Thbs2作為直腸癌血清標(biāo)記物的應(yīng)用及診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及THBS2作為直腸癌血清標(biāo)記物的應(yīng)用及診斷 試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)，結(jié)直腸癌的死亡率高居前 三，在中國結(jié)直腸癌的發(fā)生率呈不斷上升之勢，死亡率居第五。經(jīng)過積極外科手術(shù)治療和放 化療，結(jié)直腸癌患者5年總體生存率在66%左右。有數(shù)據(jù)表明，結(jié)直腸患者在I期甚至更早 得到有效的診斷和治療的話，生存率能夠提高到90%以上。然而目前結(jié)直腸癌的早期診斷 率只有37%左右，一旦到III期或者IV期才發(fā)現(xiàn)治療，生存率則降低為10%-30%?？梢娞岣?結(jié)直腸癌的早期診斷率至關(guān)重要。目前結(jié)腸鏡對結(jié)直腸癌檢查的靈敏度和特異性最高，但 由于費(fèi)用較高、患者痛苦較大和操作要求高等原因降低了患者愿意做該項檢查的程度，致 使很多患者拖到晚期，一般的影像學(xué)檢查確診時患者常常已經(jīng)處于癌癥晚期，對提高患者 生存率作用有限。因此，找到特異性和敏感性均佳的腫瘤標(biāo)記物成了可行的方法。然而結(jié) 直腸癌的發(fā)生發(fā)展是多種基因損傷的結(jié)果，目前還沒找到理想的腫瘤標(biāo)志物。
[0003] 理想的腫瘤標(biāo)志物應(yīng)符合以下條件：（1)敏感性高；（2)特異性好；（3)腫瘤標(biāo)志 物濃度和腫瘤大小、轉(zhuǎn)移、惡性程度有關(guān)，能監(jiān)測腫瘤治療效果和腫瘤的復(fù)發(fā)并預(yù)測預(yù)后；
[4] 半衰期短，有效治療后濃度很快下降，能較快反映體內(nèi)腫瘤的實際情況；（5)存在于體 液，特別是血液中，易于檢測。
[0004] 現(xiàn)在應(yīng)用于臨床的腫瘤標(biāo)記物大約有如下幾種：CA-153, CA19-9, CA-125, AFP， CEA，PAS，F(xiàn)erritin，CA724，CA242等。通過對臨床600多例樣本的統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)只有CEA 在診斷結(jié)直腸癌時的敏感性在臨床應(yīng)用中能達(dá)到50%以上，其余都低于20%。
[0005] Thrombospondin-2 (THBS2)屬于人血小板反應(yīng)蛋白家族成員之一。近年來研究 表明THBS2可在多種組織中表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Naumnik W等研究表明 THBS2表達(dá)水平與晚期非小細(xì)胞肺癌病人的生存時間相關(guān)，THBS2水平越高，生存時間越 短，大于24. 15ng/ml的病人平均生存時間不足9個月。Matos AR等發(fā)現(xiàn)THBS2的轉(zhuǎn)錄水平 可用于區(qū)分前列腺癌和良性的前列腺增生。而Koch M等的研究則表明⑶36可通過THBS2 抑制乳腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，另外，在卵巢癌和急性淋巴白血病中THBS2發(fā)現(xiàn)因甲基化而沉 默。然而目前為止尚無明確的大樣本數(shù)據(jù)驗證其血清表達(dá)水平與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的相關(guān) 性，本發(fā)明通過檢測表明血清THBS2水平診斷結(jié)直腸癌的特異性達(dá)87. 2%，敏感度達(dá)65. 0%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種THBS2作為結(jié)直腸癌 血清標(biāo)記物的應(yīng)用及診斷試劑盒的技術(shù)方案，來定性或定量檢測人血清中的THBS2抗原水 平，作為輔助結(jié)直腸癌早期診斷的一種手段，大大提高結(jié)直腸癌早期診斷的敏感性和特異 性。
[0007] 所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2作為檢測直腸癌的血清標(biāo)記物的應(yīng)用。
[0008] 所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0009] 所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于 以常規(guī)方法制備抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體，建立檢測人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的 定性或定量方法及配套的試劑盒。
[0010] 所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用，其特征在于 抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0011] 所述的一種直腸癌診斷試劑盒，包括固相、位于固相中的抗體、酶標(biāo)記抗體，其特 征在于所述的抗體為抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體。
[0012] 所述的一種直腸癌診斷試劑盒，其特征在于抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體是 單克隆抗體或多克隆抗體。
[0013] 本發(fā)明為直腸癌的診斷和/或治療提供一條全新的途徑。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：1.提供的血清生物標(biāo)志物的特異性為87. 2%，敏感性為 65.0%，具有較高特異性和敏感性。2.提供一種靈敏、可靠、可操作的方法，定量測定人血清 中THBS2抗原水平，有助于輔助早期診斷結(jié)直腸癌。
【附圖說明】
[0015] 圖1為實施例中的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖2為實施例中ROC曲線圖； 圖3為實施例中THBS2點分布圖。
【具體實施方式】
[0016] 為了使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解， 這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，下列實施例中未提及的具體實 驗方法，通常按常規(guī)實驗方法進(jìn)行。 實施例
