全血溶血傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及溶血傳感器、溶血傳感器系統(tǒng)、以及利用該溶血傳感器或溶血傳感器 系統(tǒng)來監(jiān)控或檢測樣品中的溶血、并評估樣品中的溶血對于電解質(zhì)（例如，鉀）水平的影響 的方法，其中所述樣品例如為全血樣品、血漿樣品、血清樣品或溶血血樣。
【背景技術(shù)】
[0002] 全血（是指血液中的細(xì)胞部分以及液體部分的組合）中的分析物濃度可能與紅細(xì) 胞中發(fā)現(xiàn)的分析物濃度在量上有著顯著的不同。例如，在全血中，鉀水平通常為約4. OmM，而 紅細(xì)胞中的鉀濃度通常為約150mM。
[0003] 在從患者體內(nèi)收集和處理全血的過程中，一些細(xì)胞，特別是紅細(xì)胞，可能被物理地 損壞從而引起紅細(xì)胞破裂。紅細(xì)胞破裂的現(xiàn)象被稱為"溶血"。當(dāng)在全血樣品中發(fā)生溶血 時，紅細(xì)胞中的內(nèi)容物與全血中不含細(xì)胞的部分（稱為血漿，或者在一些情況下稱為血清） 的內(nèi)容物混合在一起。血紅蛋白（其為全血中的成分，通常存在于紅細(xì)胞中而不被釋放到 血液的液體部分）以及其它細(xì)胞內(nèi)元素（例如，鉀）從紅細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)室釋放到血液的液 體部分，即血漿或血清中。
[0004] 因為紅細(xì)胞內(nèi)的鉀濃度比正常血漿中的鉀濃度高25至75倍，所以測定患者的溶 血血樣的液體部分中的鉀會出現(xiàn)人為假象，例如假測量值高于患者的實際血漿鉀水平。非 溶血血液的液體部分中的鉀濃度是眾多病癥的重要指標(biāo)。當(dāng)患者的非溶血血樣中實際具有 低濃度的鉀時，對其溶血血液中鉀濃度的過度估計可能會導(dǎo)致對患者進(jìn)行高血鉀癥（血鉀 升高）治療。遺憾的是，僅有相對少量的破裂的紅細(xì)胞會導(dǎo)致血鉀水平的人為升高。
[0005] 除了血樣發(fā)生溶血時血漿鉀會升高之外，例如，諸如乳酸脫氫酶、酸性磷酸酶、天 冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶等其它分析物在紅細(xì)胞中的濃度也高于在血液中液體部分 的濃度，因此在溶血血液中這些分析物的濃度也可能被人為升高。
[0006] 目前檢測患者血樣中溶血的方法包括對血樣離心以除去血細(xì)胞，然后通過光學(xué)方 法確定在血漿部分中是否存在血紅蛋白。血紅蛋白會使血漿呈粉紅色或紅色，而在非溶血 血樣中血漿通常呈淺黃色。目前尚無對未經(jīng)過濾或未經(jīng)離心的全血進(jìn)行操作以檢測溶血的 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 在一個方面中，本發(fā)明提供了一種用于檢測全血樣品中的溶血的電化學(xué)傳感器系 統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括：電化學(xué)溶血傳感器，該電化學(xué)溶血傳感器具有用于增強(qiáng)過氧化氫（H 2O2) 的流出、厚度在約0. 1 μπι至約50 μπι范圍內(nèi)的外膜，另一種膜，其包含用于產(chǎn)生過氧化氫的 氧化還原酶；以及無試劑的流動室，其設(shè)置為鄰近所述外膜，以使全血樣品與傳感器的外膜 接觸。外膜的厚度適用于增強(qiáng)過氧化氫的流出。在一個實施方案中，所述外膜包含水凝膠， 所述水凝膠的含水量為約〇. 1%至約100%。在一個實施方案中，所述氧化還原酶包括葡萄 糖氧化酶、乳酸氧化酶、或包含肌酸酐酶和/或肌酸酶以及肌氨酸氧化酶的酶的混合物。
