利用激光輔助酶解促進蛋白質n末端肽段鑒定的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用激光輔助酶解促進蛋白質N末端肽段鑒定的方法。
【背景技術】
[0002]蛋白質N末端的氨基酸起點受多種因素影響，如RNA的剪切，多種可選的翻譯起點，信號肽的切割，以及各種化學層面的翻譯后修飾。其中，化學翻譯后修飾包括乙酰化(影響蛋白質穩(wěn)定性)，甲基化，焦谷氨化和脫酰胺作用等。鑒定蛋白質N末端序列及其后修飾可以了解不同酶的作用底物和蛋白本身的理化性質，對于理解蛋白質的生物功能等具有重要意義。
[0003]目前，能同時鑒定不同修飾的蛋白質N末端的方法主要基于反向去除策略。反相去除策略主要原理是先在蛋白質層面進行所有的氨基全封閉，利用胰蛋白酶酶切后，在非N末端肽段上引入游離氨基，結合氨基反應材料，使得非N末端肽段去除，而蛋白質N末端肽段在上清液中得到分離富集。相關的科學研究主要基于合成不同的非N末端肽段去除材料，不斷提高去除效率。同時，氨基封閉后蛋白的酶解效率對于蛋白質N末端的鑒定也至關重要。然而，關于氨基封閉后蛋白酶解的研究卻鮮有報道。
[0004]紅外激光輔助酶解是近年提出的一種高效的促進酶解的手段，可以用于傳統(tǒng)的基于“鳥槍法”的蛋白質組學中，而將該輔助酶解方式應用于蛋白質N末端的鑒定未見報道。相比傳統(tǒng)的過夜酶解而言，利用紅外激光輔助酶解能夠將酶解消耗的時間縮短至四十秒內，同時提高酶解效率。因此，結合該酶解方式，可以促進蛋白質N末端肽段的鑒定。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種快速高效的蛋白質N末端肽段鑒定的方法。
[0006]本發(fā)明提供的蛋白質N末端肽段鑒定的方法，是利用激光輔助酶解為促進手段，其步驟為:
首先，對蛋白進行氨基封閉，再加入胰蛋白酶，加入量為蛋白重量的2.5%-5% ；
然后，利用808 nm紅外激光對蛋白和酶的混合物垂直照射5 s以上(一般為5 s-20 s)，對其進行激光輔助酶解；
最后，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALD1-ToF)或者液相色譜質譜聯(lián)用儀器(LC-MS/MS)進行蛋白質N末端的檢測。
[0007]本發(fā)明中，所述對蛋白進行氨基封閉的具體操作步驟如下:
(1)將蛋白溶于高濃度(一般為4Μ以上，如為4 Μ-10Μ)的鹽酸胍或尿素中進行變性處理；
(2)用等體積40-100mM三乙胺碳酸氫鹽稀釋后，再在溶液中加入5_8 mM 二硫蘇糖醇，置于60°C及以上溫度(一般為60-80°C)中反應至少0.5小時(一般為0.5-1小時)后，再加入2-2.5倍濃度的碘乙酰胺，閉光反應0.5-1小時； (3)用50-100mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液(pH 6.5)等無氨緩沖體系對蛋白進行溶液置換，并重復2次以上(一般為2-3次)置換動作；
(4)加入40-60mM甲醛和一半濃度的氰基硼氫化鈉反應4_16小時，或在反應4小時后，再加入0.5-1倍劑量甲醛和氰基硼氫化鈉反應2-6小時；
(5)用25-100mM三乙胺碳酸氫鹽對蛋白進行溶液置換，并重復2次以上(一般為2_3次)置換動作。
[0008]本發(fā)明中，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜分析與常規(guī)分析相同，具體步驟為:取0.lyg蛋白酶解液于革巴板上，再在蛋白革巴點上添加1 yL 4 mg/mla-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)基質，待液體干燥后，進入機器進行分析。
[0009]本發(fā)明中，利用LTQ Orbitrap XL對復雜樣的末端肽段進行通用的分離分析。相應的過程為:復雜樣的酶解液先經(jīng)過反相柱分離，再進入質譜進行分析，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)用Mascot或Maxquant進行搜庫，設置的搜庫參數(shù)為:Semi_ArgC，2個漏切位點，固定修飾(Lysdimethylat1n, Cys carbamidomethylat1n)，可變修飾(Met oxidat1n，N-terminalacetylat1n， N-terminal dimethylat1n， N-terminal Glu to pyro—Glu， N-terminalGin to pyro-Glu)0被鑒定到發(fā)生N-terminal acetylat1n，N-terminal dimethylat1n，N-terminal Glu to pyro-Glu 和 N-terminal Gin to pyro-Glu 修飾的肽段，被歸類為 N 末端肽。
[0010]利用本發(fā)明方法可以大大縮短蛋白質N末端肽段鑒定所需的酶解時間，使得單個蛋白的N末端肽段信號較傳統(tǒng)溶液酶解增強，同時，可以使得復雜蛋白質組樣本的N末端肽段鑒定數(shù)目得到提高。
【附圖說明】
[0011]圖1為氨基封閉的人血漿白蛋白的傳統(tǒng)過夜酶解液和激光輔助酶解液的MALD1-ToF 圖。
[0012]圖2為人血漿白蛋白N末端肽段與內標強度比值和酶解液量的線性關系(MALD1-ToF 信號)。
[0013]圖3為兩種酶解方式產(chǎn)生的人血漿白蛋白N末端肽與內標強度比值的比較(MALD1-ToF 信號)。
[0014]圖4為鼠肝中鑒定得到的N末端肽數(shù)目(LC-MS/MS鑒定結果)。
【具體實施方式】
[0015]實施例1:
一種能促進蛋白質N末端肽段鑒定的快速高效的酶解方法，具體操作步驟如下:
