一種篩選分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，特別涉及一種篩選分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]1975年德國學(xué)者Kohler和Milstein發(fā)明了雜交瘤技術(shù)。他們成功將骨髓瘤細(xì)胞和產(chǎn)生抗體的B淋巴細(xì)胞融合為雜交瘤細(xì)胞，這種合成的雜交瘤細(xì)胞可產(chǎn)生只針對某一特定抗原決定簇的單克隆抗體。雜交瘤技術(shù)的的創(chuàng)建，開創(chuàng)了抗體制備的新紀(jì)元，為臨床疾病的診斷、預(yù)防和治療提供了新的工具，促進(jìn)了免疫學(xué)、基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)等眾多學(xué)科的發(fā)展。
[0003]單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高、少或無交叉反應(yīng)等特性，已廣泛應(yīng)用于疾病的診斷、特異性抗原或蛋白的檢測和鑒定、疾病的被動(dòng)免疫治療和生物導(dǎo)向制藥的制備等。單克隆抗體在理論和實(shí)踐上的應(yīng)用，成為解決生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等諸多重大問題的重要手段。
[0004]盡管單克隆抗體具有重要的作用，可傳統(tǒng)的單克隆抗體制備過程中雜交瘤細(xì)胞的篩選比較繁瑣。融合后的雜交瘤經(jīng)HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)一周后，然后將每個(gè)板孔中的細(xì)胞上清取出來，通過ELISA檢測其是否分泌特異性抗體，是否為分泌能力強(qiáng)的抗體，若檢測出為陽性且分泌能力強(qiáng)的細(xì)胞，則需要把此陽性細(xì)胞至少進(jìn)行三次亞克隆，才能得到陽性單克隆雜交瘤細(xì)胞株。這種方法不僅耗時(shí)耗力，還具有以下幾個(gè)缺點(diǎn):(I)在多細(xì)胞克隆(融合孔)孔篩選時(shí)，ELISA方法僅能評(píng)價(jià)孔內(nèi)是否含有陽性克隆，不能評(píng)價(jià)宄竟哪個(gè)克隆是陽性克??；(2)在克隆化過程中，ELISA僅能評(píng)價(jià)細(xì)胞孔內(nèi)所有細(xì)胞分泌抗體后的總體情況，不能直接評(píng)價(jià)板孔中的細(xì)胞變異情況，需經(jīng)再次克隆化后才能大致反推評(píng)價(jià)前代原始孔中細(xì)胞的變異情況；(3)在再次克隆化過程中，ELISA結(jié)合有限稀釋法克隆細(xì)胞時(shí)，僅留下極少量的細(xì)胞(50-100個(gè)細(xì)胞)用于鋪板篩選，而大部分的細(xì)胞被拋棄了，在這個(gè)過程中，由于細(xì)胞變異和競爭，強(qiáng)陽性細(xì)胞很可能被漏選；(4)單個(gè)雜交瘤細(xì)胞孔經(jīng)過數(shù)次克隆化后，將產(chǎn)生大量的需處理和檢測細(xì)胞孔，工作量龐大，瑣碎。以上這些因素都不利于陽性細(xì)胞株的篩選。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明首要的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種篩選分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的方法。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供所述篩選分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的方法的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種篩選分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的方法，包括如下步驟:
[0008](I)將 01eyl-PEG4000-NHS 與抗原偶聯(lián)，得到 01eyl-PEG4000-NHS_Ag ；
[0009](2)將待篩選的雜交瘤細(xì)胞克隆清洗；接著加入01eyl-PEG4000-NHS-Ag，37°C、5% CO2培養(yǎng)；然后棄上清，清洗雜交瘤細(xì)胞克隆；
