一種基于Luminol/Aubranched PPy的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于Luminol/Au@branched PPy的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法及應用。具體涉及一種Luminol/Au@branched PPy作為基底材料，以Luminol作為發(fā)光信號源，構(gòu)建一種無標記型電致化學發(fā)光免疫傳感器，屬于電化學發(fā)光檢測技術領域。
【背景技術】
[0002]癌癥是威脅人類健康的最嚴重的疾病之一，雖然惡性腫瘤的治療技術在不斷進步，但是迄今為止，惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是最為有效的手段。從篩選的角度來說，早期診斷癌癥的最有效的方法是通過血液檢查，檢測腫瘤標志物的含量。隨著生物學技術的發(fā)展和研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)許多腫瘤早期標志物的一個最顯著的特點就是其在血清中濃度非常低，而傳統(tǒng)的檢測腫瘤標志物的方法，如酶聯(lián)免疫分析法、放射免疫分析法和熒光免疫分析法等，具有放射性污染，操作時間長且靈敏度低等缺點，限制了早期檢測腫瘤標志物的臨床檢測技術的發(fā)展。因此，發(fā)展高靈敏的免疫分析技術對于腫瘤標志物的早期檢測有著至關重要的意義。為了克服以上傳統(tǒng)分析方法的缺點，本發(fā)明設計了一種特異性強，無放射性污染，快速簡便且靈敏度高的電致化學發(fā)光免疫分析方法，實現(xiàn)了對腫瘤標志物的早期檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的之一是通過化學聚合法快速、簡便合成枝狀聚吡咯，其可與金溶膠通過靜電作用牢固結(jié)合。
[0004]本發(fā)明的目的之二是合成的枝狀聚吡咯導電性好，比表面積大，可以固載大量的金溶膠和魯米諾，提高了傳感器的檢測范圍和靈敏度。
[0005]本發(fā)明的目的之三是針對現(xiàn)有的腫瘤標志物檢測方法存在的問題，提供一種簡單快速可靠的基于Luminol/AuObranched PPy的電化學發(fā)光傳感器的制備方法和應用，實現(xiàn)對腫瘤標志物的快速、靈敏、特異、高效檢測。
[0006]本發(fā)明的技術方案如下:
1.一種基于Luminol/Au@branched PPy的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0、0.3、0.05μπι的氧化招粉末對直徑為4 mm的玻碳電極進行拋光，用超純水中清洗干凈，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6yL、濃度為I?3 mg/mL的抗體捕獲基底材料Luminol-AuObranched PPy-Ab溶液，4 C保存；
(3)用3yL、質(zhì)量分數(shù)為0.5?1.5%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4° C冰箱中孵化I?3 h，清洗干凈；
(4)將6yL、濃度為0.01 pg/mL?10 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原滴涂至電極表面，室溫下孵化I?3 h，清洗干凈，于4 °C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br>[0007]2.抗體捕獲基底材料Luminol_Au@branched PPy-Ab溶液的制備 (DAuibranched PPy的制備
將0.1?0.3 mol吡咯單體分散于40?60 mL、體積比為1:1的水和乙醇混合液中，加入0.05?0.15 mol/L的FeCl3溶液，攪拌24 h，過濾，用體積比為1:1的水和乙醇混合液洗滌3次，將其置于60 °C真空干燥箱中干燥48 h，制得黑色固體branched PPy；
將10?30 mg branched PPy分散到10 mL超純水中，加入5?15 mL金溶膠，將得到的混合溶液在室溫下振蕩24 h , 6000 r/min下離心10?15 min，洗滌3次，將產(chǎn)物AuObranched PPy重新分散到10 mL超純水中，制得AuObranched PPy溶液；
(2)Lumino1/Auibranched PPy的制備
將I mL、濃度為I?3 mg/mL的AuObranched PPy溶液與I 1111^、濃度為0.5?1.5mmol/L的Luminol溶液混合，將得到的混合溶液在室溫下振蕩24 h，6000 r/min下離心洗滌3次，將產(chǎn)物Luminol/Au@branched PPy重新分散于I mL超純水中，制得基底材料Luminol/Auibranched PPy溶液；
(3)抗體捕獲基底材料Lumino1-AuibranchedPPy-Ab溶液的制備
在I mL、濃度為I?3 mg/mL的基底材料Luminol-AuObranched PPy-Ab溶液中，加入200?400 yL、濃度為5?15 yg/mL的待測抗體Ab溶液，4 ° C下振蕩孵化48 h，6000 r/min下離心洗漆5?15 min，將產(chǎn)物Luminol-AuObranched PPy-Ab分散到I mL、濃度為40?60mg/mL的[BPy]BF4離子溶液中，制得抗體捕獲基底材料Luminol_Au@branched PPy-Ab溶液。
[0008]3.腫瘤標志物的檢測方法
(1)使用電化學工作站的三電極體系進行測試，Ag/AgCl電極作為參比電極，鉑絲電極為對電極，所制備的電化學發(fā)光傳感器為工作電極，將電化學工作站和化學發(fā)光檢測儀連接在一起將光電倍增管的高壓設置為700 V，循環(huán)伏安掃描電位范圍為-1.6 V?O V，掃描速率為0.1 ￥/8，起始電位為-0.3 V,脈沖電位為0.5 V，脈沖周期為12 S，脈沖時間為0.3s；
(2)在10mL、pH 9.8?10.8的含5?35 mmol/L過氧化氫的碳酸鹽緩沖溶液中，通過電化學發(fā)光系統(tǒng)，采用單階循環(huán)脈沖法檢測不同濃度的待測物抗原產(chǎn)生的電化學發(fā)光信號強度，繪制工作曲線；
(3)將待測實際樣品溶液代替腫瘤標志物抗原標準溶液進行檢測。
