一種披堿草屬植物根尖染色體壓片方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及植物根尖染色體壓片方法，特別涉及一種披堿草屬植物根尖染色體壓片方法。
【背景技術(shù)】
[0002]披堿草屬(Elymus L.)是禾本科(Gramineae)小麥族(Triticeae)重要的多年生屬，該屬是小麥族植物中遺傳和物種多樣性較為豐富的類群，多數(shù)種質(zhì)飼用價(jià)值高，適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)，其基因組中含有普通小麥不具有的抗逆基因，可作為改良麥類作物的基因資源庫(kù)。
[0003]披堿草屬牧草在我國(guó)已經(jīng)廣泛種植，并在發(fā)展畜牧業(yè)和建設(shè)生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮了巨大作用。除了形態(tài)學(xué)研究，關(guān)于該屬的地理分布、細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)以及資源的評(píng)價(jià)與利用等方面的系統(tǒng)研究也十分必要，且對(duì)于了解披堿草屬物種的起源，植物多樣性以及遺傳育種和資源合理開(kāi)發(fā)等都有特別重要的意義。
[0004]有關(guān)披堿草屬植物細(xì)胞學(xué)方面的研究和報(bào)道都很少，國(guó)內(nèi)已有披堿草屬部分植物的核型報(bào)道，而對(duì)中國(guó)披堿草屬植物進(jìn)行核型進(jìn)化程度的研究及通過(guò)核型似近系數(shù)進(jìn)行聚類分析、探討其親緣關(guān)系方面的研究則屬空白。
[0005]染色體是基因的載體，遺傳育種中可用于人工創(chuàng)造新物種，培育或改良植物新品種。制備染色體標(biāo)本是基礎(chǔ)，優(yōu)良的染色體制片技術(shù)是進(jìn)行細(xì)胞染色體觀察和分析，進(jìn)行染色體顯帶、原位雜交等的先決條件，對(duì)于進(jìn)行染色體行為和細(xì)胞變異等遺傳現(xiàn)象的分析具有重要的意義。鑒定植物的染色體數(shù)目是染色體分析的一種非常重要的分析，根尖是有絲分裂的高發(fā)區(qū)，因而成為染色體計(jì)數(shù)常用的材料。
[0006]根尖染色體壓片法包括取材、預(yù)處理、固定、解離、軟化、染色、壓片和鏡檢，每一步的關(guān)鍵是適合的處理液和處理時(shí)間。目前，披堿草屬植物尚未有這方面的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供一種披堿草屬植物根尖染色體壓片方法，通過(guò)確定關(guān)鍵步驟的處理液及處理時(shí)間，為披堿草屬植物細(xì)胞學(xué)特征、遺傳機(jī)制、遺傳育種、基因定位等的深入研究提供標(biāo)本奠定基礎(chǔ)。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種披堿草屬植物根尖染色體壓片方法，其特征在于包括以下順序的步驟:
[0009]I)取材:篩選植物飽滿的種子，放入鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于22— 28°C的培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待根部長(zhǎng)到1.5cm時(shí)，于上午8:00— 9:00剪取根尖作為實(shí)驗(yàn)材料；
[0010]2)預(yù)處理:根尖用清水洗凈后，用刀片切取分生區(qū)部分0.5cm放入小瓶，然后向其中滴加飽和對(duì)二氯苯，室溫條件下處理6h ；
[0011]3)固定:將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的根尖用蒸餾水清洗干凈，然后放入卡諾固定液中，于室溫下固定24h ；
[0012]4)保存:固定后的根尖先用去蒸餾水徹底清洗干凈，然后放入70%酒精中，于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?br>[0013]5)解離:于2mL離心管中加入混合酶解液置于37°C水浴鍋中解離10 — 20min ;
[0014]6)染色:蒸餾水沖洗材料，用石炭酸品紅染液染色20— 40min ;
[0015]7)制片:于染色后的材料上蓋上蓋玻片，吸水紙包住后，鉛筆頭輕敲或拇指輕壓；
[0016]8)鏡檢:使用10倍顯微鏡找到所述材料的觀察目標(biāo)范圍，然后使用40倍顯微鏡尋找處于分裂期的細(xì)胞，拍攝圖片，然后再根據(jù)圖片對(duì)染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0017]步驟4)所述的混合酶為:纖維素酶2g，加果膠酶2.5ml，再加入A+B緩沖液7.5ml制成混合酶1ml ;其中A+B緩沖液為40ml 0.lmol/L檸檬酸+60ml 0.lmol/L檸檬酸鈉，在4°C條件下儲(chǔ)存，用滅菌蒸餾水稀釋10倍后使用。
