小鯢科動物視網(wǎng)膜顯微組織切片的制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種兩棲動物視網(wǎng)膜顯微組織切片的制備方法，具體涉及用于顯微觀察的小鯢科動物視網(wǎng)膜組織切片的制備方法，屬于顯微組織切片技術領域。
【背景技術】
[0002]眼睛作為視覺的重要組成原件，能夠客觀的將外界的圖像信號轉化為生理脈沖而被中樞大腦神經(jīng)所識別，經(jīng)過中樞神經(jīng)分析以其指導動物做出各種動作和行為反應。視網(wǎng)膜位于脊索動物眼球靠近大腦一側的背部，視網(wǎng)膜在整個眼球中尤為重要，因為視網(wǎng)膜承擔著將光信號轉化為神經(jīng)信號的整個任務。不同動物由于活動模式、棲息地環(huán)境和進化地位的不同，出現(xiàn)了形形色色的適應性行為。
[0003]小鯢科動物是亞洲特有的有尾類兩棲動物，也是現(xiàn)生有尾目10科中第三大科，全世界現(xiàn)已知66種，隸屬2亞科、10屬。中國現(xiàn)已知2亞科8屬30種，主要分布于東北、西南山區(qū)、華中及臺灣地區(qū)。小鯢科動物生活環(huán)境可分為水棲型和陸棲型，活動習性可分為昏型或者夜行性，由于生活環(huán)境和活動習性的不同導致光照的不同，從而引起視網(wǎng)膜形態(tài)結構的變化。研究視網(wǎng)膜的形態(tài)結構特征，視網(wǎng)膜石蠟切片的制作是必不可少的一步。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種小鯢科動物視網(wǎng)膜顯微組織切片的制備方法。
[0005]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術方案是:
[0006]小鯢科動物顯微組織切片的制備方法，包括以下步驟:
[0007](I)取材:將小鯢科動物的眼球完整無損的取出，并修剪多余組織；
[0008](2)固定、沖洗:將采集的眼球置于固定液中，固定后沖洗備用；
[0009](3)脫水:將經(jīng)固定處理的眼球組織依次浸入濃度梯度50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇中脫水，其中95%、100%乙醇各重復兩次，每個梯度脫水45?60min ；
[0010](4)透明:將經(jīng)脫水處理的眼球組織浸入100%乙醇與二甲苯的混合液中2?3min，取出后再浸入二甲苯中10?30min ；
[0011](5)浸蠟:將經(jīng)透明處理的眼球組織放入二甲苯與石蠟的混合液中20?30min，取出后再分兩次放入石錯中，每次45?60min ；
[0012](6)將經(jīng)浸蠟處理的眼球組織包埋，依次經(jīng)切片、展片、貼片、烤片、染色、封固處理，即得。
[0013]步驟⑵中所述固定液為10%福爾馬林溶液，用量為眼球組織體積的10?20倍。
[0014]步驟(3)中所述脫水在室溫下進行。
[0015]步驟(4)中所述100%乙醇與二甲苯的體積比為1:1。
[0016]步驟(5)中所述二甲苯與石蠟的體積比為1:1。
[0017]步驟(6)中所述切片的厚度為4?6 μπι，切片后置于42?45°C的水中展片。
[0018]步驟(6)中所述貼片、烤片為:待切片自然伸展平后從水中取出，控干水分，置于37?45°C下干燥2?4h，或者于室溫下自然干燥一夜，亦或將切片置于載玻片上，加少量水后持載玻片在酒精燈上加溫，使切片伸展。
[0019]所述蘇木精染液為:將lg蘇木精溶于20mL 100%乙醇中得甲液，50g鉀明礬溶于300mL蒸饋水中得乙液；將甲液、乙液混合，煮沸2?3min，再加蒸饋水定容至1000mL ;最后加入0.2g碘酸鈉，即得。
