一種朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒及其檢測方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于植物病毒檢測技術領域，具體涉及一種朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑 盒及其檢測方法與應用。
【背景技術】
[0002] 朱頂紅裡綠環(huán)斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus，HCRV)屬于布尼 亞病毒科〇311]15^￥；[1^(^6)番前斑萎病毒屬(1'08卩0￥；[1'118)成員，該病毒是2011年于云南朱頂 紅上發(fā)現(xiàn)的一種Tospovirus新病毒。HCRV在朱頂紅上的癥狀主要表現(xiàn)為葉片壞死和褪綠環(huán) 斑，目前僅在朱頂紅和蜘蛛蘭2個石蒜科植物上發(fā)現(xiàn)該病毒侵染，其病害高發(fā)時期發(fā)病率可 達90%以上。近年來，朱頂紅和蜘蛛蘭鮮切花的產量和銷量呈逐年上升的趨勢，由于其具有 較高的觀賞價值和較好的市場前景，因此研究并獲得一種能快速鑒定該病害的檢測方法對 于該病害的防控技術具有重要的意義。

【發(fā)明內容】

[0003] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒;第二目的在于 提供所述的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒的檢測方法;第三目的在于提供所述的朱頂紅 褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒的應用。
[0004] 本發(fā)明的第一目的是這樣實現(xiàn)的，包括盒體、硝酸纖維素膜、顯色液試劑瓶、抗體 試劑瓶、對照試劑瓶； 所述的顯色液試劑瓶包括顯色試劑瓶A和顯色液試劑瓶B; 所述的抗體試劑瓶包括一抗試劑瓶和二抗試劑瓶； 所述的對照試劑瓶包括HCRV標準陽性對照試劑瓶和HCRV標準陰性對照試劑瓶。
[0005] 本發(fā)明的第二目的是這樣實現(xiàn)的，包括以下步驟： 1)根據(jù)檢測樣品數(shù)量剪下硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜的一角剪去，用以指示膜方 向。
[0006] 2)檢測樣品加入洗滌緩沖液研磨，移液器取2.5 μL研磨液點至硝酸纖維膜方框 中，同時點上標準陽性對照和標準陰性對照，室溫放置或37°C放置至膜徹底干燥； 3) 將膜移至容器，加入封閉緩沖液，室溫或37 °C封閉1 h; 4) 在封閉緩沖液中加入一抗，室溫搖床搖勻，37°C培育1 h或4°C培育過夜； 5) 棄去一抗培育液，洗滌緩沖液洗膜3次，每次5 min; 6) 棄去洗滌緩沖液，加入封閉緩沖液，再在封閉緩沖液中加入二抗，室溫搖床搖勻，37 °C培育1 h或4 °C培育過夜； 7) 棄去二抗培育液，洗滌緩沖液洗膜3次，每次5 min; 8) 棄去洗滌緩沖液，顯色緩沖液洗膜1次，每次5 min; 9) 棄去顯色緩沖液，加入顯色液黑暗處顯色，充分顯色后將膜移至清水中終止顯色，分 析并記錄檢測結果。
[0007] 本發(fā)明的第三目的是這樣實現(xiàn)的，所述的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒在檢測 朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒中的應用。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點： 通過原核表達的方法制備了一種Tospovirus新種朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒外殼蛋白，免疫 家兔獲得該新病毒兔抗血清，優(yōu)化并組裝了朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒dot-ELISA檢測試劑盒并 應用于疑似樣品的快速檢測，該方法可大量、快速、準確地檢測朱頂紅等植株中該類新 Tospoviruses，為病害防控提供技術保障。
【附圖說明】
[0009] 圖1為朱頂紅植株上HCRV的檢測點樣圖； 圖2為朱頂紅植株上HCRV的檢測檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0010]下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0011] 本發(fā)明所述的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒(Hippeastrum chlorotic ringspot virus， HCRV)檢測試劑盒，包括盒體、硝酸纖維素膜、顯色液試劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑瓶； 所述的顯色液試劑瓶包括顯色試劑瓶A和顯色液試劑瓶B; 所述的抗體試劑瓶包括一抗試劑瓶和二抗試劑瓶； 所述的對照試劑瓶包括HCRV標準陽性對照試劑瓶和HCRV標準陰性對照試劑瓶。
[0012] 所述的硝酸纖維素膜設有方格，方格中空白處用以點樣。
[0013] 所述的顯色液試劑瓶A含有NBT顯色液;顯色液試劑瓶B含有BCIP顯色液。
[0014] 所述的NBT顯色液是將0.5g NBT溶于10ml 70%的二甲基甲酰胺;BCIP顯色液是將 0.5g BCIP溶于10ml 100%的二甲基酰胺。
[0015] 所述的一抗試劑瓶含有朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒特異性多克隆抗體;二抗試劑瓶含有 特異性羊抗兔。