[0010](3)將熒光物質(zhì)標(biāo)記的抗鼠二抗加入到步驟(2)處理好的雜交瘤細(xì)胞克隆，37°C、5% CO2培養(yǎng)；然后棄上清，清洗雜交瘤細(xì)胞克??；
[0011](4)加入不完全培養(yǎng)基，用倒置熒光顯微鏡觀察可見光和熒光下的細(xì)胞團(tuán)，并拍照做好陰陽性的標(biāo)記；
[0012](5)在含有陽性細(xì)胞團(tuán)的板孔中加入甲基纖維素半固體培養(yǎng)基，觀察位置并做好標(biāo)記，將陽性標(biāo)記細(xì)胞移入到新的細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，得到分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。
[0013]步驟(I)中所述的抗原優(yōu)選為呋喃唑酮代謝物(AOZ)或肌酸激酶同工酶(CKMB)。
[0014]所述的呋喃唑酮代謝物優(yōu)選為衍生的CPA0Z。
[0015]步驟(I)中所述的偶聯(lián)可為常規(guī)的偶聯(lián)方法，當(dāng)抗原是非完全抗原時(shí)，先將01eyl-PEG4000-NHS與載體蛋白偶聯(lián)，再與抗原偶聯(lián)；當(dāng)抗原是完全抗原時(shí)，將01eyl-PEG4000-NHS與抗原偶聯(lián)即可。偶聯(lián)的具體步驟優(yōu)選如下:當(dāng)所述的抗原為呋喃挫酮代謝物，將01eyl-PEG4000-NHS與BSA偶聯(lián)后，再與呋喃唑酮代謝物衍生物偶聯(lián)；當(dāng)所述的抗原為肌酸激酶同工酶，將01eyl-PEG4000-NHS直接與肌酸激酶同工酶直接偶聯(lián)。
[0016]步驟(2)中所述的01eyl-PEG4000-NHS-Ag的加入量優(yōu)選為按48孔板的每孔添加
0.0lmg 計(jì)算。
[0017]步驟⑵中所述的培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為30?90min ;更優(yōu)選為60min。
[0018]步驟(3)中所述的熒光物質(zhì)包括異硫氰酸熒光素(FITC)、四乙基羅丹明(RB200)和四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)。
[0019]步驟(3)中所述的抗鼠二抗優(yōu)選為羊抗鼠IgGFc 二抗。
[0020]步驟(3)中所述的培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為30?60min ;更優(yōu)選為40min。
[0021]步驟(2)和(3)中所述的清洗優(yōu)選通過磷酸鹽緩沖液(PBS)或是不完全培養(yǎng)基進(jìn)行清洗。
[0022]所述的不完全培養(yǎng)基的組成如下:鏈霉素和青霉素混合液與RPMI1640培養(yǎng)基按體積比1:99配比混合得到，其中，鏈霉素和青霉素混合液中，鏈霉素和青霉素的濃度分別為 lU/mlo
[0023]步驟(5)中所述的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基優(yōu)選為通過如下步驟得到:將RPMI1640培養(yǎng)基和質(zhì)量體積比2.7%的甲基纖維素溶液按體積比1:1混合均勻，得到甲基纖維素半固體培養(yǎng)基。
[0024]步驟(5)中所述的甲基纖維素半固體培養(yǎng)基的體積用量優(yōu)選為相當(dāng)于步驟(4)中所述的不完全培養(yǎng)基的體積的4/3倍。
[0025]所述的篩選分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞的方法在免疫學(xué)領(lǐng)域中進(jìn)行應(yīng)用，用于快速篩選得到分泌特異性單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞。
[0026]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明通過一種兩親性物質(zhì)(01eyl-PEG4000-NHS)能夠快速簡便篩選分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞，縮短陽性細(xì)胞株的篩選時(shí)間，減少克隆化的次數(shù)和陽性細(xì)胞株的丟失，準(zhǔn)確率高。