吸收光譜掃描流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年05月31日、申請(qǐng)?zhí)枮?01280031089.7,發(fā)明名稱為"吸收 光譜掃描流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)"發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及流體流中的熒光粒子的光學(xué)分析的領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0003] 流動(dòng)式粒子分析儀(諸如流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器)是公知的分析工具，其能夠基于諸如 光散射和熒光的光學(xué)參數(shù)來表征粒子。在流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中，例如，流體懸浮液中的粒子 (諸如分子(molecule)、與分析物結(jié)合的珠子或個(gè)體細(xì)胞)通過探測(cè)區(qū)域，在該探測(cè)區(qū)域中， 粒子暴露到通常來自于一個(gè)或多個(gè)激光器的激發(fā)光，并且粒子的光散射和熒光特性被測(cè) 量。其粒子或成分通常由熒光染料標(biāo)記，以有助于探測(cè)，并且可以通過使用光譜有區(qū)別的熒 光染料來標(biāo)記不同粒子或成分，以同時(shí)探測(cè)多種不同粒子或成分。通常，有多種光電探測(cè) 器，每一個(gè)光電探測(cè)器用于被測(cè)量的每個(gè)散射參數(shù)，并且每一個(gè)光電探測(cè)器用于被探測(cè)的 每個(gè)有區(qū)別的染料。所獲得的數(shù)據(jù)包括對(duì)于光散射參數(shù)和熒光發(fā)射中每一個(gè)測(cè)量的信號(hào)。
[0004] 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器還包括用于記錄所測(cè)量的數(shù)據(jù)和分析數(shù)據(jù)的裝置。例如，通常，數(shù)據(jù) 存儲(chǔ)和分析是使用連接到探測(cè)電子裝置的計(jì)算機(jī)來進(jìn)行的。數(shù)據(jù)通常被以表格形式存儲(chǔ)， 其中每一行對(duì)應(yīng)于每個(gè)粒子的數(shù)據(jù)，并且列對(duì)應(yīng)于每個(gè)所測(cè)量的參數(shù)。用來存儲(chǔ)來自于流 動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)文件格式(例如"FCS"文件格式)的使用有助于使用獨(dú)立的程 序和機(jī)器來分析數(shù)據(jù)。使用當(dāng)前的分析方法，為了易于可視化，數(shù)據(jù)通常被顯示為2維(2D) 圖表，但是其他方法可以被用來將多維數(shù)據(jù)可視化。
[0005] 使用流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)量的參數(shù)通常包括由粒子沿著幾乎向前的方向散射的 激發(fā)光(被稱作為前向散射(FSC))，由粒子沿著幾乎側(cè)向散射的激發(fā)光(被稱作為側(cè)向散射 (SSC))以及從熒光粒子以光譜的一個(gè)或多個(gè)通道(頻率范圍）發(fā)射的光(被稱作為FL1、FL2 等)或者由主要在該通道探測(cè)的熒光染料發(fā)射的光。不同的細(xì)胞類型可以由由于利用染料 標(biāo)記的抗體對(duì)各種細(xì)胞蛋白質(zhì)標(biāo)記而產(chǎn)生的散射參數(shù)以及熒光發(fā)射來識(shí)別。
[0006] 流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器可以從例如BD Biosciences(San Jose，CA)買到。流動(dòng)血細(xì)胞 計(jì)數(shù)器在本領(lǐng)域中在各種文獻(xiàn)中充分描述，例如包括：Landy等人合編，Clinical Flow Cytometry,AnnaIs of the New York Academy of Sciences Volume 677(1993);Bauer等 人合編，Clinical Flow Cytometry:Principles and Applications,ffi 11 iams&ffilkins (1993) ;0rmerod編寫，F(xiàn)low Cytometry : A Practical Approach, Oxford Univ. Press (1997) ;Jaroszeski等人合編，F(xiàn)low Cytometry Protocols，Methods in Molecular Biology No .91，Humana Press( 1997);以及Shapiro，Practical Flow Cytometry第四版， Wi 1 ey-Liss(2003);通過引用將它們?nèi)拷Y(jié)合在這里。