納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器的制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種傳感器的制備技術(shù)，尤其涉及一種利用納米孔陣列構(gòu)建人氣味結(jié) 合蛋白傳感器的方法，以及利用納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器檢測與疾病相關(guān)的脂 肪酸（二十二碳六烯酸）分子和醛類分子（苯甲醛）的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人氣味結(jié)合蛋白屬于脂質(zhì)運載蛋白中的一種，是一種低分子量、可溶性蛋白，主要 存在于人嗅覺神經(jīng)細胞外側(cè)的淋巴液中。其作用是與目標脂溶性分子可逆地結(jié)合，并運輸 此類疏水性小分子至嗅覺細胞上的嗅覺受體，進而促使產(chǎn)生嗅覺。人類能夠檢測并區(qū)分上 億種不同的氣味刺激，其中人氣味結(jié)合蛋白發(fā)揮了非常重要的作用。現(xiàn)階段，基于氣味結(jié)合 蛋白的傳感器已經(jīng)受到了很多人的重視，而石英晶體微天平，表面等離子體共振，電化學阻 抗等傳感器的研究也已經(jīng)開展，但是檢測下限，靈敏度等仍不能滿足要求。除此之外，研究 所用氣味結(jié)合蛋白主要來自于昆蟲和其他哺乳動物，將人氣味結(jié)合蛋白作為敏感元件構(gòu)建 傳感器的很少。因此，利用納米孔和人氣味結(jié)合蛋白結(jié)合的納米級別的優(yōu)勢，發(fā)展一種基于 電化學阻抗分析的納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器，以期實現(xiàn)高靈敏的檢測特異性配 體分子，可以用于化學分子、疾病標志物檢測及人氣味結(jié)合蛋白特性研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋 白傳感器的制備及應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：一種基于納米孔陣列的人氣味結(jié)合 蛋白傳感器的制備方法，包括以下步驟：
[0005] (1)加工納米孔陣列材料：采用標準的兩步陽極氧化法制備。將純度為99. 99%以 上的鋁箱裁剪成長X寬為20mmX 20mm的基片，進行機械拋光后依次在超純水、丙酮溶液中 用超聲脫脂清洗l〇min，取出后用超純水淋洗，用氮氣吹干后以基片作為陽極，銅片作為陰 極在0. 25M的草酸中進行一次氧化3h，然后用超純水淋洗后把基片放入質(zhì)量百分比為4% 的鉻酸和質(zhì)量百分比為8%的磷酸混合液中進行5min刻蝕，除去一次陽極氧化多孔氧化鋁 層，然后用超純水淋洗后進行15min的二次氧化，條件與第一次氧化條件完全相同，第二次 刻蝕溶液為質(zhì)量百分比為8%的磷酸和0.1 M的氯化銅混合溶液，時間為5min，取出基片，用 超純水淋洗后即得到納米孔陣列材料；
[0006] (2)納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器的構(gòu)建，該步驟通過以下子步驟來實 現(xiàn)：
[0007] (2. 1)首先，將納米孔陣列材料裁剪成的納米孔陣列，面積大于反應(yīng)皿中 間通道，然后將其固定于反應(yīng)皿的中間，再向反應(yīng)皿的兩側(cè)中加入超純水，浸泡24h后，依 次用無水乙醇和超純水清洗上述的反應(yīng)皿及納米孔陣列，最后用氮氣吹干；
[0008] (2. 2)配制5mM的2-羧乙基磷酸溶液，溶劑為超純水；將2-羧乙基磷酸溶液加入 反應(yīng)皿的兩側(cè)，2-羧乙基磷酸溶液體積為使得納米孔陣列恰好完全浸泡在2-羧乙基磷酸 溶液中。在室溫下，避光靜置72h，2-羧乙基磷酸中的磷酸根吸附于納米孔陣列的表面，進 而將2-羧乙基磷酸固定于納米孔陣列上。之后再吸出反應(yīng)皿中殘留的2-羧乙基磷酸溶液， 然后用超純水清洗反應(yīng)皿及納米孔陣列，最后用氮氣吹干；
[0009] (2. 3)在反應(yīng)皿的兩側(cè)分別加入8mg/ml的EDC(1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽）溶液和12mg/ml的NHS (N-羥基琥珀酰亞胺）溶液，EDC溶液和NHS溶液的 體積均為2-羧乙基磷酸溶液體積的二分之一，EDC溶液的溶劑為0.1 M MES緩沖液，NHS溶 液的溶劑為〇. IM PBS緩沖液，室溫下靜置15min后，再加入飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)皿中 溶液 pH 至 7. 2-7. 4 ;