[0009]4.上述腫瘤標志物選自下列腫瘤標志物之一:胰癌胚抗原POA、微球蛋白擬-MG、游離前列腺特異性抗原free PSA、糖鏈抗原CA15-3、鱗狀細胞癌抗原SCCA。
[0010]本發(fā)明的有益成果
(1)本發(fā)明米用Luminol-AuObranchedPPy作為基底材料，利用AuObranched PPy生物兼容性好，比表面積大等優(yōu)點，有效地增加了抗體的固載量，以Luminol為發(fā)光材料，利用Luminol良好的光學性質(zhì)，增強了電致化學發(fā)光信號，使得構(gòu)建的傳感器具有較寬的檢測范圍和更高的靈敏度；
(2)采用單階循環(huán)脈沖施壓的方式，提高電致化學發(fā)光信號的穩(wěn)定性，增強對腫瘤標志物的可靠性；
(3)本發(fā)明制備的電化學發(fā)光傳感器用于腫瘤標志物的檢測，操作簡單，反應快速，靈敏度高，克服了傳統(tǒng)檢測方法，如酶聯(lián)免疫分析法、放射免疫分析法和熒光免疫分析法等，具有放射性污染，操作時間長且靈敏度低等的缺點，可以實現(xiàn)對腫瘤標志物的簡單、快速、靈敏、特異性檢測。
【具體實施方式】
[0011]實施例1 一種基于Luminol/AuObranched PPy的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0、0.3、0.05μπι的氧化招粉末對直徑為4 mm的玻碳電極進行拋光，用超純水中清洗干凈，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6yL、濃度為I mg/mL的抗體捕獲基底材料Luminol-Au@branchedPPy-Ab溶液，4 °C保存；
(3)用3此、質(zhì)量分數(shù)為0.5%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°C冰箱中孵化I h，清洗干凈；
(4)將6yL、濃度為0.01 pg/mL?10 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原滴涂至電極表面，室溫下孵化I h，清洗干凈，于4 °C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br>[0012]實施例2 —種基于Luminol/AuObranched PPy的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法，其特征在于，包括以下步驟:
(1)依次用1.0、0.3、0.05μπι的氧化招粉末對直徑為4 mm的玻碳電極進行拋光，用超純水中清洗干凈，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6yL、濃度為2 mg/mL的抗體捕獲基底材料Luminol-Au@branchedPPy-Ab溶液，4 °C保存；
(3)用3此、質(zhì)量分數(shù)為1.0%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°C冰箱中孵化2 h，清洗干凈；
(4)將6yL、濃度為0.01 pg/mL?10 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原滴涂至電極表面，室溫下孵化2 h，清洗干凈，于4 °C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br>[0013]實施例3 —種基于Luminol/AuObranched PPy的電致化學發(fā)光免疫傳感器的制備方法
(1)依次用1.0、0.3、0.05μπι的氧化招粉末對直徑為4 mm的玻碳電極進行拋光，用超純水中清洗干凈，氮氣吹干；
(2)在電極表面滴加6yL、濃度為3 mg/mL的抗體捕獲基底材料Luminol-Au@branchedPPy-Ab溶液，4 °C保存；
(3)用3此、質(zhì)量分數(shù)為1.5%的牛血清白蛋白溶液封閉非特異性活性位點，于4°(:冰箱中孵化3 h，清洗干凈；
(4)將6yL、濃度為0.01 pg/mL?10 ng/mL的一系列不同濃度的腫瘤標志物抗原滴涂至電極表面，室溫下孵化3 h，清洗干凈，于4 °C冰箱中儲存?zhèn)溆谩?br>[0014]實施例4抗體捕獲基底材料Luminol_Au@branched PPy-Ab溶液的制備 (DAuibranched PPy的制備
將0.I mol吡咯單體分散于40 mL、體積比為1:1的水和乙醇混合液中，加入0.05 mol/L的FeCl3溶液，攪拌24 h，過濾，用體積比為1:1的水和乙醇混合液洗滌3次，將其置于60 °(:真空干燥箱中干燥48 h，制得黑色固體branched PPy ；
將10 mg branched PPy分散到10 mL超純水中，加入5 mL金溶膠，將得到的混合溶液在室溫下振蕩24 h，6000 r/min下離心10 min，洗滌3次，將產(chǎn)物Au@branched PPy重新分散到10 mL超純水中，制得AuObranched PPy溶液；
(2)LuminoI/AuObranchedPPy的制備
將I mL、濃度為I mg/mL 的AuObranched PPy溶液與I mL、濃度為0.5 mmol/L的Luminol溶液混合，將得到的混合溶液在室溫下振蕩24 h，6000 r/min下離心洗滌3次，將產(chǎn)物Lumino I/AuObranched PPy重新分散于I mL超純水中，制得基底材料Lumino I/Au?branched PPy溶液；
(3)抗體捕獲基底材料1^1111；!_1101-八11@1^311(3110(1PPy-Ab溶液的制備
在I mL、濃度為I mg/mL的基底材料Luminol-AuObranched PPy-Ab溶液中，加入200 μL、濃度為5 Ug/mL的待測抗體Ab溶液，4 C下振蕩孵化48 h，6000 r/min下離心洗滌5 min，將產(chǎn)物Luminol_Au@branched PPy-Ab分散到I mL、濃度為40 mg/mL 的[BPy]BF4離子溶液中，制得抗體捕獲基底材料Luminol_Au@branched PPy-Ab溶液。
[0015]實施例5抗體捕獲基底材料Luminol-AuQbranched PPy-Ab溶液的制備
(1)AuObranchedPPy的制備
將0.2 mol吡咯單體分散于50 mL、體積