一種高效液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)尿液中8-羥基脫氧鳥苷和8-羥基鳥苷的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種高效液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)尿 液中8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] DNA和RNA氧化損傷應(yīng)激產(chǎn)物作為生物標(biāo)記物的潛在用途和價(jià)值是生物醫(yī)學(xué)研究 的一個(gè)重要方面。8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧作為兩種重要的氧化標(biāo)記物，在組織細(xì)胞 內(nèi)產(chǎn)生，經(jīng)血液運(yùn)輸，由腎臟隨尿液排出體外。由于兩種物質(zhì)在體內(nèi)較為穩(wěn)定，且尿液樣本 易得，可W實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)檢測(cè)，通過對(duì)尿液中兩種物質(zhì)的監(jiān)測(cè)可W為有效評(píng)價(jià)機(jī)體各種因素引 起的氧化損傷提供幫助。此外，通過對(duì)健康人體內(nèi)兩種生物標(biāo)記物的含量檢測(cè)，可W評(píng)估性 另IJ、年齡和吸煙等潛在因子的影響作用。因此，開發(fā)一種經(jīng)濟(jì)、高效的8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧檢測(cè)方法至關(guān)重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種高效液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)尿液 中8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧的方法，W解決現(xiàn)有技術(shù)存在的方法復(fù)雜，特異性較差和 靈敏度低的問題。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明要解決的技術(shù)方案如下：
[0005] -種高效液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)尿液中8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧 的方法，它采用高效液相色譜串聯(lián)二級(jí)質(zhì)譜技術(shù)分別檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液和經(jīng)過預(yù)處理的尿液 樣品中的8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧，先利用高效液相色譜技術(shù)將8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧分離，再利用二級(jí)質(zhì)譜同位素內(nèi)標(biāo)定量法，W標(biāo)準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的濃度比為X軸，標(biāo) 準(zhǔn)品與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比為Y軸，建立校準(zhǔn)曲線，計(jì)算出8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧的含 量，具體色譜條件為：
[0006] (1)高效液相色譜條件：
[0007] 流動(dòng)相A: 0.1 % v/v的甲酸水溶液；
[000引流動(dòng)相B:甲醇；
[0009] 色譜柱為叫timate Polar-RP,2. IX 100mm，3皿；
[0010] 流速為 0.4mL/min;
[001" 柱溫為30。。
[001^ 進(jìn)樣量化0化；
[0013] 采用梯度洗脫方式，見表1;
[0014] 表1液相梯度洗脫參數(shù)
[0015]
[0016] (2)質(zhì)譜條件：
[0017] 在電噴霧電離正離子檢測(cè)模式下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)的質(zhì)譜掃描模式;噴霧針電壓 為5500V;碰撞氣為5psi;氣簾氣為50psi;離子源霧化氣和加熱輔助氣均為65psi;脫溶劑氣 溫度為550°C。
[0018] 其中，所述的標(biāo)準(zhǔn)品溶液按照如下方法制備得到：
[0019] 分別準(zhǔn)確稱量5mg的8-徑基脫氧鳥巧和8-徑基鳥巧，于甲醇中溶解定容至IOmL,配 制成濃度分別為0.48mg/mL和0.485mg/mL的儲(chǔ)備液A和B，-20°C保存;取儲(chǔ)備液A和B各100化 混合后用甲醇稀釋后定容至IOmL,配制成8-徑基脫氧鳥巧濃度為4.祉g/mL，8-^基鳥巧濃 度為4.85iig/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液Cl，-20°C保存;取10化L混合標(biāo)準(zhǔn)液Cl用空白人工尿液基質(zhì)稀 釋后定容至5mL，配制得到8-徑基脫氧鳥巧濃度為96ng/mL，8-^基鳥巧濃度為97ng/mL的混 合標(biāo)準(zhǔn)液C2;取50化L混合標(biāo)準(zhǔn)液C2用空白人工尿液基質(zhì)稀釋后定容至5mL，配制得到8-徑 基脫氧鳥巧濃度為9.6ng/mL，8-徑基鳥巧濃度為9.化g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)液C3;
[0020] 準(zhǔn)確稱量5mg的[1化，1響]-8-徑基脫氧鳥巧，用甲醇溶解定容至IOmL后得到濃度為 49.55iig/mL的內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液，內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液經(jīng)甲醇稀釋至0.99 liig/mL得到內(nèi)標(biāo)物工作液D; 內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)物工作液D均于-20°C下保存；