[0018]進(jìn)一步地，所述的步驟I)取材:篩選植物飽滿的種子，放入鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25°C的培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待根部長(zhǎng)到1.5cm時(shí)，于上午8:00— 9:00剪取根尖作為實(shí)驗(yàn)材料。
[0019]進(jìn)一步地，所述的步驟I)取材:篩選植物飽滿的種子，放入鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25°C的培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待根部長(zhǎng)到1.5cm時(shí)，于上午8:30剪取根尖作為實(shí)驗(yàn)材料。
[0020]進(jìn)一步地，所述的步驟5)解離:于2mL離心管中加入混合酶解液置于37°C水浴鍋中解離17min。
[0021]進(jìn)一步地，所述的步驟6)染色:蒸饋水沖洗材料，用石炭酸品紅染液染色30min。
[0022]進(jìn)一步地，所述的步驟2)預(yù)處理:根尖用清水洗凈后，用刀片切取分生區(qū)部分0.5cm放入小瓶，然后向其中滴入冰水混合物，最后將小瓶放入4°C冰箱中培養(yǎng)24h。
[0023]進(jìn)一步地，所述的步驟5)解離:將固定好的根尖用雙蒸水清洗3次，再放入蒸餾水浸泡20min，徹底清除根尖上殘留的溶液，然后放入裝有I mol/L HCl的離心管中，于室溫下保持15—25min進(jìn)行解離。
[0024]進(jìn)一步地，所述的步驟5)解離后，需要用蒸餾水沖洗材料，放入45%醋酸處理30min，軟化材料。
[0025]本發(fā)明的有益效果是:
[0026](I)確定了披堿草屬植物根尖染色體壓片法根尖的最適萌發(fā)溫度和最適取樣時(shí)間，即篩選植物飽滿的種子，放入鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25°C的培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待根部長(zhǎng)到1.5cm時(shí)，于上午8:30剪取根尖作為實(shí)驗(yàn)材料；這時(shí)間段取材能獲得較多的細(xì)胞分裂相，有利于染色體相關(guān)的分析。
[0027](2)確定了披堿草屬植物根尖染色體壓片法的最適預(yù)處理液和處理時(shí)間，即根尖用清水洗凈后，用刀片切取分生區(qū)部分0.5cm放入小瓶，然后向其中滴加飽和對(duì)二氯苯，室溫條件下處理6h ；
[0028](3)確定了披堿草屬植物根尖染色體壓片法的最適解離方法及解離時(shí)間，即于2mL離心管中加入混合酶解液置于37°C水浴鍋中解離10 — 20min ；
[0029](4)確定了披堿草屬植物根尖染色體壓片法的最適軟化時(shí)間，即用蒸餾水沖洗材料，放入45%醋酸處理30min ；
[0030](5)確定了披堿草屬植物根尖染色體壓片法最適染色液及染色時(shí)間，即蒸餾水沖洗材料，用石炭酸品紅染液染色30min。
[0031]通過(guò)確定關(guān)鍵步驟的處理液及處理時(shí)間，提供一種披堿草屬植物根尖染色體壓片方法，這將為披堿草屬植物細(xì)胞學(xué)特征、遺傳機(jī)制、遺傳育種、基因定位等的深入研究提供標(biāo)本奠定基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為本發(fā)明披堿草屬植物無(wú)芒披堿草在40倍顯微鏡下觀察到的染色體中期分裂相；
[0033]圖2為本發(fā)明披堿草屬植物老芒麥在40倍顯微鏡下觀察到的染色體中期分裂相；
[0034]圖3為本發(fā)明披堿草屬植物披堿草在40倍顯微鏡下觀察到的染色體中期分裂相。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，但不限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036]本發(fā)明所述的混合酶為:纖維素酶2g，加果膠酶2.5ml，再加入A+B緩沖液7.5ml制成混合酶1ml ;其中A+B緩沖液為40ml 0.lmol/L檸檬酸+60ml 0.lmol/L檸檬酸鈉，在4°C條件下儲(chǔ)存，用滅菌蒸餾水稀釋10倍后使用。
[0037]實(shí)施例一:
[0038]—種披堿草屬植物無(wú)芒披堿草根尖染色體壓片方法，其特征在于包括以下順序的步驟:
[0039]I)取材:篩選無(wú)芒披堿草飽滿的種子，放入鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，置于25°C的培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待根部長(zhǎng)到1.5cm時(shí)，于上午8:30min剪取根尖作為實(shí)驗(yàn)材料；
[0040]2)預(yù)處理:根尖用清水洗凈后，用刀片切取分生區(qū)部分0.5cm放入小瓶