[0017] 1、血清樣本的采集與制備： 采集結(jié)直腸癌患者和正常對照的全血標(biāo)本，室溫放置2小時內(nèi)3000g離心5分鐘，取上 清即得到血清。得到的血清可立即用于檢測，或者分裝后于-80°C保存。
[0018] 2、Elisa各種緩沖液及試劑的配置方法 (1) 包被緩沖液：PH9. 6、0. 05M的碳酸鹽緩沖液
(2) 樣品稀釋液：ΡΗ7· 4、0· Olmol/L的PBS緩沖液 CN 105092846 A I兄明 3/5 頁
(3) 洗滌緩沖液：ΡΗ7· 4、0· OlM 的 PBST 緩沖液(含 0· 05% Tween-20)
(4) 封閉液：含0· 5% BSA的pH 7. 4 PBS溶液。
[0019] (5)底物顯色液： 顯色液A
顯色液B :(現(xiàn)配現(xiàn)用）
(6) 終止緩沖液：2M H2SO4
(7) 抗體（Anti-THBS2)由R&D公司提供，貨號MAB16351，濃度為20mg/mL。
[0020] (8)標(biāo)準(zhǔn)品由R&D公司提供，濃度為200ng/mL。
[0021] (9 ) HRP 酶標(biāo)抗體濃度為 0· 1-1 μ g/mL。
[0022] 3、雙抗體夾心法Elisa測定血清中THBS2濃度，以輔助診斷腸癌： 具體操作步驟如下： (1) 包被：用PH9. 6、0. 05M碳酸鹽緩沖液將抗體（Anti-THBS2)稀釋至濃度為1~ IOyg / ml。96孔酶標(biāo)板每孔加100 μ L上述抗體稀釋液，4°C過夜或37°C包被2h。棄去包 被液，每孔加350 μ L洗滌緩沖液洗板3次，每次3分鐘，拍干，得到捕捉抗體。 (2) 封閉：加0. 3ml封閉液于上述已包被的微孔中，置37°C封閉2小時。然后洗滌。
[0023] (3)樣品稀釋：每個血清樣品按體積1:4稀釋。建議取50 μ L血清樣品加入到 150 μ L樣品稀釋液。
[0024] (4)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋：用樣品稀釋液將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為20ng/ml，10 ng/ml, 5 ng/ml, 2. 5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.3125 ng/ml，0 ng/ml 8 個濃度梯度。
[0025] (5)加樣：每孔加入50 μ L稀釋后的血清樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，37°C孵育2小時；然后洗 滌。
[0026] (6)酶標(biāo)二抗：每孔加入200 μ L HRP酶標(biāo)抗體，置于微型振蕩器37°C孵育2小時； 然后洗滌。
[0027] (7)顯色：將顯色液A和顯色液B以1:1混合。每孔加入200 μ L，避光反應(yīng)30min。
[0028] (8)終止：每孔加入50 μ L終止液，終止反應(yīng)。5min鐘內(nèi)測量450nm處各孔吸光度 值。
[0029] (9)標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖1所示）：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)作標(biāo) 準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每個樣品的濃度。
[0030] (10)結(jié)果判定：小于3. 71為高風(fēng)險，大于3. 71為正常。
[0031] 對400例結(jié)直腸癌病人血清，200例正常對照血清的ROC分析確立了以上參考值， 其中ROC曲線如圖2所示，THBS2點分布圖如圖3所示。
[0032] 對部分測定數(shù)據(jù)如下表：（深色標(biāo)記為腫瘤患者，淺色標(biāo)記為正常對照）：
本發(fā)明所提供的診斷結(jié)直腸癌的特異性為87. 2%，敏感度為65. 0%。
[0033] 以上公開的僅為本申請的幾個具體實施例，但本申請并非局限于此，任何本領(lǐng)域 的技術(shù)人員能思之的變化，都應(yīng)落在本申請的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 人血小板反應(yīng)蛋白THBS2作為檢測結(jié)直腸癌的血清標(biāo)記物的應(yīng)用。2. 人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備結(jié)直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求2所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備結(jié)直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng) 用，其特征在于以常規(guī)方法制備抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體，建立檢測人血小板反 應(yīng)蛋白THBS2的定性或定量方法及配套的試劑盒。4. 如權(quán)利要求2所述的人血小板反應(yīng)蛋白THBS2在制備結(jié)直腸癌診斷試劑盒中的應(yīng) 用，其特征在于抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。5. -種結(jié)直腸癌診斷試劑盒，包括固相、位于固相中的抗體、酶標(biāo)記抗體，其特征在于 所述的抗體為抗人血小板反應(yīng)蛋白THBS2的抗體。6. 如權(quán)利要求5所述的一種結(jié)直腸癌診斷試劑盒，其特征在于抗人血小板反應(yīng)蛋白 THBS2的抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
【專利摘要】THBS2作為直腸癌血清標(biāo)記物的應(yīng)用及診斷試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明一方面提供THBS2作為直腸癌血清標(biāo)記物的應(yīng)用的技術(shù)方案，另一方面提供結(jié)直腸癌診斷試劑盒的技術(shù)方案。本發(fā)明的有益效果在于：1.提供的血清生物標(biāo)志物的特異性為87.2%，敏感性為65.0%，具有較高特異性和敏感性。2.提供一種靈敏、可靠、可操作的方法，定量測定人血清中THBS2抗原水平，有助于輔助早期診斷結(jié)直腸癌。
【IPC分類】G01N33/574, G01N33/577
【公開號】CN105092846
【申請?zhí)枴緾N201510433036
【發(fā)明人】胡曉彤, 何超, 費(fèi)偉強(qiáng)
【申請人】浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院
【公開日】2015年11月25日
【申請日】2015年7月22日