一種快速檢測全血紅細胞二十烷四烯酸的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測技術領域，涉及一種快速檢測全血紅細胞二十烷四烯酸的方 法。
【背景技術】
[0002] 在人體內(nèi)，少量脂肪酸以游離形式存在，大部分以結合形式，如甘油三酯、磷脂、糖 脂等存在。從營養(yǎng)學角度，脂肪酸可分為必需脂肪酸和非必需脂肪酸，非必需脂肪酸是指機 體可以自行合成，不必依靠食物供應的脂肪酸；必需脂肪酸是指人體維持機體正常代謝不 可缺少而自身又不能合成或合成速度慢，無法滿足機體需要，必須通過食物供給的脂肪酸。 必需脂肪酸可分為ω (Omega)-6系列脂肪酸和ω (Omega)-3系列脂肪酸。膳食中必需 脂肪酸缺乏將導致皮膚病變、神經(jīng)和視覺疑難癥、心臟疾病等問題。
[0003] 由于紅細胞膜上脂肪酸的組成能夠反映人群的長期飲食結構，而不會受到短期內(nèi) 飲食的影響。因此，測定人全血紅細胞脂肪酸，能夠準確、客觀的反映機體內(nèi)不同脂肪酸的 營養(yǎng)水平。
[0004] 國內(nèi)外有關脂肪酸檢測的相關報道盛多，涉及到食品、環(huán)境、醫(yī)藥衛(wèi)生、臨床應用 等多個領域，檢測方法包括氣相色譜法（GC)、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS)和液相色譜-串聯(lián) 質(zhì)譜法（LC-MS/MS)，檢測樣本類型更是涉及食物、水質(zhì)、藥品、血液、組織等。但是，不同的應 用領域及不同的樣品類型，所涉及的樣品處理與脂肪酸檢測分析流程千差萬別，因此不同 領域以及不同樣品類型的脂肪酸檢測方法之間無可比性。
[0005] 目前，全血紅細胞脂肪酸的檢測主要有GC、GC-MS和LC-MS/MS三種。GC是目前 紅細胞脂肪酸檢測的常用方法，但是此方法的檢測器對未實現(xiàn)色譜分離的類似脂肪酸，無 法實現(xiàn)準確定性分離和定量分析，因此無法對多種脂肪酸特異性、準確的定性和定量分析。 LC-MS/MS方法前處理較為復雜，且分析結果重現(xiàn)性較差。而GC-MS方法由于同時具有氣相 的分離功能和質(zhì)譜的特異性定性、定量功能，所以可以解決GC和LC-MS/MS的弊端，但是現(xiàn) 有的GC-MS方法分析時間較長，檢測通量較低。
[0006] 中國專利201210247480. 2公開了一種氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測脂肪酸含量的方 法，該方法針對的樣品為動物組織，樣品的前處理包括皂化步驟，還需要充氮氣保護，樣品 的前處理復雜。 因此，本領域技術人員迫切需要一種前處理簡單、檢測快速、方法靈敏度高、特異性強 的適用于全血紅細胞脂肪酸的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供一種快速檢測全血紅細胞二十烷四 烯酸的方法，該方法的樣品用量少，前處理簡單，靈敏度高，特異性強，定性、定量功能強大， 并且整個檢測過程時間短、檢測通量高。本發(fā)明僅涉及全血樣本紅細胞二十烷四烯酸的檢 測。
[0008] -種快速檢測全血紅細胞二十烷四烯酸的方法，包括如下步驟： A) 全血樣品的前處理：從全血樣品中分離紅細胞，加入內(nèi)標溶液和鹽酸-甲醇溶液進 行衍生化反應，然后加入萃取劑萃取，取上清液并氮氣吹干，殘渣中加入復溶劑，混勻，得到 樣品檢測液； B) 對所述樣品檢測液采用氣相色譜-質(zhì)譜儀進行檢測，氣相色譜條件包括：色譜柱采 用極性色譜柱，載氣為氦氣，不分流進樣，線速度流量控制方式，載氣流量為0. 80~1. OOmL/ min，起始柱溫60°C，先升溫至180°C，然后升溫至220°C，整個升溫程序的梯度時間為 8~15min ;質(zhì)譜條件為：采用電子轟擊離子源，采用全掃描和選擇離子掃描方式。