[0020]所述伊紅染液為:將0.5g伊紅加入到100mL 85%乙醇中，溶解完全，即得。
[0021]所述HC1-乙醇分化液為:將lmL鹽酸加入到99mL 70%乙醇中，混勻，即得。
[0022]步驟￠)中所述染色為Η.E染色，操作步驟為:將切片依次置于二甲苯I lOmin、二甲苯 II lOmin、100 % 乙醇 I 5min、100 % 乙醇 II 5min、95 % 乙醇 5min、85 % 乙醇 5min、75%乙醇5min、水5min、蘇木精染液10?20min，流水沖洗5min，再置于HC1-乙醇分化液20?40s，流水沖洗10?30min，鏡檢，流水沖洗2min，再依次置于70%乙醇lmin、85%乙醇 lmin、伊紅染液 2min、95% 乙醇 I 2min、95% 乙醇 II 2min、100% 乙醇 I 2min、100% 乙醇Il2min、二甲苯I 5min、二甲苯II 5min。其中，1、II僅代表處理次數(shù)，如二甲苯I lOmin、二甲苯II lOmin分別為二甲苯第一次處理lOmin，二甲苯第二次處理lOmin。
[0023]本發(fā)明的有益效果:
[0024]本發(fā)明中小鯢科動物視網(wǎng)膜顯微組織切片的制備方法包括取材、固定、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、修整、切片與展片、貼片與烤片、H.E染色、封固等步驟，流程簡單，操作方便，獲得的切片完整，圖片結構清晰，為研究小鯢科動物視網(wǎng)膜結構提供了技術支持，適用于實驗室研究工作者對小鯢科動物視網(wǎng)膜組織形態(tài)結構的研究。
【附圖說明】
[0025]圖1為實施例1中山溪鯢(Batrachuperuspinchonii)視網(wǎng)膜石錯切片顯微圖。
【具體實施方式】
[0026]下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構成對本發(fā)明的任何限制。
[0027]實施例1
[0028]染液及分化液的配制:
[0029]蘇木精染液:將lg蘇木精溶于20mL 100%乙醇中得甲液，50g鉀明礬溶于300mL蒸饋水中得乙液；將甲液、乙液混合，煮沸2?3min，再加蒸饋水定容至1000mL ;最后加入
0.2g碘酸鈉，即得。
[0030]伊紅染液:將0.5g伊紅加入到100mL 85%乙醇中，溶解完全，即得。如果染不上色，可加入0.2%的冰醋酸稀釋，以促進伊紅染色。
[0031]HC1-乙醇分化液:將lmL鹽酸加入到99mL 70%乙醇中，混勻，即得。
[0032]本實施例中小鯢科動物山溪鯢(Batrachuperuspinchonii)視網(wǎng)膜顯微組織切片的制備方法，包括以下步驟:
[0033](1)取材:在室溫下，用手術刀和手術鉗將小鯢科動物的眼球完整無損的取出，并對多余的組織進行修剪；
[0034](2)固定:將采集的眼球投入10%福爾馬林固定液中進行固定，用量為眼球組織體積的15倍，做好標記以便于識別；
[0035](3)沖洗:將固定后的眼球組織用水沖洗過夜；
[0036](4)脫水:在室溫下，將乙醇脫水劑用蒸餾水配成不同的梯度濃度，然后將眼球組織置入，進行逐級脫水，即依次在50 %、70 %、80 %、90 %、95 %、100 %的乙醇中脫水，其中95%、100%乙醇各重復兩次，各級乙醇脫水的時間50min (如需過夜，眼球應停留在70%乙醇中)；
[0037](5)透明:透明分兩步，第一步采用100%乙醇和二甲苯按體積比1:1配制的透明液，透明時間為2.5min，第二步采用純的二甲苯透明液，透明時間為20min ；
[0038](6)浸蠟:將已透明的眼球放入體積比1:1的二甲苯與石蠟的混合液中25min，然