Mops殘留量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于MOPS檢測技術(shù)領(lǐng)域涉，尤其涉及一種MOPS殘留量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 3-(N-嗎啉）丙橫酸，英文名稱：3-(N_Morpholino)propane-sulfonic acid，縮寫 為MOPS，分子式:C7H15N04S，分子量:209.2633，pH值范圍：6.5-7.9，為白色結(jié)晶粉末，熔點為 277-282°Γ . 2〇°Γ時的水滾忡為1 000g/L，相對密度為1 · 298g/cm3，其結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0003]
[0004] MOPS作為一種常用的生物緩沖溶液，可用于較多生物制品的生產(chǎn)純化。因此，生物 制品中MOPS的殘留量與生物制品的純度直接相關(guān)，檢測MOPS殘留量具有重要的意義。然而 中國藥典、美國藥典中的殘留溶劑測定法以及《ICH Q3c雜質(zhì)：中殘留溶劑的指導(dǎo)原則》中， MOPS均不屬于第一至第四類溶劑的限度要求。中國科學(xué)院化學(xué)物質(zhì)毒性數(shù)據(jù)庫中，MOPS鵪 鶉口服的LD50為>316mg/kg，折算成人劑量為>52 · 67mg/kg。
[0005] 上海博唯生物科技有限公司在生產(chǎn)重組人乳頭瘤病毒疫苗(HPV)的純化過程中使 用MOPS作為緩沖溶液，為保證疫苗的安全性，需要對生產(chǎn)工藝過程中使用的所有可能有毒 的物質(zhì)進(jìn)行殘留量檢測。純化后的HPV疫苗成品中MOPS殘留量折算成人劑量為0.0009mg/kg (遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于52.67mg/kg)，用常規(guī)化學(xué)滴定法檢測不出。同時，MOPS為兩性化合物，具有較大 的極性，用常規(guī)C18柱進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析時，也無保留或無紫外吸收。針對微量 MOPS檢測方法或MOPS殘留量的檢測方法目前還沒有相關(guān)報道。因此迫切需要一種檢測微量 MOPS殘留量的方法，以確定HPV疫苗成品中MOPS殘留量符合純度的要求，保證生物制品的安 全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種MOPS殘留量的檢測方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)不能檢測微 量MOPS殘留的缺陷，能夠檢測出HPV疫苗成品中MOPS殘留量，確保了HPV疫苗成品的安全性， 具有檢測精密度、檢測靈敏度和準(zhǔn)確性高的特點。
[0007] 本發(fā)明的第一個方面，提供了一種MOPS殘留量的檢測方法，該方法以高效液相色 譜法進(jìn)行檢測，采用線性歸一法對MOPS進(jìn)行定量。
[0008] 所述高效液相色譜法的色譜柱為Acclaim Trinity P1。
[0009] 所述高效液相色譜法采用電噴霧檢測器。
[0010] 所述高效液相色譜法的流動相為乙腈和醋酸銨溶液混合液，體積比為1:1~2:1。
[0011] 所述流動相的流速為0.4~0.6ml/min。
[0012]本發(fā)明的另一個方面，提供了所述的MOPS殘留量的檢測方法在生物制品的MOPS殘 留量檢測中的應(yīng)用。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，所述生物制品為HPV疫苗。
[0014] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下有益效果：
[0015] 1)本發(fā)明的一種MOPS殘留量的檢測方法，采用高效液相色譜進(jìn)行檢測，色譜柱為 Acclaim Trinity P1，能夠檢測出化學(xué)滴定法及C18柱液相色譜檢測不出的HPV疫苗中的微 量MOPS成分，為HPV疫苗或含有微量MOPS成分生物制品的安全性提供了很好的保證。
[0016] 2)本發(fā)明的MOPS殘留量的檢測方法具有良好的檢測精密度，且其檢測靈敏度和準(zhǔn) 確性高，可廣泛應(yīng)用于生物制品的MOPS殘留量的檢測。
【附圖說明】
[0017]圖1為濃度1.0mm〇l/L的MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液分離圖譜；
[0018] 圖2為空白對照及1.0mmol/L MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液（空白對照稀釋）的對照圖譜，圖中較 上的曲線表示1.0mm〇l/L MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液(空白對照稀釋)分離曲線，較下的曲線表示空白對 照的分離曲線。
[0019] 圖3為濃度0. lmmol/L~5.0mmol/L的MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性疊加圖譜，圖中由下至 上曲線濃度分別為：0· lmmol/L、0· 2mmol/L、0· 5mmol/L、1 ·0mmol/L、5·0mmol/L。
[0020] 圖4為四個批次樣品的分離圖譜。
【具體實施方式】