[0010] (2. 4)在反應(yīng)皿的兩側(cè)分別加入與EDC溶液等體積的20 μ g/ml人氣味結(jié)合蛋白 溶液，人氣味結(jié)合蛋白溶液的溶質(zhì)為人氣味結(jié)合蛋白，溶劑為〇. IM PBS緩沖液，內(nèi)含質(zhì)量百 分比為5%的海藻糖和質(zhì)量百分比為5%的甘露醇。將反應(yīng)皿置于4°C條件下靜置2h，使得 人氣味結(jié)合蛋白與2-羧乙基磷酸溶液中的2-羧乙基磷酸的羧基發(fā)生脫水縮合作用而形成 穩(wěn)定的酰胺鍵，進而形成酰胺鍵結(jié)構(gòu)，然后吸出反應(yīng)皿中殘留的液體，再向反應(yīng)皿兩側(cè)加滿 0.1 M PBS緩沖液，靜置5min后吸出PBS緩沖液，即可獲得基于納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋 白傳感器，置于4°C條件下備用。
[0011] 應(yīng)用上述基于納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器檢測脂肪酸和醛類物質(zhì)的方 法，包括以下步驟：
[0012] (1)配制苯甲醛和二十二碳六烯酸的標準樣品溶液：采用分析純?yōu)?9%的苯甲醛 和分析純?yōu)?9%的二十二碳六烯酸標準貯備溶液分別稀釋配制5種不同濃度梯度的標準 樣品溶液，稀釋液是分析純?yōu)?9%的甲醇溶液；
[0013] (2)納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器構(gòu)建的表征：首先是三電極檢測系統(tǒng)的 連接，先將三電極中金工作電極的一端連接電化學工作站的工作輸入端，金工作電極的另 一端插入反應(yīng)皿中；銀/氯化銀參比電極的一端連接電化學工作站的參比輸入端，鉑絲對 電極的一端連接電化學工作站的對電極輸入端。銀/氯化銀參比電極和鉑絲對電極的另外 一端同時插入反應(yīng)皿的另外一側(cè)（與金工作電極分別位于反應(yīng)皿的兩側(cè)）。當反應(yīng)皿中間 沒有納米孔陣列時，向反應(yīng)皿的兩側(cè)中分別加入與2-羧乙基磷酸溶液等體積氧化還原對 溶液，氧化還原對溶液中含有IOmM鐵氰化鉀、IOmM亞鐵氰化鉀和〇. IM的KCl，溶劑為超純 水，再向反應(yīng)皿的兩側(cè)中分別加入與氧化還原對溶液等體積的甲醇溶液，直接進行電化學 阻抗圖譜掃描，具體測試參數(shù)為初始電壓為0. 2V，交流電壓幅度為5mV，掃頻范圍為IHz~ 1MHz，最后得到無納米孔陣列的電化學阻抗圖譜。之后利用相同的測量方法，測量納米孔陣 列固定于反應(yīng)皿中的電化學阻抗圖譜，以及納米孔陣列上固定人氣味結(jié)合蛋白之后的電化 學阻抗圖譜，利用檢測到的三條電化學阻抗圖譜表征納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器 的構(gòu)建。
[0014] (3)檢測苯甲醛標準樣品溶液：三電極檢測系統(tǒng)的連接及具體測試參數(shù)同步驟2， 測試傳感器是納米孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器，首先進行空白對照溶液電化學阻抗圖 譜的測量，向反應(yīng)皿的兩側(cè)中分別加入與2-羧乙基磷酸溶液等體積的氧化還原對溶液，氧 化還原對溶液中含有IOmM鐵氰化鉀、IOmM亞鐵氰化鉀和0.1 M的KC1，溶劑為超純水，再向 反應(yīng)皿的兩側(cè)中分別加入與氧化還原對溶液等體積的甲醇溶液，通過電化學工作站對納米 孔陣列的人氣味結(jié)合蛋白傳感器進行電化學阻抗圖譜掃描，得到電化學阻抗圖譜。測量結(jié) 束后吸出反應(yīng)皿兩側(cè)中殘留的溶液，然后向反應(yīng)皿的兩側(cè)均加滿PBS緩沖液，靜置5min后 緩慢吸出PBS緩沖液，用于清洗納米孔陣列，消除上次測量殘留的鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀及 PBS緩沖液的混合溶液影響。之后再進行苯甲醛標準樣品溶液的檢測，向反應(yīng)皿的兩側(cè)分別 加入與2-羧乙基磷酸溶液等體積的氧化還原對溶液和已知物質(zhì)的量濃度的苯甲醛標準樣 品溶液，進行電化學阻抗圖譜的測量，得到該物質(zhì)的量濃度下的苯甲醛標準樣品溶液對應(yīng) 的電化學阻抗圖譜。測量結(jié)束后吸出反應(yīng)皿兩側(cè)中殘留的溶液，然后向反應(yīng)皿的兩側(cè)均加 滿PBS緩沖液，靜置5min后緩慢吸出PBS緩沖液，用于清洗納米孔陣列。
[0015] (4)重復(fù)步驟3中苯甲醛標準樣品溶液的電化學阻抗圖譜的測量過程，直至完成5 種不同濃度梯度的苯甲醛標準樣品溶液