01eyl-PEG4000-NHS是一種兩親性物質(zhì)，其一端是親脂性的，能與細(xì)胞膜結(jié)合，另一端的PEG聚合物是親水性的，其末端連接的-COO-NHS是經(jīng)NHS活化過的羧基，可以與抗原上的氨基相結(jié)合，細(xì)胞克隆化后培養(yǎng)4-5天后，先用不完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，可以把原有的抗體洗去，排除了假陽性；把偶聯(lián)的特定抗原偶聯(lián)物加入到相應(yīng)的細(xì)胞，孵育后偶聯(lián)物的一端連接到細(xì)胞膜上，偶聯(lián)的抗原與分泌的抗體結(jié)合，洗去未結(jié)合的抗體，加入熒光二抗孵育，洗去未結(jié)合的二抗，觀察熒光，做好標(biāo)記，加入甲基纖維素半固體培養(yǎng)基直接挑取有熒光的挑選細(xì)胞。直接能挑取陽性細(xì)胞，克隆化時(shí)不易漏選強(qiáng)陽性細(xì)胞株。進(jìn)行2-3次克隆陽性率就能達(dá)到90%以上的，這種方法半個(gè)月內(nèi)就能篩選到陽性細(xì)胞株，縮短篩選的時(shí)間；可精準(zhǔn)評(píng)價(jià)孔內(nèi)每個(gè)細(xì)胞的抗體分泌情況和細(xì)胞克隆的變異情況，結(jié)合半固體培養(yǎng)基有利于挑選到穩(wěn)定的陽性細(xì)胞株；再次克隆化時(shí)不易漏選強(qiáng)陽性細(xì)胞株；而常規(guī)單克隆篩選一般至少需要一個(gè)月才能篩選到陽性細(xì)胞株，不能確定陽性克隆，克隆化時(shí)容易漏選陽性細(xì)胞株。
【附圖說明】
[0027]圖1 是 01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z 的 SDS-PAGE 檢測結(jié)果圖；其中，泳道 I 是 Marker，泳道 2 是 01eyl-PEG4000-NHS_BSA，泳道 3 是 BSA，泳道 4 是01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z。
[0028]圖2是01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z的紫外可見分光掃描檢測結(jié)果圖。
[0029]圖3 是 01eyl-PEG4000-NHS-CKMB 的 SDS-PAGE 檢測結(jié)果圖；其中，泳道 I 是 CKMB，泳道 2 是 Marker，泳道 3 是 01eyl-PEG4000-NHS_CKMB。
[0030]圖4是01eyl-PEG4000-NHS-CKMB的紫外可見分光掃描檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0032]實(shí)施例1
[0033](l)01eyl-PEG4000-NHS與抗原的偶聯(lián)和鑒定
[0034]I) 01eyl-PEG4000-NHS 與 BSA 的偶聯(lián)
[0035]稱取33mg BSA,溶于3.3mL 15mM、pH 7.4的PBS (下面所用的PBS同此處)中，攪拌器攪拌均勻，得到BSA溶液。接著稱取1mg 01eyl-PEG4000-NHS (購買于日本NF公司)，溶于ImL PBS，得到01eyl-PEG4000-NHS溶液。將01eyl-PEG4000_NHS溶液緩慢加入到攪拌狀態(tài)的BSA溶液中，常溫下攪拌3小時(shí)，得到01eyl-PEG4000-NHS-BSA溶液。
[0036]2) 01eyl-PEG4000-NHS-BSA 與 CPAOZ 的偶聯(lián)
[0037]①吸取500 μ I 01eyl-PEG4000-NHS-BSA溶液，加入到500 μ I PBS中，置于冰盒中攪拌。
[0038]②將衍生好的CPAOZ (按文獻(xiàn)“周克楠等.呋喃唑酮代謝物單克隆抗體及其新型免疫層析檢測試紙條的制備[J].中國生物制品學(xué)雜志，2014，7:017.”提供的方法制備得到)溶解后緩慢加入步驟①最終得到的的溶液中攪拌過夜，12h后3000rpm、4°C離心5min，取上清，用30KD的超濾管超濾，得到01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z。再進(jìn)行過濾除菌，置于4°C保存。
[0039]3) 01eyl-PEG4000-NHS-BSA 和 01eyl-PEG4000-NHS-BSA_CPA0Z 的鑒定
[0040]通過SDS-PAGE和紫外可見分光掃描進(jìn)行鑒定。SDS-PAGE電泳鑒定(如圖1所示)和紫外可見分光掃描鑒定(如圖2所示)的結(jié)果表明，的確獲得01eyl-PEG4000-NHS-BSA和 01eyl-PEG4000-NHS-BSA-CPA0Z。
[0041](2)呋喃唑酮代謝物(AOZ)雜交瘤細(xì)胞團(tuán)的篩選<