[0021] 以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本 發(fā)明而非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0022] 本發(fā)明采用的試劑、藥品或儀器皆為市售，其中MOPS標(biāo)準(zhǔn)品（上海源聚生物科技有 限公司，純度:99.6%)，乙腈(色譜純），高效液相色譜儀(型號:1]出11^6 3000)。
[0023] 分析溶液配制步驟:
[0024] 流動相制備：
[0025] 1)稱取1.54g醋酸銨溶于1000ml去離子水中，攪拌均勻制備得到0.02m〇VL的醋酸 銨溶液，滴加醋酸調(diào)節(jié)pH至5.0。
[0026] 2)配置乙腈和醋酸銨溶液的混合溶液，體積比為1.5:1，搖勻得到流動相。濃度 0.1謹(jǐn)ol/L~5 · Ctamol/LMOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：
[0027] 準(zhǔn)確稱取1.045克MOPS標(biāo)準(zhǔn)品加去離子水定容到1L，即得濃度為5.0mmol/L的標(biāo)準(zhǔn) 溶液，再分別稀釋成1.0、0.5、0.2、0. lmmo 1/L的MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0028] 空白對照（樣品空白緩沖溶液）的配制：稱取NaCl 28.4g，組氨酸3.08g，加入聚山 梨酯-800.2ml后，加適量超純水溶解，用鹽酸調(diào)pH值至6.2，加超純水定容至1000ml。
[0029] 1 .Ommol/L MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液（空白對照稀釋）：用樣品空白緩沖溶液稀釋5.0mmol/L 的標(biāo)準(zhǔn)溶液至1. Ommol/LMOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0030] 具體色譜條件:采用高效液相色譜技術(shù)分析HPV疫苗中的微量MOPS殘留，具體參數(shù) 如表1所示。
[0031] 表1色譜條件
[0032]
[0033」 參考例1:
[0034] 采用高效液相色譜法檢測濃度為1.0mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到標(biāo)準(zhǔn)溶液的分離圖 譜，如圖1所示。由圖1可以看出，濃度為1. Ommo 1/L的MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液在保留時間為2.47min處 出現(xiàn)MOPS特征峰。
[0035] 參考例2:
[0036] 采用高效液相色譜法分別對空白對照(0mmol/L MOPS)及1.0mmol/L MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶 液(空白對照稀釋)進(jìn)行檢測，得到對照圖譜如圖2所示。
[0037]由圖2可以看出，空白對照進(jìn)樣后沒有檢測出MOPS特征峰，而1.0mmol/L MOPS標(biāo)準(zhǔn) 溶液(空白對照稀釋)在保留時間為2.49min處可檢測出明顯的MOPS特征峰。
[0038] 注:MOPS采用液相色譜檢測的正常保留時間在2.40±0.10min范圍之間。
[0039]實施例 1-3:
[0040] 分別對3份1. Ommo 1/L的MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量檢測，檢測條件：色譜柱:Acclaim Trinity P1，柱溫分別為30°C，35°C，40°C，霧化溫度分別為25°C，30°C，35°C，流動相：乙腈 和醋酸銨溶液的混合液，體積比分別為1.1:1，1.5:1，2:1，流速分別為:0.4ml/min，0.5ml/ 111；[11，0.61111/111；[11，進(jìn)樣量分別為 :3以1^，5以1^，1(^。檢測結(jié)果如表1所示。
[0041] 表11.0mmol/L MOPS標(biāo)準(zhǔn)品在不同檢測條件下的檢測結(jié)果
[0042]
[0043] 由表1可以看出，實施例卜3的檢測條件下均能檢測出MOPS，且保留時間在2.44min 左右，峰面積相近，說明實施例1-3的色譜條件均能實現(xiàn)微量MOPS的檢測，而實施例2條件下 所得色譜峰的對稱性最好，因此實施例2的色譜條件較優(yōu)。
[0044] 實施例4:
[0045] 對8份lmmol/L的MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行定量檢測，檢測條件：色譜柱為Acclaim Trinity P1，柱溫為35°C;霧化溫度為30°C，流動相：乙腈和醋酸銨溶液的混合液，體積比為 1.5:1，流速:0.5ml/min，進(jìn)樣量:5yL。
[0046] 所得MOPS的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD ( % )為：1.89 %，說明本申請的檢測方法具有良好的 精密度。
[0047] 實施例5-9:
[0048] 分別檢測濃度為0 · lmmol/L(定量限）、0 · 5mmol/L、1 · 0mmol/L、2 · 0mmol/L、 5.0mmol/L的MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液，檢測條件:色譜柱:Acclaim Trinity PI，柱溫為35°C;霧化溫 度為30°C，流動相：乙腈和醋酸銨溶液的混合液，體積比為1.5:1，流速:0.5ml/min，進(jìn)樣量： 5yL，得到線性疊加圖譜如圖3所示，對應(yīng)的濃度-峰面積對應(yīng)關(guān)系如表2所示：
[0049] m?.
