一種利用抗體修飾免疫pcr反應(yīng)的檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測(cè)方法領(lǐng)域，具體涉及一種利用抗體修飾免疫PCR反應(yīng)的檢 測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] ELISA檢測(cè)技術(shù)從其發(fā)明之日起就在臨床和科研市場(chǎng)中得到越來(lái)越廣泛的應(yīng) 用(Lequin, R. Μ. (2005). Enzyme Immunoassay(EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA). Clinical Chemistry 51,2415 - 2418·)。隨著越來(lái)越精細(xì)的檢測(cè)需求，終端 用戶在體外診斷的靈敏度、動(dòng)態(tài)范圍和多通道檢測(cè)能力等方面有了越來(lái)越高的要求?；?抗體檢測(cè)的技術(shù)也越來(lái)越多樣化，出現(xiàn)了很多新技術(shù)。根據(jù)技術(shù)路線和需求的不同分為以 下幾類(lèi)：
[0003] 1.靈敏度的提升。經(jīng)過(guò)多年的技術(shù)升級(jí)和成熟，目前ELISA技術(shù)的靈敏度已經(jīng)達(dá) 到極限?，F(xiàn)有的嘗試也都是基于檢測(cè)方法的改進(jìn)來(lái)提升靈敏度，比如采用創(chuàng)新型微孔板技 術(shù)的 Siloam Biosciences 公司（ http://siloambio.com/)和應(yīng)用微珠技術(shù)的 Quanterix 公司（http://www.quanterix.com/)。
[0004] 2.多通道檢測(cè)。Luminex公司發(fā)明的像xMAP Multiplexing技術(shù)理論上可以最 多支持 500 種分析物的同時(shí)檢測(cè)（http://www. luminexcorp. com/TechnologiesScience/ xMAPTechnology/)。這種技術(shù)也是利用barcode的微珠標(biāo)記上不同抗體來(lái)檢測(cè)樣本中的多 種分析物。實(shí)際開(kāi)發(fā)中可以達(dá)到20種左右的生物標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)。
[0005] 3.液相 ELISA 技術(shù)（Bidinosti，M.，Shimshek，D. R.，Mol lenhauer，B.，Marcell in, D. , Schweizer, T. , Lotz, G. P. , Schlossmacher, M. G. , and Weiss, A. (2012). Novel one-step immunoassays to quantify ?-synuclein:applications for biomarker development and high-throughput screening. J. Biol. Chem. 287, 33691 - 33705.)〇
[0006] 將檢測(cè)抗原的兩種單抗分別標(biāo)記不同的微珠或者熒光基團(tuán)，利用抗體和抗原結(jié)合 時(shí)將兩種不同的微珠靠近或者熒光基團(tuán)發(fā)生共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)可以實(shí)現(xiàn)被檢標(biāo)志物的 液相檢測(cè)。這種檢測(cè)方法不再需要多步清洗而直接檢測(cè)，減少了檢測(cè)時(shí)間和自動(dòng)化的難度。
[0007] 4. ELISA 技術(shù)微型化（Ng, A. H. C.，Uddayasankar, U.，and Wheeler, A. R. (2010) · Immunoassays in microfluidic systems. Anal Bioanal Chem 397,991 - 1007.)〇 很多石開(kāi) 究將ELISA微型化至微流體芯片上從而實(shí)現(xiàn)ELISA實(shí)驗(yàn)的微型化和便攜性。