通過由多顏色流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn) 行的細(xì)胞(或其他粒子)的分析獲得的數(shù)據(jù)是多維度的，其中每個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)于由所測(cè)量的參 數(shù)限定的多維空間中的點(diǎn)。細(xì)胞或粒子的布居(population)被識(shí)別為數(shù)據(jù)空間中的點(diǎn)的 簇。因此，布居和簇的識(shí)別可以通過繞顯示在數(shù)據(jù)的一個(gè)或多個(gè)2維圖（被稱作為"散射圖" 或"點(diǎn)圖"）繪出門限（gate)來手動(dòng)地進(jìn)行。可選擇地，簇可以被識(shí)別，并且限定布局的限制 的門限可以被自動(dòng)地確定。用于自動(dòng)化門限的大量方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述了。例如參見美 國(guó)專利號(hào) 4,845,653、5,627,040、5,739,000、5,795,727、5,962,238、6,014,904、6,944， 338，通過引用將他們?nèi)拷Y(jié)合在這里。
[0007] 在典型的基于激光器的流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中，可用的激發(fā)波長(zhǎng)受到合適的激光器 的可用性的限制。波長(zhǎng)可選擇的單波長(zhǎng)激發(fā)源已經(jīng)被描述為用于流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器。例如， 美國(guó)專利No.4,609,286(Sage)描述了流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器，其使用色散棱鏡來從用作激發(fā)源 的光譜豐富光源選擇波長(zhǎng)。光源由棱鏡色散，使得波長(zhǎng)可以使用狹縫來選擇，以允許基本單 波長(zhǎng)的光通過，并阻擋全部其他波長(zhǎng)。期望的波長(zhǎng)可以通過將狹縫物理地移動(dòng)到光譜中的 期望波長(zhǎng)來選擇。
[0008] Telford等人在2009年于Cytometry A 75(5) :450-459描述了使用超連續(xù)譜白色 激光作為流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的激發(fā)源。超連續(xù)譜白色激光器在從近紫外到紅外的寬波段范 圍內(nèi)連續(xù)地發(fā)射，由此對(duì)于人眼看起來是白色的。Telford等人描述了將聲光濾波器或有涂 層的帶通濾波器插入到光束的前方，以隔離具體波長(zhǎng)范圍，從而允許用戶從超連續(xù)譜選擇 感興趣的帶寬。所得到的激發(fā)源可以被用來通過使用具有期望顏色透射要求的濾波器選擇 任何單激發(fā)波長(zhǎng)和帶寬。
[0009] 在典型流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中，熒光發(fā)射被在多個(gè)探測(cè)通道(每個(gè)探測(cè)通道被限定 為光譜內(nèi)的頻率范圍）中測(cè)量，其中，每個(gè)通道中的發(fā)射被使用單個(gè)光電探測(cè)器測(cè)量。因此， 每個(gè)探測(cè)器提供頻率的范圍的單個(gè)測(cè)量結(jié)果。典型地，探測(cè)器通道被選擇為使得每個(gè)通道 被優(yōu)化，以從不同染料之一探測(cè)發(fā)射。可選地，發(fā)射光可以使用探測(cè)通道的陣列來測(cè)量，使 得每個(gè)染料發(fā)射被在一個(gè)以上通道中測(cè)量。
[0010] Robinson等人在由Tuan Vo-Dinh等人編輯的Advanced Biomedical and Clinical Diagnostic Systems III,Proc.of SPIE Vol.5692(SPIE,Bellingham,WA, 2005) :3579-365中描述了一種流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器探測(cè)系統(tǒng)，其中發(fā)射的光由衍射光柵色散 到32通道PMT探測(cè)器上。因此，焚光發(fā)射可以在32個(gè)窄的、相鄰的探測(cè)通道中測(cè)量，這些探測(cè) 通道一同跨越光譜區(qū)域。代替對(duì)于每個(gè)染料的單個(gè)熒光強(qiáng)度值，使用該系統(tǒng)獲得的數(shù)據(jù)對(duì) 于每個(gè)染料包括對(duì)于多個(gè)相鄰探測(cè)通道的強(qiáng)度值。從多個(gè)光譜相鄰的探測(cè)通道獲得的測(cè)量 結(jié)果的集合取決于染料的發(fā)射光譜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供了用于分析流動(dòng)流中的熒光粒子的激發(fā)光譜的系統(tǒng)和方法。