[0050]
[0051 ]由圖3可以看出，濃度不同的MOPS標(biāo)準(zhǔn)溶液均在保留時間為2.49min處出現(xiàn)MOPS特 征峰。由表2可以得出，相關(guān)系數(shù)R2為0.9990，所以用該方法測定MOPS殘留量，濃度在定量限 至5mmol/L之間呈現(xiàn)良好的線性。
[0052]分析方法的檢測限D(zhuǎn)L和定量限QL由信噪比（S/N)計算，以本發(fā)明提供的方法進(jìn)行 檢測，檢測限為0.05mmol/L，定量限為O.lmmol/L。說明本發(fā)明的檢測方法靈敏度高。
[0053] 實施例10:
[0054]將4個批次的樣品，通過高效液相色譜儀進(jìn)樣分析，檢測四個批次的樣品中的微量 MOPS殘留量。檢測條件:色譜柱為Acclaim Trinity P1，柱溫為35°C;霧化溫度為30°C，流動 相：乙腈和醋酸銨溶液的混合液，體積比為1.5:1，流速為:0.5ml/min，進(jìn)樣量為:5yL，四個 批次樣品的分析疊圖如圖4所示，對應(yīng)的MOPS殘留量分析結(jié)果如表3所示。
[0055]表3樣品分析結(jié)果
[0056]
[0057]由圖4可以看出，檢測的4個不同批次的樣品均出現(xiàn)了 MOPS特征峰，四個樣本的譜 圖曲線基本重疊，保留時間均在2.40min左右，且MOPS特征峰面積基本相同，說明本發(fā)明的 技術(shù)方案能夠檢測出樣本中微量的MOPS，且準(zhǔn)確性高。
[0058]由表3的結(jié)果可以看出，最終測出MOPS殘留量在0.10mmoL/L左右，說明本發(fā)明的檢 測方法能夠檢測出HPV疫苗中的微量的MOPS殘留，且檢測性能穩(wěn)定，準(zhǔn)確性高。
[0059]雖然以上實施例僅對HPV疫苗中的微量MOPS殘留進(jìn)行了檢測，但是本領(lǐng)域的技術(shù) 人員容易理解，本發(fā)明的方法對于生產(chǎn)過程中使用MOPS的其他生物制品同樣適用，這是顯 而易見的。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，任何對該實用進(jìn)行的等同修改和替代也都在本發(fā)明 的范疇之中。因此，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應(yīng)涵蓋在本 發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種MOPS殘留量的檢測方法，其特征在于，以高效液相色譜法進(jìn)行檢測，采用線性歸 一法對MOPS進(jìn)行定量。2. 如權(quán)利要求1所述的一種MOPS殘留量的檢測方法，其特征在于，所述高效液相色譜法 的色譜柱為Acclaim Trinity P1。3. 如權(quán)利要求1所述的一種MOPS殘留量的檢測方法，其特征在于，所述高效液相色譜法 采用電噴霧檢測器。4. 如權(quán)利要求1所述的一種MOPS殘留量的檢測方法，其特征在于，所述高效液相色譜法 的流動相為乙腈和醋酸銨溶液混合液，所述乙腈與醋酸銨溶液體積比為1:1~2:1。5. 如權(quán)利要求1所述的一種MOPS殘留量的檢測方法，其特征在于，所述流動相的流速為 0·4~0·6ml/min〇6. 如權(quán)利要求1 -5中任一項所述的MOPS殘留量的檢測方法在生物制品的MOPS殘留量檢 測中的應(yīng)用。7. 如權(quán)利要求6所述應(yīng)用，其特征在于，所述生物制品為HPV疫苗。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種MOPS殘留量的檢測方法，以高效液相色譜法進(jìn)行檢測，采用線性歸一法對MOPS進(jìn)行定量。所述高效液相色譜法的采用Acclaim？Trinity？P1色譜柱和電噴霧檢測器，流動相為乙腈和醋酸銨溶液混合液，乙腈與醋酸銨溶液的體積比為1:1～2:1，流動相流速為0.4～0.6mL/min。本發(fā)明的MOPS殘留量的檢測方法，能夠檢測出化學(xué)滴定法及C18柱液相色譜檢測不出的HPV疫苗中的微量MOPS成分，具有良好的檢測精密度，且其檢測靈敏度和準(zhǔn)確性高，可廣泛應(yīng)用于生物制品的MOPS殘留量檢測。
【IPC分類】G01N30/60, G01N30/06
【公開號】CN105548420
【申請?zhí)枴緾N201511022203
【發(fā)明人】周朝明
【申請人】上海博唯生物科技有限公司
【公開日】2016年5月4日
【申請日】2015年12月30日