[0021] 分別取25iil、5化L和10化L混合標(biāo)準(zhǔn)液C2用空白人工尿液基質(zhì)稀釋并定容至10化L 作為標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)點(diǎn)S5、S6和S7;分別取扣L、10化、5化L和10化L混合標(biāo)準(zhǔn)液C3用空白人工尿液 基質(zhì)稀釋并定容至I(K)化，得到標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)點(diǎn)S1、S2、S3和S4;運(yùn)7個(gè)濃度點(diǎn)體積均為I(K)化;然 后向各組標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)點(diǎn)中加入15化0.99liig/mL內(nèi)標(biāo)物工作液D，混合均勻后用甲醇定容至 〇.5mL，然后滿旋20秒后振蕩lOmin，于4°C下12000g離屯、5min后取10化上清液，即得標(biāo)準(zhǔn)品 溶液；
[0022] 其中，
[0023] Sl、S2、S3、S4、S5、S6和S7作為8-徑基脫氧鳥巧的校準(zhǔn)點(diǎn)，S2、S3、S4、S5、S6和S7作 為8-徑基鳥巧的校準(zhǔn)點(diǎn)。
[0024] 其中，所述的空白人工尿液基質(zhì)為實(shí)驗(yàn)室人工配置的模擬尿液;其中，所述的空白 人工尿液基質(zhì)由如下方法制備得到：
[00巧]分別取0.5586g二水合氯化巧、0.6099g六水合氯化儀、4.2077g氯化鋼、2.0596g硫 酸鋼、O . 6470g巧樣酸鋼二水合物、O . 0201g草酸鋼、2.5449g憐酸二氨鐘、1.4388g氯化鐘、 0.9200g氯化錠、2.4985g尿素和1.0520g肌酢用去離子水溶解并定容至IL。
[00%] 其中，尿液樣品的預(yù)處理方法為:取10化L尿液至1.5mL離屯、管中，加入15化內(nèi)標(biāo)物 工作液D后混勻，再用甲醇定容至0.5血，縱滿振蕩Imin，于4°C下12000g離屯、5min，取10化上 清液即可。
[0027]其中，準(zhǔn)確稱量5mg的[1化，15化]-8-徑基脫氧鳥巧，用甲醇溶解定容至IOmL后得到 濃度為49.5化g/mL的內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液，內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液經(jīng)甲醇稀釋至0.99化g/mL得到內(nèi)標(biāo)物工 作液D;內(nèi)標(biāo)物儲(chǔ)備液和內(nèi)標(biāo)物工作液D均于-20°C下保存。
[002引有益效果：
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法高效穩(wěn)定，回收率和穩(wěn)定性良好（批內(nèi)精密度在 3.63 %~6.39 %之間，批間精密度在3.88 %~9.35 %之間，批內(nèi)和批間RSD均在10 % W內(nèi)， 平均回收率在91.90 %~116.76%之間），具有準(zhǔn)確、簡便、經(jīng)濟(jì)、高效等優(yōu)點(diǎn)，適于臨床檢測(cè) 中推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0030] 圖Ia為標(biāo)準(zhǔn)品中8-徑基脫氧鳥巧定量離子對(duì)的選擇離子流色譜圖；
[0031] 圖化為標(biāo)準(zhǔn)品中8-徑基脫氧鳥巧定性離子對(duì)的選擇離子流色譜圖；
[0032] 圖Ic為標(biāo)準(zhǔn)品中8-徑基鳥巧定量離子對(duì)的選擇離子流色譜圖；
[0033] 圖Id為標(biāo)準(zhǔn)品中8-徑基鳥巧定性離子對(duì)的選擇離子流色譜圖；
[0034] 圖Ie為標(biāo)準(zhǔn)品中[1化，15化]-8-徑基脫氧鳥巧的選擇離子流色譜圖；
[0035] 圖If為標(biāo)準(zhǔn)品中[1化，15化]-8-徑基脫氧鳥巧的選擇離子流色譜圖；
[0036] 圖2a為尿液樣品中8-徑基脫氧鳥巧定量離子對(duì)的選擇離子流色譜圖；
[0037] 圖化為尿液樣品中8-徑基脫氧鳥巧定性離子對(duì)的選擇離子流色譜圖；
[0038] 圖2c為尿液樣品中8-徑基鳥巧定量離子對(duì)的選擇離子流色譜圖；
[0039] 圖2d為尿液樣品中8-徑基鳥巧定性離子對(duì)的選擇離子流色譜圖；
[0040] 圖化為尿液樣品中[1?, IS化]-8-徑基脫氧鳥巧的選擇離子流色譜圖；
[0041] 圖2f為尿液樣品中[1?, IS化]-8-徑基脫氧鳥巧的選擇離子流色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0042] 根據(jù)下述實(shí)施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí) 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] 1、材料
[0045] 方法學(xué)研究實(shí)驗(yàn)的樣本來自于上海迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所員工的尿液樣本。
[0046] (1)儀器：LC-20AD液相色譜儀（島津，日本）、API4000+S重四極桿質(zhì)譜儀（AB Sciex,美國）、優(yōu)普超純水機(jī)(超純，成都）、多管滿旋混合儀(杭州奧盛儀器有限公司）；快速 混勻器(新康，江蘇）、高速冷凍離屯、機(jī)（白洋，北京）、色譜分離柱為叫timate化Iar-RP 3皿 2. IX 100、可調(diào)移液器（ThermoFisher，0.5~10化，10~100化，100~1000化）和玻璃儀器、 燒杯、量筒等。
[0047] (2)試劑耗材：甲醇、乙臘均為色