(1)將人血漿白蛋白溶于6Μ鹽酸胍中進行變性處理；
(2)用等體積50mM三乙胺碳酸氫鹽稀釋后，再在溶液中加入5 mM 二硫蘇糖醇，60°C反應半小時后，再加入12.5 mM的碘乙酰胺，閉光反應一小時；
(3)用100mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液(pH 6.5)對蛋白進行溶液置換，并重復3次置換動作；
(4)加入40mM甲醛和一半濃度的氰基硼氫化鈉反應8小時后，用25 mM三乙胺碳酸氫鹽對蛋白進行溶液置換，并重復三次置換動作；
(5)加入胰蛋白酶(蛋白量的2.5%)，利用808 nm紅外激光對蛋白和酶的混合物進行垂直照射40 s ；
(6)取0.1 μ g蛋白酶解液滴加在靶板上，進入基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜進行分析鑒定；
(7 )利用內標對該蛋白的N末端信號進行校正后，發(fā)現(xiàn)利用激光輔助酶解可以使得N末端肽段信號增強至傳統(tǒng)溶液酶解的1.2倍。
[0016] 實施例2:
一種能促進蛋白質N末端肽段鑒定的快速高效的酶解方法，具體操作步驟如下:
(1)將鼠肝蛋白溶于8mM尿素中進行變性處理；
(2)用等體積50mM三乙胺碳酸氫鹽稀釋后，再在溶液中加入5 mM 二硫蘇糖醇，60°C反應半小時后，再加入12.5 mM的碘乙酰胺，閉光反應一小時；
(3)用100mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液(pH 6.5)對蛋白進行溶液置換，并重復3次置換動作；
(4)加入40mM甲醛和一半濃度的氰基硼氫化鈉反應12小時后，用25 mM三乙胺碳酸氫鹽對蛋白進行溶液置換，并重復三次置換動作；
(5)加入胰蛋白酶(蛋白量的2.5%)，利用808 nm紅外激光對蛋白和酶的混合物進行垂直照射40 s ；
(6)取蛋白酶解液干燥后，進入液相色譜質譜聯(lián)用儀器進行分析鑒定，利用Mascot得到搜庫結果，利用本發(fā)明方法可以大大縮短蛋白質N末端肽段鑒定所需的酶解時間，同時使得復雜蛋白質組樣本的N末端肽段鑒定數(shù)目增加6.6%。
【主權項】
1.一種利用激光輔助酶解促進蛋白質N末端鑒定的方法，其特征在于具體步驟為: 首先，對蛋白進行氨基封閉，再加入胰蛋白酶，加入量為蛋白重量的2.5%-5%，得到蛋白和酶的混合物； 然后，利用808 nm紅外激光對蛋白和酶的混合物垂直照射5 s以上，對其進行激光輔助酶解； 最后，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜或者液相色譜質譜聯(lián)用儀器進行蛋白質N末端的檢測。2.根據(jù)權利要求1所述的利用激光輔助酶解促進蛋白質N末端鑒定的方法，其特征在于所述對蛋白進行氨基封閉的具體操作步驟如下: (1)將蛋白溶于4Μ以上的高濃度鹽酸胍或尿素中進行變性處理； (2)用等體積40-100mM三乙胺碳酸氫鹽稀釋后，再在溶液中加入5_8 mM 二硫蘇糖醇，置于60°C及以上溫度中反應0.5-1小時后，再加入2-2.5倍濃度的碘乙酰胺，閉光反應0.5-1小時； (3)用50-100mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶液的無氨緩沖體系對蛋白進行溶液置換，并重復2次以上置換動作； (4)加入40-60mM甲醛和一半濃度的氰基硼氫化鈉反應4_16小時，或在反應4小時后，再加入0.5-1倍劑量甲醛和氰基硼氫化鈉反應2-6小時； (5)用25-100mM三乙胺碳酸氫鹽對蛋白進行溶液置換，并重復2次以上置換動作。3.根據(jù)權利要求1所述的利用激光輔助酶解促進蛋白質N末端鑒定的方法，其特征在于所述的利用液相色譜質譜聯(lián)用儀器進行分析鑒定中涉及搜庫方式，其設置的搜庫參數(shù)為:Sem1-ArgC，2個漏切位點，固定修飾(Lys dimethylat1n，Cyscarbamidomethylat1n)，可變修飾(Met oxidat1n，N-terminal acetylat1n, N-terminal dimethylat1n, N-terminal Glu to pyro-Glu, N-terminal Gin to pyro-Glu);被鑒定到發(fā)生 N-terminal acetylat1n, N-terminal dimethylat1n, N-terminal Glu topyro-Glu和N-terminal Gin to pyro-Glu修飾的肽段，被歸類為N末端肽總數(shù)。
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術領域，具體為一種利用激光輔助酶解促進蛋白質N末端鑒定的方法。本發(fā)明方法的步驟：首先對蛋白進行氨基封閉，再加入胰蛋白酶（蛋白量的2.5%-5%）；然后用808？nm紅外激光垂直照射5-80？s封閉蛋白，對其進行激光輔助酶解；最后，利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜或者液相色譜質譜聯(lián)用儀器鑒定蛋白N末端肽段。本發(fā)明方法可以大大縮短蛋白質N末端肽段鑒定所需的酶解時間，使得單個蛋白的N末端肽段信號較傳統(tǒng)溶液酶解增強，同時，可以使得復雜蛋白質組樣本的N末端肽段鑒定數(shù)目得到提高。
【IPC分類】G01N27/62
【公開號】CN105301091
【申請?zhí)枴緾N201510794958
【發(fā)明人】張祥民, 李蘭婷
【申請人】復旦大學
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月18日