[0009] 采用上述技術方案，前處理簡單，通過萃取-吹干-復溶的過程，有效去除了干擾 物質(zhì)，使紅細胞中的二十烷四烯酸轉化為揮發(fā)性較強、適用于氣相色譜質(zhì)譜儀檢測的二十 烷四烯酸甲酯產(chǎn)物；檢測方法的靈敏度高，特異性強，定性、定量功能強大，準確性好，并且 整個檢測過程時間短、檢測通量高。
[0010] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標溶液選自十七烷酸。除十七烷酸，外本發(fā)明還可以選用十五烷酸 或十九烷酸作為內(nèi)標溶液。
[0011] 優(yōu)選地，所述萃取劑選自正己烷，所述復溶劑選自正己烷。使用正己烷作為萃取 劑，可以將各種脂肪酸的甲酯化產(chǎn)物萃取出來，萃取效率高且有效避免了其他物質(zhì)的干擾。
[0012] 優(yōu)選地，所述內(nèi)標溶液與紅細胞的體積比為1 : (1~2);所述紅細胞、鹽酸-甲醇溶 液、萃取劑及復溶劑的體積比為1 :(1〇~25) :(20~50) :(4~10)。
[0013] 優(yōu)選地，所述紅細胞、鹽酸-甲醇溶液、萃取劑及復溶劑的體積比為1 :20 :40 :8。
[0014] 優(yōu)選地，所述極性色譜柱選自規(guī)格為20m*0. 20 μ m的極性毛細管色譜柱。
[0015] 優(yōu)選地，所述氣相色譜條件還包括：進樣體積為WL，進樣口溫度為220~230°C， 后運行溫度為240~250 °C，后運行時間為2min，吹掃流量為3. 0~5. OmL/min，總流量為 50. 0~60· O mL/min，平均線速度為 35. 0~45· Ocm/s。
[0016] 優(yōu)選地，所述質(zhì)譜條件還包括：接口溫度為210~230°C ;離子源溫度為220~240°C ; 四極桿溫度為140~160°C，溶劑延遲時間為3. 0~4. Omin，全掃描范圍為m/z 60. 00~450. 00。
[0017] 優(yōu)選地，所述檢測方法還包括如下步驟：檢測結果的定性判斷和/或定量計算。
[0018]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供的檢測方法可以實現(xiàn)全血樣 品紅細胞中二十烷四烯酸的定性和定量檢測，具有前處理簡單，有效去除了干擾物質(zhì)，靈敏 度高，特異性強，定性、定量功能強大，準確性好，并且整個檢測過程時間短、檢測通量高。
[0019] 本發(fā)明采用全掃描和選擇離子掃描同時進行的掃描模式，能夠得到樣品的總離子 流色譜圖和選擇離子色譜圖，總離子流色譜圖可以用于對化合物進行定性，用于檢測過程 中監(jiān)測出峰時間處的化合物是否為目標化合物，以免出現(xiàn)其他干擾。此外，選擇離子掃描對 每個化合物的特征離子進行掃描，解決了單獨使用氣相色譜對脂肪酸進行定量不夠準確的 問題，進一步提高了檢測準確度和方法的特異性。本發(fā)明所使用的極性色譜柱適合二十烷 四烯酸的分離分析，色譜柱的高柱效以及低流失，大大降低了質(zhì)譜檢測時的背景干擾，最低 檢出限達到了 〇.〇lmg/L，檢測靈敏度高。按本發(fā)明提供的檢測方法，單個樣品檢測時間為 12min，與現(xiàn)有傳統(tǒng)方法相比，檢測時間短，儀器檢測通量高。
【附圖說明】
[0020] 圖1二十烷四烯酸甲酯的標準曲線。
[0021] 圖2全血紅細胞樣品中脂肪酸甲酯的總離子流色譜圖。
[0022] 圖3全血紅細胞樣品中二十烷四烯酸甲酯的選擇離子色譜圖。
[0023] 圖4全血紅細胞樣品中十七烷酸甲酯的選擇離子色譜圖。
【具體實施方式】
[0024] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。
[0025] 實施例一全血樣品的前處理 將抗凝全血樣本混勻，離心，棄除上層血漿、白細胞、血小板等；向剩余紅細胞中加入等 體積的生理鹽水，混勻后離心，棄除上層的生理鹽水；再向剩余的紅細胞中加入等