醒腦靜注射液液相指紋圖譜的測定方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥指紋圖譜分析方法，具體涉及醒腦靜注射液液相指紋圖譜測定方法，及其所得到的醒腦靜注射液液相指紋圖譜。
【背景技術(shù)】
[0002]我國傳統(tǒng)中藥制劑成分復(fù)雜，一般質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中含量測定只涉及處方中君藥的I?3個成分，難以有效的控制其內(nèi)在質(zhì)量，從而無法保證用藥的安全性、有效性，尤其是經(jīng)靜脈途徑用藥的中藥注射劑，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已無法保證其安全性。故只有不斷進(jìn)行科學(xué)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，才能逐步符合中藥及中藥發(fā)展的要求，真正的做到“安全、有效、穩(wěn)定、可控”。
[0003]醒腦靜注射液是由麝香、冰片、郁金和梔子經(jīng)水蒸氣蒸餾提取精制而成的復(fù)方中藥注射液，始創(chuàng)于上世紀(jì)70年代，組方由中醫(yī)名方安宮牛黃丸化裁而得，具有清熱解毒，涼血活血，開竅醒腦功效。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)WS3-B-3353-98-2003，其中鑒別包括麝香的鑒別，含量測定僅有冰片的檢測。
[0004]已有的醒腦靜注射液質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報道，全部是以麝香酮和/或龍腦為質(zhì)控指標(biāo)，檢測方法主要為氣相色譜法(GC)和氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)，僅有I篇文獻(xiàn)采用HPLC法測定醒腦靜中麝香酮的含量。且專利(專利申請?zhí)?00910186698.X)僅建立一種氣相測定的指紋圖譜方法，在該指紋圖譜中，麝香酮和龍腦的總含量占到總峰面積的90%之上，其他成分的信息掩蓋較多；而液相色譜法可有效排除了麝香酮和龍腦含量過高造成的不利影響。而且理論上，所有化學(xué)成分都應(yīng)具有某些藥理活性，而且往往微量成分的作用在整個處方或制劑中的作用舉足輕重。
[0005]基于此，本發(fā)明首次采用高效液相法建立了醒腦靜注射液的指紋圖譜，對該注射液的化學(xué)成分概貌有一個全面的認(rèn)識。同時生產(chǎn)過程中，氣相指紋圖譜與液相指紋圖譜共同運用，可進(jìn)一步提高制劑的質(zhì)量可控性需求，滿足制劑的“安全、有效、穩(wěn)定、可控”。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種醒腦靜注射液液相指紋圖譜的測定方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0007]本發(fā)明通過對醒腦靜注射液液相指紋圖譜的研究，提供了一種快速評價該制劑中成分質(zhì)量的方法，彌補了現(xiàn)有質(zhì)量控制技術(shù)的不足的缺點，使醒腦靜注射液質(zhì)量控制技術(shù)更為完善，也更為科學(xué)。
[0008]本發(fā)明所述的一種醒腦靜注射液的液相指紋圖譜測定方法，包括以下步驟
[0009]—種醒腦靜注射液的有效成分含量測定方法，包括以下步驟:
[0010]I)供試品溶液的制備:取醒腦靜注射液3?5支，傾出內(nèi)容物，混勻，精密吸取5?1mL，通過固相萃取小柱，流出液棄去，用I?5mL有機溶劑洗脫，收集洗脫液，置I?5mL量瓶中，加有機溶劑至刻度，搖勻，作為供試品溶液；
[0011]2)對照品溶液的制備:分別稱取優(yōu)香芹酮、樟腦、莪術(shù)二酮、吉馬酮、姜黃烯酮、莪術(shù)酮和莪術(shù)烯醇對照品適量，置于容量瓶中，加有機溶劑溶解并稀釋至刻度，制成混合對照品溶液；
[0012]3)測定方法:分別吸取對照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，得到色圖譜，根據(jù)色譜圖計算供試品溶液中的有效成分含量；
[0013]其中的色譜系統(tǒng)條件:色譜柱:C18柱;流動相:乙腈(A)-甲酸水溶液(B)梯度洗脫，流速I.0?2.0mL/min ；檢測波長254nm ；柱溫30?40°C，
[0014]洗脫條件-Ο-δπ?η,ΑΟ^ΑΑ-δΟπ?η,ΑΟ^-ΘΟ^ΑΑΟ-ΘΟπ?ηΑΟ^-ΙΟΟ^ΑΑΟ-θδπ?η,ΙΟΟ^ΑΑδ.ΟΙ-Τδπ?η,^^Α。
[0015]其中，步驟I)中所用的固相萃取小柱選自C18或C8的固相萃取小柱。
[0016]其中，步驟I)和步驟2)所用的有機溶劑選自:甲醇、乙醇、乙腈、正己烷等有機溶劑。
[0017]其中，步驟3)甲酸水溶液濃度為0.01?0.05%。
[0018]優(yōu)選的，測定方法，包括以下步驟:
[0019]I)供試品溶液的制備:取醒腦靜注射液3?5支，傾出內(nèi)容物，混勻，精密吸取5mL，通過C8固相萃取小柱，流出液棄去，用ImL甲醇洗脫，收集洗脫液，置ImL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；
