（SE) ;C為游離態(tài)甾醇 (FS)、酯態(tài)留醇（SE)、配糖類留醇（SG)和?；涮穷惲舸迹ˋSG)。
[0031] 圖2為豆甾醇和β-谷甾醇的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡釋，本實施例根據(jù)發(fā)明技術(shù)方案進(jìn)行實 施，給出了詳細(xì)的實施方式和操作步驟，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于下述的實施例。下列 實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件。
[0033] 本發(fā)明對步驟（1)~（3)均做了反應(yīng)條件的優(yōu)化，下列實施例中的步驟（1)和（2) 為優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件。
[0034] 下列實施例中標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法，具體如下：分別稱量6-酮膽甾烷醇，谷甾 醇和豆留醇的標(biāo)準(zhǔn)品，加入甲醇溶解，搖勻配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液；取各 標(biāo)準(zhǔn)品溶液和6-酮膽留烷醇加甲醇稀釋，將6-酮膽留烷醇作為內(nèi)標(biāo)，濃度控制在10 μ g/ mL，β-谷甾醇和豆甾醇濃度為5，10,20,40和80yg/mL。將β-谷甾醇和豆甾醇的峰面積 與6-酮膽留烷醇的峰面積的比值作為縱坐標(biāo)，將β -谷留醇和豆留醇的濃度與6-酮膽甾 烷醇的濃度的比值作為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。6-酮膽留烷醇，β-谷留醇和豆留醇的保留時 間分別是 6. 872,16. 525 和 14. 677min。
[0035] 實施例1
[0036] -種測定甘蔗中不同形式植物留醇含量的方法，具體步驟如下：
[0037] (1)將紅甘蔗的皮30°C干燥18h后直到質(zhì)量不在發(fā)生變化，粉碎，過篩，獲得60目 的甘蔗粉末；取Ig的甘蔗粉末加入到IOmL的乙醇中進(jìn)行浸提，再加入120 μ g 6-酮膽甾烷 醇作為內(nèi)標(biāo)，30°C下，130次/min振蕩浸提液4h，過濾，收集濾液，蒸干后，溶解在IOmL的甲 醇中，用〇.45μπι濾膜過濾，獲得含游離態(tài)留醇（FS)的第一提取物；
[0038] (2)將紅甘蔗的皮30°C干燥18h后直到質(zhì)量不在發(fā)生變化，粉碎，過篩，獲得60目 的甘蔗粉末；取〇. 5g的甘蔗粉末加入到5mL 4. Omol/L的KOH乙醇溶液中進(jìn)行皂化，再加入 120 μ g 6-酮膽留烷醇作為內(nèi)標(biāo)，70°C回流皂化Ih后，用IOmL乙醚提取兩次，收集乙醚層， 并用蒸餾水洗至中性，用無水NaSO4除水，蒸干后溶解在25mL甲醇中，用0. 45 μ m濾膜過濾， 獲得含游離態(tài)留醇（FS)和酯態(tài)留醇（SE)的第二提取物；
[0039] (3)將紅甘蔗的皮30°C干燥18h后直到質(zhì)量不在發(fā)生變化，粉碎，過篩，獲得60 目的甘蔗粉末；取〇. 5g的甘蔗粉末加入到5mL 4. Omol/L的HCl乙醇溶液（酸用量為 40X l(T3mol/g)中進(jìn)行酸水解，再加入120 μ g 6-酮膽留烷醇作為內(nèi)標(biāo)，70°C酸水解Ih后， 冷卻至室溫，加入10mL4. Omol/L KOH乙醇溶液（堿用量為80 X 10_3mol/g)，70°C回流皂化 Ih后，用IOmL乙醚提取兩次，收集乙醚層，并用蒸餾水洗至中性，用無水NaSO4除水，蒸干后 溶解在25mL甲醇中，用0. 45 μ m濾膜過濾，獲得含游離態(tài)留醇（FS)、酯態(tài)留醇（SE)、配糖類 甾醇（SG)和酰基配糖類留醇（ASG)的第三提取物；
[0040] (4)利用高效液相色譜技術(shù)測定步驟（1)~（3)中提取物的含量，高效液相色譜的 具體條件為：選用LC-2010型號的色譜儀（美國Agilent Technologies)，色譜柱采用Luan 5ymC18色譜柱（250mmX4. 6mm;菲羅門公司）；采用等度洗脫方式，流動相為甲醇：乙腈= 4 : 1，流速為I. 2mL/min，柱溫為30°C，檢測波長為210nm，待基線穩(wěn)定后，進(jìn)樣20 μ 1 ;繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線，再通過標(biāo)準(zhǔn)曲線得到上述第一、二、三提取物的含量，第一提取物的含量為游離 態(tài)甾