[0016] 所述的含有朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒特異性克隆抗體的制備是采用其N基因原核表達 的方法得到免疫源，免疫家兔獲得，使用效價為1:500~20000;朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒N基因 PCR擴增引物根據(jù)尹躍艷(Yin. Y. Y.)注冊報道的HCRV蜘蛛蘭分離物N基因全序列設計(注冊 號為:KU356853)，引物序列及其退火溫度具體見下表：
所述的HCRV標準陽性對照試劑瓶含有感染HCRV的本氏煙植物干粉;HCRV標準陰性對照 試劑瓶含有健康本氏煙植物干粉。
[0017] 本發(fā)明所述的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟： 1)根據(jù)檢測樣品數(shù)量剪下硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜的一角剪去，用以指示膜方 向。
[0018] 2)檢測樣品加入洗滌緩沖液研磨，移液器取2.5 μL研磨液點至硝酸纖維膜方框 中，同時點上標準陽性對照和標準陰性對照，室溫放置或37°C放置至膜徹底干燥； 3) 將膜移至容器，加入封閉緩沖液，室溫或37 °C封閉1 h; 4) 在封閉緩沖液中加入一抗，室溫搖床搖勻，37°C培育1 h或4°C培育過夜； 5) 棄去一抗培育液，洗滌緩沖液洗膜3次，每次5 min; 6) 棄去洗滌緩沖液，加入封閉緩沖液，再在封閉緩沖液中加入二抗，室溫搖床搖勻，37 °C培育1 h或4 °C培育過夜； 7) 棄去二抗培育液，洗滌緩沖液洗膜3次，每次5 min; 8) 棄去洗滌緩沖液，顯色緩沖液洗膜1次，每次5 min; 9) 棄去顯色緩沖液，加入顯色液黑暗處顯色，充分顯色后將膜移至清水中終止顯色，分 析并記錄檢測結果。
[0019] 本發(fā)明所述的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒的應用為所述的朱頂紅褪綠環(huán)斑 病毒檢測試劑盒在檢測朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒中的應用。
[0020] 結果分析方法： 標準陽性對照斑點變?yōu)榧t色、紫紅色或黑色，標準陰性對照斑點不變色，表明實驗過程 正確無誤。檢測樣品斑點變?yōu)榧t色、紫紅色或黑色表明該樣品帶有HCRV，計作陽性樣品；檢 測樣品斑點不變色表明該樣品不帶有HCRV，計作陰性樣品。
[0021 ]洗滌緩沖液配方（1 L):
封閉緩沖液配方： 洗滌緩沖液按質量體積比(W/V)加入5%脫脂奶粉混勻。
[0022] 顯色緩沖液配方（100 ml):
顯色液配制方法： 每10 ml顯色緩沖液中加入66 μL顯色液A和33 μL顯色液B混勻。
[0023] 顯色液A配方:0.5 g NBT溶于10 ml 70%的二甲基甲酰胺。
[0024] 顯色液B配方:0.5 g BCIP溶于10 ml 100%的二甲基甲酰胺。
[0025] -抗試劑瓶使用說明：一抗試劑瓶保存在4°C，使用效價為1:3000。
[0026] 二抗試劑瓶使用說明：二抗試劑瓶保存在4°C，使用效價為1:8000。
[0027] 對照試劑瓶使用說明：使用前加入2 ml洗滌緩沖液。
[0028] 本發(fā)明所述的朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒設有盒體、硝酸纖維素膜、顯色液 試劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑瓶和檢測試劑盒說明書，所述硝酸纖維素膜、顯色液試劑瓶、 抗體試劑瓶、對照試劑瓶和檢測試劑盒說明書設在盒體內。制備方法：1)制備硝酸纖維素 膜，所述硝酸纖維素膜上劃有方格，方格中空白處用以點樣;2)制備顯色液試劑瓶，所述顯 色液試劑瓶包括顯色液試劑瓶A和顯色液試劑瓶B;3)制備抗體試劑瓶，所述抗體試劑瓶包 括一抗試劑瓶和二抗試劑瓶，所述一抗為朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒特異性多克隆抗體，采用朱 頂紅褪綠環(huán)斑病毒N基因原核表達的方法得到免疫源，免疫家兔獲得，使用效價為1:500~ 20000;所述二抗為特異性羊抗兔;4)制備對照試劑瓶，所述對照試劑瓶包括HCRV標準陽性 對照試劑瓶和HCRV標準陰性對照試劑瓶;5)制備檢測試劑盒說明書，所述檢測試劑盒說明 書包括檢測方法，洗滌緩沖液配方、封閉緩沖液配方、顯色緩沖液配方、顯色液配制方法、一 抗試劑瓶使用說明、二抗試劑瓶使用說明和對照試劑瓶使用說明。所述朱頂紅褪綠環(huán)斑病 毒檢測試劑盒可在檢測朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒中應用。具體包括： A、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒:朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒設有盒體、硝酸 纖維素膜、顯色液試劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑瓶和檢測試劑盒說明書，所述硝酸纖維素 膜、顯色液試劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑瓶和檢測試劑盒說明書設在盒體內。
[0029] B、朱頂紅褪綠環(huán)斑病毒檢測試劑盒制備方法： 1) 制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖維素膜上劃有方格，方格中空白處用以點樣； 2) 制備顯色液試劑瓶，所述顯色液試劑瓶包括顯色液試劑瓶A和顯色液試劑瓶B; 3) 制備抗體試劑瓶，所述抗體試劑