[0008] 上述ELISA的改進(jìn)都是在現(xiàn)有原理的基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化，因此也很難帶來(lái)本質(zhì)性 的性能提升。Immuno-PCR的工作原理如圖1所示。Immuno-PCR(免疫PCR)技術(shù)自1992 年 Sano 等人發(fā)明以來(lái)（Sano, T.，Smith, C. L.，and Cantor, C. R. (1992). Immuno-PCR: very sensitive antigen detection by means of specific antibody-DNA conjugates. Science 258, 120 - 122.)，曾經(jīng)一度被認(rèn)為是可以像PCR -樣檢測(cè)蛋白質(zhì)的技術(shù)，可惜受制于抗體 修飾技術(shù)而一直未能獲得商業(yè)上的成功。多年來(lái)抗體修飾一直依賴于間接修飾技術(shù)和直接 化學(xué)修飾技術(shù)。前一種技術(shù)利用生物素 Biotin隨機(jī)修飾抗體表面，然后在通過(guò)鏈親和素 (Streptavidin)將Biotin修飾的DNA和抗體以非共價(jià)鍵的方式稱聯(lián)。后一種是通過(guò)將抗 體或者DNA活化之后與DNA或者抗體上的自由氨基反應(yīng)達(dá)到共價(jià)耦聯(lián)。不過(guò)不論哪種方法 都是通過(guò)抗體上自由的氨基（比如Lysine)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這種耦聯(lián)技術(shù)不但需要抗體在非活 性的緩沖液中進(jìn)行耦聯(lián)，而且耦聯(lián)的位點(diǎn)也充滿隨機(jī)性，常常由于抗原抗體結(jié)合區(qū)附近被 奉禹聯(lián)的DNA屏蔽從而導(dǎo)致了抗體特異性和親和力的下降。這也是Immuno-PCR這么多年來(lái)在 實(shí)例中靈敏度難以突破1000倍而且提升程度不一的原因。因此，科研和生產(chǎn)中均需要一種 利用抗體修飾技術(shù)應(yīng)用于Immuno-PCR反應(yīng)的、靈敏度大大提高的檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種利用抗體修飾免疫PCR反應(yīng)的 檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，該方法通過(guò)抗體修飾技術(shù)在免疫PCR反應(yīng)中的應(yīng)用，可以進(jìn)行超 低濃度生物素標(biāo)志物的檢測(cè)。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 一種利用抗體修飾免疫PCR反應(yīng)檢測(cè)試劑盒，包括：帶DIB0標(biāo)記的核酸修飾的檢 測(cè)抗體、包被有帶DIB0標(biāo)記的生物素修飾的捕捉抗體的Immuno-PCR微孔板、用于擴(kuò)增核酸 的引物對(duì)、熒光定量染料混合體系。
[0012] 進(jìn)一步地，所述核酸為ssDNA;該ssDNA的DNA序列包括SEQ ID No. 1，用于擴(kuò)增該 ssDNA的引物對(duì)的DNA序列包括SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3。
[0013] 進(jìn)一步地，所述熒光定量染料混合體系包括：耐熱聚合酶反應(yīng)緩沖液、鎂離子、 dNTP、參考染料、PCR擴(kuò)增用DNA聚合酶、DNA結(jié)合染料。
[0014] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0015] -種利用抗體修飾免疫PCR反應(yīng)檢測(cè)方法，包括如下步驟：
[0016] DIB0標(biāo)記ssDNA的合成步驟：先通過(guò)DNA序列隨機(jī)合成網(wǎng)站生產(chǎn)ssDNA序列（SEQ ID No. 1)，再合成帶DIB0標(biāo)記的ssDNA ;
[0017] 捕捉抗體的生物素修飾步驟：將捕捉抗體利用帶DIB0標(biāo)記的生物素進(jìn)行生物素 修飾，得到帶DIB0標(biāo)記的生物素修飾的捕捉抗體；
[0018] 檢測(cè)抗體的ssDNA修飾步驟：將檢測(cè)抗體利用所述帶DIB0標(biāo)記的ssDNA進(jìn)行 ssDNA修飾，得到帶DIB0標(biāo)記的ssNDA修飾的檢測(cè)抗體；
[0019] Immuno-PCR微孔板的制備步驟：用所述帶DIB0標(biāo)記的生物素修飾的捕捉抗體包 被鏈親和素 PCR微孔板，再將該微孔板經(jīng)過(guò)孵育、清洗，得到Immuno-PCR微孔板；
[0020] 待測(cè)樣品的Immuno-PCR定量步驟：
[0021] 將待測(cè)樣品和所述帶DIB0標(biāo)記的ssNDA修飾的檢測(cè)抗體混合之后，加入所述 Immuno-PCR微孔板中；再經(jīng)過(guò)孵育、清洗，加入能夠特異擴(kuò)增ssDNA的引物對(duì)（SEQ ID No. 2 和3)進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，再完成ssDNA的PCR定量。