[0012] 本發(fā)明的系統(tǒng)使用白光激光器和顏色分離光學(xué)器件來提供空間分布的、連續(xù)的顏 色光譜激發(fā)系統(tǒng)，其被用于照明流動(dòng)流的區(qū)域。激發(fā)光的光譜沿著流動(dòng)流的長(zhǎng)度展開，使得 光譜展開到比待檢測(cè)的粒子的直徑大得多的區(qū)域。流動(dòng)通過探測(cè)區(qū)域的粒子將會(huì)在任何一 點(diǎn)僅由小的波長(zhǎng)范圍激發(fā)，但是在其橫穿整個(gè)探測(cè)區(qū)域時(shí)將會(huì)暴露到激發(fā)光的全部光譜。 隨著熒光粒子行進(jìn)通過激發(fā)束并且由此通過連續(xù)地改變激發(fā)光的波長(zhǎng)而受到激發(fā)，探測(cè)器 測(cè)量來自于粒子的熒光發(fā)射，該熒光發(fā)射按照在每個(gè)波長(zhǎng)的激發(fā)效率來改變強(qiáng)度。其結(jié)果 是掃描粒子的激發(fā)光譜。
[0013] 激發(fā)光譜的空間擴(kuò)展（展開)是通過使光穿過諸如棱鏡或衍射光柵的顏色分離光 學(xué)器件(例如色散元件)來實(shí)現(xiàn)的。顏色分離光學(xué)器件被確定方向，使得光譜沿著流動(dòng)路徑 展開，從而覆蓋縱向探測(cè)區(qū)域。在流中流動(dòng)的粒子將會(huì)隨著其穿過探測(cè)區(qū)域而暴露到連續(xù) 地改變波長(zhǎng)的光。
[0014] -般來說，光譜可以沿著流動(dòng)路徑展開，使得移動(dòng)粒子將會(huì)從短波長(zhǎng)到長(zhǎng)波長(zhǎng)或 者從長(zhǎng)波長(zhǎng)到短波長(zhǎng)掃描(sweep)激發(fā)光譜。優(yōu)選地，光譜沿著流動(dòng)路徑展開，使得移動(dòng)粒 子將會(huì)從短波長(zhǎng)到長(zhǎng)波長(zhǎng)掃描激發(fā)光譜。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施例中，單個(gè)寬波段探測(cè)器被用于測(cè)量來自于在粒子穿過探測(cè)區(qū)域時(shí)由 連續(xù)光譜激發(fā)束激發(fā)的粒子的發(fā)射。因此，粒子發(fā)射可以在粒子由激發(fā)光的全光譜順序地 激發(fā)時(shí)被連續(xù)地測(cè)量。由單探測(cè)器探測(cè)的波長(zhǎng)的范圍優(yōu)選地被選擇為在熒光粒子發(fā)射的范 圍內(nèi)，但是在激發(fā)光譜之外。優(yōu)選地，探測(cè)器被構(gòu)造為使用合適的長(zhǎng)通濾波器測(cè)量比最長(zhǎng)激 發(fā)波長(zhǎng)更長(zhǎng)的全部波長(zhǎng)。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施例中，激發(fā)光源引起連續(xù)可變的、波長(zhǎng)可選擇的帶通濾波器(可調(diào)諧 濾波器），其定位在白光激光器激發(fā)光源和顏色分離光學(xué)器件之間。濾光器允許從由白光激 光器提供的顏色的范圍選擇任何基本單顏色(波長(zhǎng)的窄波段)的激發(fā)束。該基本單顏色的激 發(fā)束將會(huì)照明探測(cè)區(qū)域內(nèi)的單個(gè)點(diǎn)。因?yàn)楣庾V由顏色分離光學(xué)器件展開到探測(cè)區(qū)域并且色 散的角度取決于光的顏色，所以由濾波器選擇的激發(fā)光的顏色的改變也導(dǎo)致探測(cè)區(qū)域內(nèi)的 照明點(diǎn)的位置的改變。
[0017] 連續(xù)可變的、可選擇波長(zhǎng)的帶通濾波器被構(gòu)造為將激發(fā)光的波長(zhǎng)從光譜的一端連 續(xù)地改變到另一端，這也導(dǎo)致照明點(diǎn)從探測(cè)區(qū)域的一端掃到另一端。濾波器的改變速率也 被計(jì)時(shí)，使得照明點(diǎn)以與粒子在流動(dòng)流中的速率相同的速率穿過探測(cè)區(qū)域。通過在粒子進(jìn) 入探測(cè)區(qū)域時(shí)開始光譜掃描，粒子將會(huì)在其穿過探測(cè)區(qū)域的同時(shí)保持被照射，然而是被以 激發(fā)光譜的連續(xù)改變的顏色照射。
[0018] 連續(xù)改變的光譜掃描被與粒子流動(dòng)對(duì)準(zhǔn)，并且使得能夠使用粒子運(yùn)動(dòng)掃描通過光 譜，但是將激發(fā)光限制到粒子，并且可能限制到受限的圍繞區(qū)域。這將可能導(dǎo)致探測(cè)通道中 的信號(hào)噪聲的雜散激發(fā)光的