[0008] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測全血樣品中的溶血的方法，所述方法 包括將全血樣品引入到電化學(xué)傳感器。所述電化學(xué)傳感器包括多個膜或?qū)?。在電化學(xué)傳感 器的所述多個膜中，其中一種膜包括中間層，該中間層包含氧化還原酶或起到能夠產(chǎn)生過 氧化氫的氧化還原酶作用的酶的混合物。所述多個膜中的另一種膜包括接觸血樣的外膜， 該外膜可滲透過氧化氫并增強(qiáng)過氧化氫的流出。此外，所述多個膜中的另一種膜包括內(nèi)膜。 在將全血樣引入電化學(xué)溶血傳感器之后，檢測在Hb (Fe2+)的存在下由過氧化氫產(chǎn)生的電化 學(xué)信號，其中當(dāng)可檢測電流與非溶血全血樣品相比下降范圍為4%至50%時，則表明全血 樣品中存在溶血。氧化還原酶包括葡萄糖氧化酶、乳酸氧化酶、或包含肌酸酐酶和/或肌酸 酶以及肌氨酸氧化酶的酶的混合物。
[0009] 在另一個方面，本發(fā)明提供了一種用于確定患者的全血樣品中分析物水平的升高 是否為與溶血相關(guān)的人為假象的方法。該方法包括將來自患者的全血樣品引入到本發(fā)明所 述的電化學(xué)溶血傳感器。該溶血傳感器包含能夠產(chǎn)生過氧化氫的氧化還原酶。該溶血傳感 器還包括厚度在約〇. 1 μ m至約50 μ m范圍內(nèi)的外膜。外膜的厚度適用于增強(qiáng)過氧化氫的 流出。將全血樣品引入電化學(xué)傳感器后，檢測在血紅蛋白（Hb(Fe2+))的存在下由過氧化氫 產(chǎn)生的電化學(xué)信號。當(dāng)可檢測到的電流與標(biāo)準(zhǔn)的非溶血全血樣品相比下降范圍為約4%至 約50 %時，則表明溶血是造成患者的全血樣品中分析物水平升高的原因。
【附圖說明】
[0010] 圖1示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的示例性的電化學(xué)傳感器系統(tǒng)，其包括在傳感器 組件中的示例性的傳感器卡和一組傳感器，包括溶血傳感器（如圖2所示）。
[0011] 圖2示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的示例性傳感器卡的反轉(zhuǎn)視圖（reverse frontal view)，其包括如圖1所示的傳感器組件中的一組傳感器中的溶血傳感器。
[0012] 圖3示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的在圖2中示出的示例性溶血傳感器的截面圖。
[0013] 圖4示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的在圖2中示出的示例性溶血傳感器的另一截面 圖。
[0014] 圖5示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的在圖2中示出的示例性溶血傳感器的復(fù)合層的 截面圖。
[0015] 圖6示出了具有示例性葡萄糖氧化酶層的溶血傳感器的另一實施方案。
[0016] 圖7是示出了本發(fā)明的溶血傳感器中血紅蛋白的類過氧化物酶活性的圖示，其中 所述溶血傳感器包括示例性葡萄糖氧化酶層。在圖7中，X軸表示時間（秒），y軸表示電 流（安培）。
[0017] 圖8A是示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的示例性溶血傳感器對溶解血漿（lysed blood plasma)的響應(yīng)的圖示，其中所述溶血傳感器具有葡萄糖氧化酶層。在圖8A中，X軸 表示時間（秒），y軸表示電流（安培）。
[0018] 圖8B是示出在圖8A中示出的溶血傳感器對溶解血漿的響應(yīng)是線性的圖示。在圖 8B中，X軸表示血衆(zhòng)血紅蛋白（g/dL)，y軸表示電流（毫微安）。
[0019] 圖9A是示出了對于全血和溶血血樣，由本發(fā)明的示例性溶血傳感器產(chǎn)生的實時 電流曲線的圖示。在圖9A中，X軸表示時間（秒），y軸表示電流（安培）。
[0020] 圖9B是示出了圖9A所示的示例性溶血傳感器對不同體積百分比的溶解血液的響 應(yīng)的圖示。在圖9B中，X軸表示溶解血液（％體積/體積），y軸表示電流（毫微安）。
[0021] 圖9C示出了由圖9A和圖9B的溶血傳感器產(chǎn)生的校準(zhǔn)圖的線性部分，其中所述溶 血傳感器包括示例性葡萄糖氧化酶層。在圖9C中，X軸表示溶解血液體積/體積），y 軸表不電流（_微安）。
