熒光成像自動聚焦系統(tǒng)和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開設(shè)及定量巧光成像，并且更具體地設(shè)及使用角照明的自動聚焦系統(tǒng)和方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 巧光成像的最近改進(jìn)是雙遠(yuǎn)屯、寬視野巧光掃描器，該雙遠(yuǎn)屯、寬視野巧光掃描器W 獨(dú)立于聚焦的行程間配準(zhǔn)（pass-to-passregistration)實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的量化測量。出于所有 目的W引用方式并入本文的于2014年6月23日提交的題為"遠(yuǎn)屯、寬視野巧光掃描系統(tǒng)和 方法（Telecentric,Wide-FieldFluorescenceScanningSystemsandMethods)"的美國 專利申請S/N14/312, 409論述雙遠(yuǎn)屯、寬視野巧光掃描系統(tǒng)的特征。該設(shè)計(jì)的一種特征是 角照明（激發(fā)），運(yùn)具有減少的光學(xué)背景和因此的較高靈敏度的益處。然而，角照明的缺點(diǎn) 是隨著樣本的高度改變，傳感器上的所成像的線的位置也改變。因此，為了全面利用該角照 明特征，重要的是追蹤隨著樣本的高度改變，激發(fā)光在何處擊中樣本。
[0003] 雙遠(yuǎn)屯、掃描器可使用的另一特征是差分掃描成像技術(shù)，該技術(shù)用于通過將來自 未照明區(qū)域的背景信號從檢測自照明區(qū)域的信號減去來實(shí)現(xiàn)高圖像性能。出于所有目 的W引用方式并入本文的于2011年4月11日提交的題為"差分掃描成像系統(tǒng)和方法 (DifferentialScanImagingSystemsandMethods)"的美國專利申請S/N13/084, 37論 述適用的差分掃描成像技術(shù)。當(dāng)結(jié)合角照明使用運(yùn)些技術(shù)時(shí)，希望巧光樣本的z高度相對 于掃描器系統(tǒng)是恒定的。如果樣本高度改變，那么來自照明區(qū)域的所檢測的信號跨越檢測 陣列"離開"，且因此所測量的信號的量不準(zhǔn)確。因此，在給定的固定檢測器陣列處于適當(dāng)位 置中的情況下，重要的是在收集實(shí)際成像數(shù)據(jù)之前校正樣本高度改變。
[0004] 奧爾森等人（美國專利7518652、7646495和7893988,所述專利各自W引用方式并 入本文中）設(shè)計(jì)在從顯微鏡載物片上的試樣捕捉圖像數(shù)據(jù)之前且在此期間將線掃描相機(jī) 聚焦的方式。所采取的做法由在掃描載物片之前計(jì)算聚焦信息組成。該聚焦信息是在點(diǎn)聚 焦或帶聚焦程序中獲得的。在點(diǎn)聚焦?fàn)顩r下，線掃描相機(jī)系統(tǒng)首先將載物片定位在所要的 測量位置處，將物鏡移動通過一組預(yù)定高度值，且在每一高度處獲取圖像數(shù)據(jù)，且接著確定 最大對比度的高度（Z軸設(shè)置），該最大對比度的高度進(jìn)而被確立為最佳聚焦高度。在帶聚 焦程序的情況下，隨著載物片處于掃描運(yùn)動中，物鏡W正弦方式連續(xù)移動。分析圖像數(shù)據(jù)， 且最大對比度的高度確定最佳聚焦Z高度。兩種程序的不同之處在于在圖像獲取期間，物 鏡的垂直運(yùn)動如何與載物片的水平運(yùn)動同步?？杀幻枋鰹?停走"方法的第一方法是緩慢 的，運(yùn)是因?yàn)橛捎谕Ｗ哌^程，存在相當(dāng)多的開銷時(shí)間。帶聚焦方法更快，但針對15mmX15mm 的掃描區(qū)域，仍花費(fèi)超過1分鐘。 陽0化]針對顯微成像而設(shè)計(jì)奧爾森的方法，其中照明光穿過顯微鏡物鏡，即，相對于成像 路徑是同軸的或不成角度的。運(yùn)意味隨著物鏡與樣本之間的垂直距離改變（Z軸），在x-y 平面中的成像傳感器上的位置不改變一一僅圖像對比度改變。在該顯微鏡構(gòu)造中，將物鏡 位置調(diào)整到不同高度位置且尋找圖像具有最高對比度的最佳位置是有意義的。然而，在角 照明的狀況下，成像傳感器上的x-y位置不隨著聚焦改變而改變。運(yùn)意味在可實(shí)施尋找最 佳聚焦的奧爾森的"停走"過程之前，將需要用于尋找x-y位置的額外步驟。針對帶聚焦方 法，將需要一組更精細(xì)的步驟。運(yùn)進(jìn)一步增加了復(fù)雜性且減慢了過程。