[0020]2)對照品溶液的制備:分別稱取優(yōu)香芹酮、樟腦、莪術(shù)二酮、吉馬酮、姜黃烯酮、莪術(shù)酮和莪術(shù)烯醇對照品適量，置于同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成優(yōu)香芹酮、樟腦、莪術(shù)二酮、吉馬酮、姜黃烯酮、莪術(shù)酮和莪術(shù)烯醇經(jīng)適當(dāng)稀釋后得最終質(zhì)量濃度介于0.lmg/mL?I.0mg/mL的單個對照品溶液；
[0021]3)測定方法:分別吸取對照品溶液與供試品溶液，注入液相色譜儀，得到色圖譜，根據(jù)色譜圖計算供試品溶液中的有效成分含量；
[0022]其中，液相色譜系統(tǒng)條件:
[0023]色譜柱:C18(4.6mm X 250mm，5μπι);流動相:乙腈(A)-0.02 %甲酸水溶液(B)梯度洗脫，洗脫條件:0-511^11，40%八；5-5011^11，40%-60%八；50-6011^11，60%-100%八；60-6511^11，100%A;65.01-75min，40%A;流速 1.01111711^11;檢測波長25411111;柱溫35°(3;進(jìn)樣量:2(^1^。
[0024]本發(fā)明進(jìn)一步提供一種醒腦靜注射液液相標(biāo)準(zhǔn)圖譜的建立方法，步驟如下:
[0025]I)取多批次合格的醒腦靜注射液，傾出內(nèi)容物，混勻，精密吸取5mL，通過C8固相萃取小柱，流出液棄去，用ImL甲醇洗脫，收集洗脫液，置ImL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液；
[0026]2)吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，得到色圖譜，根據(jù)所得到的多批合格產(chǎn)品的色譜圖，用指紋圖譜軟件歸一成一個醒腦靜注射液標(biāo)準(zhǔn)對照液相指紋圖譜，其中吸收峰總計為11個；
[0027]其中，所述液相色譜的色譜條件如下:
[0028]色譜柱:C18(4.6mm X 250mm，5μπι)；流動相:乙腈(A)-0.02%甲酸水溶液(B)梯度洗脫，洗脫條件:0-511^11，40%八；5-5011^11，40%-60%八；50-6011^11，60%-100%八；60-6511^11，100%A;65.01-75min，40%A;流速 1.01111711^11;檢測波長25411111;柱溫35°(3;進(jìn)樣量:2(^1^。
[0029]本發(fā)明的測定方法是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下:
[0030]1.儀器與試劑
[0031]1.1儀器
[0032]日本島津LC-20AT高效液相色譜儀(SIL-20A自動進(jìn)樣器、CT0-10AS柱溫箱、檢測器:SPD-M20A)，LabsOlut1ns色譜工作站；1/10萬電子分析天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，5爵士)。
[0033]1.2試劑
[0034]莪術(shù)二酮(批號E-009-110603)和吉馬酮(批號111665-201103)購自成都彼斯特生物科技有限公司。樟腦(批號Z-018-140801)購自成都瑞芬思生物科技有限公司。優(yōu)香芹酮(2，6，6_三甲基-2，4-環(huán)庚烯-1-酮)、姜黃烯酮、莪術(shù)烯醇和莪術(shù)酮均由本實驗室自制，經(jīng)NMR和MS確定結(jié)構(gòu)。以上對照品經(jīng)HPLC測定純度>98%。
[0035]2.色譜系統(tǒng)條件:
[0036]色譜柱:C18(4.6mmX 250mm,5μπι)；流動相:乙腈(A)-0.02%甲酸水溶液(B)梯度洗脫，洗脫條件:0-511^11，40%八；5-5011^11，40%-60%八；50-6011^11，60%-100%八；60-6511^11，100%A;65.01-75min，40%A;流速 1.01111711^11;檢測波長25411111;柱溫35°(3;進(jìn)樣量:2(^1^。
[0037]3.供試品溶液制備
[0038]取醒腦靜注射液3?5支，傾出內(nèi)容物，混勻，精密吸取5mL，通過C8固相萃取小柱，流出液棄去，用ImL甲醇洗脫，收集洗脫液，置ImL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。
[0039]4.對照品溶液制備
[0040]分別精密稱取優(yōu)香芹酮、樟腦、莪術(shù)二酮、吉馬酮、姜黃烯酮、莪術(shù)酮和莪術(shù)烯醇對照品適量，置于同一容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成一定濃度的混合對照品溶液。
[0041 ] 5.方法學(xué)驗證
[0042]5.1穩(wěn)定性試驗
[0043]精密吸取同一批號醒腦靜注射液(120107)供試品溶液，按色譜條件分別于制樣后
011、211、411、611、1211和2411小時進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3% (n = 6)，結(jié)果說明供試品的穩(wěn)定性良好。
[0044]5.2精密度試驗
[0045]精密吸取同一批號醒腦靜注射液(120107)供試品溶液，按照色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖。各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3% (n = 6)，結(jié)果說明儀器的精密度良好。
[0046]5.3重復(fù)性試驗
[0047]取同一批號醒腦靜注射液(120