[0022] 圖10是示出了 p02對本發(fā)明的溶血傳感器響應(yīng)的預(yù)期影響的圖示，所述溶血傳感 器包括示例性葡萄糖氧化酶層。在圖10中，X軸表示氧分壓（P〇 2) (mmHg)，y軸表示電流（安 培）。
【具體實施方式】
[0023] 本發(fā)明涉及溶血傳感器、溶血傳感器系統(tǒng)、和利用該溶血傳感器或溶血傳感器系 統(tǒng)來監(jiān)控或檢測樣品中的溶血以評估溶血對血樣中的分析物（例如，鉀）水平的影響的方 法，其中所述樣品為（例如）全血樣品、血漿樣品、血清樣品或溶血血液。
[0024] 簡言之，本文所描述的溶血傳感器以及用于檢測溶血的方法利用了對于H2O 2的膜 滲透性。本文所使用的膜滲透性是指溶血傳感器的膜（例如，溶血傳感器的外膜）易于使 過氧化氫穿進(jìn)并穿出該膜的性質(zhì)（以下將詳細(xì)描述該性質(zhì)）。例如，可以通過溶血傳感器的 外膜的含水量來調(diào)節(jié)本文所用的膜滲透性。相比于具有低含水量的膜而言，具有高含水量 的膜對于過氧化氫的滲透性更高。根據(jù)本發(fā)明的溶血傳感器的膜的含水量優(yōu)選在約30%至 100%的范圍內(nèi)。
[0025] 本文所使用的膜滲透性還包括選擇性的膜滲透性。例如，溶血傳感器中的干擾抑 制膜（interference rejection membrane)選擇性地允許過氧化氫易于通過該膜，同時對 于其它物質(zhì)（例如，干擾物）的透過起到了屏障的作用。本文所用的選擇性的膜滲透性還 包括一種或多種溶血傳感器膜（例如，外膜）允許一些顆粒（例如，過氧化氫）自由地通過 該膜，同時阻礙或完全阻止其它物質(zhì)（例如，全血樣品中的蛋白質(zhì)分子）通過該膜的能力。
[0026] 根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，所述溶血傳感器利用了全血樣品中的胞外血紅蛋白 (除非另有說明，否則以下也稱為"血紅蛋白"）的類過氧化物酶活性。當(dāng)在氣體（例如，氧 氣）的存在下，底物（例如，血糖）與氧化還原酶（例如，葡萄糖氧化酶）發(fā)生反應(yīng)時會由 該底物（例如，血糖）產(chǎn)生過氧化氫（H 2O2),并且H2O2會被存在于全血樣品的液體部分的胞 外血紅蛋白所清除。
[0027] 如本文所使用的"清除"是指在溶血傳感器中，當(dāng)H2O2與血紅蛋白接觸時，血紅蛋 白將H 2O2分解或降解成小分子。
[0028] 由血紅蛋白造成的過氧化氫被分解或降解成小分子使得在溶血傳感器中產(chǎn)生了 過氧化氫擴(kuò)散梯度，這使得過氧化氫優(yōu)選地從溶血傳感器的產(chǎn)生過氧化氫的膜（例如，以 下將詳細(xì)描述的中間酶膜）擴(kuò)散通過并到達(dá)外膜的外表面，其中該外膜的外表面與引入到 溶血傳感器中的血樣中的胞外血紅蛋白接觸。
[0029] 與溶血傳感器中不存在血紅蛋白的情況相比，溶血傳感器中血紅蛋白的清除作用 降低了工作電極（例如，鉬電極）氧化所需的H 2O2的可獲得性（availability)。因此，與血 樣不存在溶血的情況相比，當(dāng)溶血傳感器中存在血紅蛋白時，工作電極所產(chǎn)生的電流較小。
[0030] 重要的是，需要注意僅僅是血漿或血清中的胞外血紅蛋白（紅細(xì)胞外面的血紅蛋 白）會與過氧化氫反應(yīng)并產(chǎn)生溶血信號。紅細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白對于溶血傳感器沒有影響。
[0031] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的溶血傳感器可用于評估患者血樣中 各種分析物濃度的升高是否是由于血樣的溶血（即，紅細(xì)胞的失去完整性）或者是由于所 抽取血樣的患者體內(nèi)出現(xiàn)某種生理上的異常而導(dǎo)致的，其中所述分析物例如為鉀、肌酸酐 或鎂，這些分析物的胞內(nèi)濃度高于該分析物在全血的液體部分中的濃度。下表1示出了溶 血的紅細(xì)胞對于鉀的胞外濃度的影響，其中鉀是一種在完整的紅細(xì)胞中具有高胞內(nèi)濃度的 分析物。
[0032] 表 1