[0022] 進(jìn)一步地，所述捕捉抗體為Insulin單克隆抗體3A6,所述檢測(cè)抗體為Insulin單 克隆抗體8E2,所述待測(cè)樣品為Insulin。
[0023] 進(jìn)一步地，所述捕捉抗體的生物素修飾步驟中，先將捕捉抗體進(jìn)行第一輪純化處 理，再加入修飾酶進(jìn)行修飾反應(yīng)，再進(jìn)行第二輪純化處理，得到第二輪純化后的捕捉抗體； 再將所述第二輪純化后的捕捉抗體與于DIB0標(biāo)記的生物素進(jìn)行生物素標(biāo)記反應(yīng)，再進(jìn)行 親和純化處理，得到所述帶DIBO標(biāo)記的生物素修飾的捕捉抗體。
[0024] 進(jìn)一步地，所述檢測(cè)抗體的ssDNA修飾步驟中，先將檢測(cè)抗體進(jìn)行第一輪純化處 理，再加入修飾酶進(jìn)行修飾反應(yīng)，再進(jìn)行第二輪純化處理，得到第二輪純化后的檢測(cè)抗體； 再將所述第二輪純化后的檢測(cè)抗體與于DIB0標(biāo)記的ssDNA進(jìn)行ssDNA標(biāo)記反應(yīng)，再進(jìn)行親 和純化處理，得到所述帶DIB0標(biāo)記的ssDNA修飾的檢測(cè)抗體。
[0025] 進(jìn)一步地，所述待測(cè)樣品的Immuno-PCR定量步驟中，所述突光定量PCR反應(yīng)的條 件是：95°C 10分鐘；95°C 15秒，60°C 60秒，共40個(gè)循環(huán)。
[0026] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0027] 一種用于標(biāo)記抗體的ssDNA，其DNA序列包括SEQ ID No. 1。
[0028] 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下另一技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0029] 一種用于擴(kuò)增ssDNA的PRC引物對(duì)，其序列包括SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 3。
[0030] 本發(fā)明的Immuno-PCR檢測(cè)方法的工作原理圖如圖1所示。
[0031] 本發(fā)明的Immuno-PCR試劑盒的制備、使用流程圖如圖2所示。
[0032] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下有益效果：
[0033] 本發(fā)明公開(kāi)了一種超高靈敏度免疫診斷方法及其應(yīng)用，屬于臨床診斷試劑開(kāi)發(fā)領(lǐng) 域。
[0034] 1、本發(fā)明用于科研和臨床診斷，食品安全，農(nóng)殘檢測(cè)等市場(chǎng)。超過(guò)傳統(tǒng)ELISA方法 1000倍的靈敏度可以允許檢測(cè)濃度極低的生物標(biāo)志物，農(nóng)藥殘留?；蛘呖梢詫?duì)已有的樣本 進(jìn)行100-1000倍稀釋之后再進(jìn)行檢測(cè)，從而極大程度地節(jié)省珍貴的樣本，比如小兒血清或 者臨床PKPD (藥代動(dòng)力學(xué)）研究中的珍貴血清。
[0035] 2、本發(fā)明不但可以用于Insulin的檢測(cè)，而且可以適用于所有生物大分子，半抗 原，以及化學(xué)小分子的檢測(cè)。檢測(cè)形式不但可以適用于夾心法ELISA，還可以應(yīng)用于直接 ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法。酶學(xué)方法修飾抗體屬于位點(diǎn)特異性修飾反應(yīng)，有別于傳統(tǒng)氨基耦聯(lián) 方法產(chǎn)生的非均一性，隨機(jī)位點(diǎn)修飾。隨機(jī)修飾會(huì)經(jīng)常屏蔽抗原抗體結(jié)合區(qū)，改變抗體親和 力和特異性。定量PCR檢測(cè)方法的引入不但可以簡(jiǎn)化檢測(cè)流程，還可以提供更加寬廣的動(dòng) 態(tài)范圍和檢測(cè)靈敏度。Insulin的實(shí)例研究表明動(dòng)態(tài)范圍可以提升至至少7個(gè)數(shù)量級(jí)，檢測(cè) 靈敏度可以比傳統(tǒng)ELISA提高10000倍左右。
[0036] 3、本發(fā)明采用最新的一種酶學(xué)修飾抗體的方法（Boeggeman, E.，Ramakrishnan, B. ,Pasek, Μ. , Manzoni, Μ. , Puri, A. , Loomi