[0006] 此外，奧爾森的技術(shù)沒有提供由于樣本的Z高度改變而在檢測器上離開的所檢測 的信號。因此，在不同高度處獲得圖像的理念不起作用，運(yùn)是因?yàn)?，在許多Z高度處，將不存 在供檢測的信號（離開了檢測器）且因此任何基于對比度的方案將不能檢測最佳聚焦處于 何處。因此，必須首先使樣本高度接近給出最佳聚焦的標(biāo)稱高度，因此可（例如）使用差分 掃描成像技術(shù)來正確地測量最佳聚焦。
[0007] 因此，仍需要較穩(wěn)健的、定量的、快速的宏觀巧光成像器，其不具有對光在視野中 來自何處的角依賴性的限制。此外，仍需要準(zhǔn)確地維持在樣本上巧光光的原點(diǎn)的相對位置， W使得多行程圖像被準(zhǔn)確地對準(zhǔn)，且因此消除存在于當(dāng)前宏觀寬視野成像器中的依賴于聚 焦的位置移位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本公開設(shè)及定量巧光成像，且更具體地設(shè)及使用角照明來獲得自動聚焦信息的寬 視野巧光成像系統(tǒng)和方法。
[0009] 本發(fā)明的實(shí)施例結(jié)合檢測器陣列，諸如結(jié)合雙遠(yuǎn)屯、掃描器，使用W角照明進(jìn)行的 激光掃描（例如，點(diǎn)掃描或線掃描），運(yùn)有利地克服與先前自動聚焦方案相關(guān)聯(lián)的難點(diǎn)和缺 陷。本發(fā)明的實(shí)施例提供顯著較快且較簡單的過程來追蹤角照明光與樣本（例如巧光樣 本）相交的高度位置。
[0010] 根據(jù)一實(shí)施例，提供一種巧光成像系統(tǒng)，通常包括：樣本平臺，用于固持巧光材料； 光檢測器，具有用于檢測從巧光材料發(fā)射的光的感測位置的陣列；W及光學(xué)成像系統(tǒng)，定位 在樣本平臺與光檢測器之間，且被配置成將從樣本平臺上的場點(diǎn)發(fā)射的光聚焦到光檢測器 上，其中樣本平臺上的連續(xù)場點(diǎn)同時(shí)被成像到光檢測器上的連續(xù)感測位置上。成像系統(tǒng)通 常還包括照明系統(tǒng)，該照明系統(tǒng)包括發(fā)射處于巧光材料的吸收帶中的激發(fā)光的光源，其中 照明系統(tǒng)提供相對于檢測軸W-角度撞擊在巧光材料上的照明光束，其中光束的入射平面 包括檢測軸和掃描方向。成像系統(tǒng)通常還包括：掃描機(jī)構(gòu)，該掃描機(jī)構(gòu)實(shí)現(xiàn)沿著掃描方向相 對于樣本平臺的照明光束的連續(xù)掃描；W及智能模塊（例如一個(gè)或更多個(gè)處理器），該智能 模塊被禪接到光檢測器且被配置成基于光檢測器上由光檢測器檢測的最大照度（例如巧 光或激發(fā)散射）的位置的沿著掃描方向的變化來確定平行于檢測軸的巧光材料的高度的 沿著掃描方向的變化。
[0011] 在某些方面中，掃描機(jī)構(gòu)（例如）在成像模式中使均勻照明光束沿著掃描方向重 新掃描，且成像系統(tǒng)包括用于基于巧光材料的高度的所確定的變化來隨著發(fā)生掃描而調(diào)整 平臺的位置W便補(bǔ)償巧光材料的高度的所確定的變化的機(jī)構(gòu)。在某些方面中，系統(tǒng)包括存 儲器，該存儲器被附接到智能模塊W存儲平臺上的巧光材料的高度圖，該高度圖基于或包 括所確定的變化。
[0012] 在某些方面中，光學(xué)成像系統(tǒng)包括雙遠(yuǎn)屯、光學(xué)成像系統(tǒng)。在某些方面中，雙遠(yuǎn)屯、光 學(xué)成像系統(tǒng)包括奧夫納中繼鏡系統(tǒng)布置，該奧夫納中繼鏡系統(tǒng)布置包括具有球形鏡表面的 第一鏡元件W及具有球形鏡表面的第二鏡元件，其中入口孔徑光闊和出口孔徑光闊各自包 括第一鏡元件的一部分。在某些方面中，第一鏡元件呈現(xiàn)凸出狀鏡表面，且第二鏡元件呈現(xiàn) 凹入狀鏡表面。在某些方面中，雙遠(yuǎn)屯、光學(xué)成像系統(tǒng)包括雙遠(yuǎn)屯、鏡頭布置，其中入口孔徑光 闊包括第一折射鏡頭元件，且其中出口孔徑光闊包括第二折射鏡頭元件。
[0013] 在某些方面中，掃描機(jī)構(gòu)進(jìn)行W下調(diào)整中的一者：沿著掃描方向調(diào)整樣本平臺； 或沿著掃描方向調(diào)整光檢測器和照明光束。在某些方面中，照明光束具