一種藍(lán)舌病抗體競爭液及其對應(yīng)的快速elisa檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藍(lán)舌病抗體競爭液及其對應(yīng)的快速ELISA檢測方法，其中本發(fā)明中的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速ELISA檢測方法，包括以下步驟：基于BTV抗原固化板通過待檢抗體和抗體競爭液競爭得到抗原位點(diǎn)；基于抗原位點(diǎn)進(jìn)行底物顯色，本發(fā)明在保持原來BTV C?ELISA的敏感性和重復(fù)性的前提下，簡化實(shí)驗(yàn)步驟至2步，縮短診斷時(shí)間至1小時(shí)內(nèi)，使得藍(lán)舌病血清抗體的檢測更加方便和快速。
【專利說明】
-種藍(lán)舌病抗體競爭液及其對應(yīng)的快速EL ISA檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及藍(lán)舌病病毒領(lǐng)域，尤其設(shè)及一種藍(lán)舌病抗體競爭液及其對應(yīng)的快速 ELISA檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 藍(lán)舌病(Blue Tongue, BT)是由藍(lán)舌病病毒(Blue Tongue Virus, TV)引起的、由 庫朦傳播的反當(dāng)動(dòng)物病毒性傳染病，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(ΟΙΕ)將其列為A類動(dòng)物疫病。藍(lán)舌 病血清學(xué)檢測是動(dòng)物進(jìn)出口檢驗(yàn)的重要項(xiàng)目，血清學(xué)檢測是指通過檢測藍(lán)舌病感染動(dòng)物后 產(chǎn)生的抗體來區(qū)別健康動(dòng)物和感染動(dòng)物的方法，目前，國際上使用的藍(lán)舌病血清學(xué)檢測方 法有間接藍(lán)舌病酶連免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和藍(lán)舌病瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)方法(AGID)，其中AGID 方法由于敏感性不夠，已經(jīng)逐步被化ISA方法代替。ELISA基本原理是:把受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗 原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗涂的方法使固相載體上 形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn) 物，根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺刊物定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地地放大 反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。
[0003] 常用的BTV間接化ISA方法主要有競爭化ISA(C-化ISA)阻斷化ISA(B-化ISA)兩 種，運(yùn)些化ISA方法基本上包括抗體包被、抗原吸附、待檢血清BTV抗體阻斷或者競爭檢測 抗體、二抗反應(yīng)、底物顯色5個(gè)步驟。兩種化ISA方法的敏感性和重復(fù)性都能夠達(dá)到檢測要 求，但是檢測時(shí)間較長，其中B-ELISA要4個(gè)小時(shí)，C-ELISA要3個(gè)小時(shí)的時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于目前技術(shù)存在的上述不足，本發(fā)明提供一種藍(lán)舌病抗體競爭液及其對應(yīng)的快 速化ISA檢測方法，本發(fā)明把藍(lán)舌病病毒抗體的化ISA的檢測步驟減少到只包括反應(yīng)和顯色 2步，45分鐘完成實(shí)驗(yàn)，而實(shí)驗(yàn)的敏感性和重復(fù)性和常規(guī)的BTV C-ELISA、B-ELISA相同，該方 法能夠極大的提高藍(lán)舌病抗體檢測水平，降低BTV抗體檢測的難度，提升BTV抗體檢測工作 效率。
[0005] 本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種藍(lán)舌病抗體競爭液，包括W下原料組成:BTV單抗，抗鼠冊R酶標(biāo)二抗，陰性牛血清， 硫柳隸，蛋白保護(hù)劑。
[0006] 本發(fā)明的另一面，一種藍(lán)舌病抗體競爭液的配制方法，包括W下步驟： 在C-ELISA的基礎(chǔ)上使用抗原固化板，將BTV單抗直接包被在抗原固化板上提供檢測使 用，通過真空干燥包裝使抗原固定板能夠在4° C保存1年W上； 將C-ELISA中的BTV單抗和抗鼠冊R酶標(biāo)二抗整合成抗體競爭液。
[0007] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，其中抗原固化板的制備包括W下步驟： 通過薦糖梯度離屯、獲得純化藍(lán)舌病病毒； 用0.05M PH9.6碳酸緩沖液稀釋病毒，包被板過夜； 將包被板進(jìn)行真空干燥包裝，放入4° C備用。
[0008] 本發(fā)明的再一面，一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速化ISA檢測方法，包括W下步驟： 基于BTV抗原固化板通過待檢抗體和抗體競爭液競爭得到抗原位點(diǎn)； 基于抗原位點(diǎn)進(jìn)行底物顯色。
[0009] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述基于BTV抗原固化板通過待檢抗體和抗體競爭 液競爭得到抗原位點(diǎn)的步驟還包括： 取出4°C保存的真空包裝BTV抗原固化ELISA板，撕開封口，按樣品數(shù)量取出ELISA板并 進(jìn)行編號，每個(gè)樣品測量巧L，陽性對照2-4孔，陰性對照4孔； 按每孔20ul把樣品、對照樣加到相應(yīng)孔中； 配制檢測競爭液； 將上述檢測競爭液按50ul每孔加到化ISA板中并在37 °C溫箱里溫育40-60分鐘； 將溫育結(jié)束的化ISA板取出，甩掉里面的液體，洗板至少5次，甩干準(zhǔn)備顯色。
[0010] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述配制檢測競爭液的步驟中，用競爭混合劑按1/ 100用稀釋液配制檢測競爭液。
[0011]作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述將上述檢測競爭液按50ul每孔加到化ISA板中 并在37°C溫箱里溫育40-60分鐘的步驟，還包括在溫育的過程中進(jìn)行震蕩。
[0012] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述基于抗原位點(diǎn)進(jìn)行底物顯色的步驟還包括： 在BTV抗原固化板中加 TMB單組份顯色液每孔50ul，室溫5-10分鐘，顯色充分后加50ul 終止液終止反應(yīng)； 在酶標(biāo)儀450nm處讀板，每孔計(jì)算抑制率。
[0013] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，所述在酶標(biāo)儀450nm處讀板，每孔計(jì)算抑制率的步驟 中，其中抑制率〉50%為陽性，抑制率介于40%和50%為可疑，低于40%為陰性。
[0014] 作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，其中強(qiáng)陽性對照大于80%，弱陽性對照60-80%，陰性 對照小于40%。
[0015] 本發(fā)明的一種藍(lán)舌病抗體競爭液及其對應(yīng)的快速化ISA檢測方法，其中本發(fā)明中 的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速化ISA檢測方法，包括W下步驟:基于BTV抗原固化板通過 待檢抗體和抗體競爭液競爭得到抗原位點(diǎn)；基于抗原位點(diǎn)進(jìn)行底物顯色，本發(fā)明在保持原 來BTV C-ELISA的敏感性和重復(fù)性的前提下，簡化實(shí)驗(yàn)步驟至2步，縮短診斷時(shí)間至1小時(shí) 內(nèi)，使得藍(lán)舌病血清抗體的檢測更加方便和快速。
【附圖說明】
[0016] 為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的 附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng) 域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可W根據(jù)運(yùn)些附圖獲得其他的附 圖。
[0017] 圖1為本發(fā)明的原理圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 對本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅 是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人 員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0019] 實(shí)施例1，本發(fā)明提供的一種藍(lán)舌病抗體競爭液，包括W下原料組成:BTV單抗，抗 鼠 HPR酶標(biāo)二抗，陰性牛血清，硫柳隸，蛋白保護(hù)劑，其中BTV單抗為BTV VP7單抗，作用和待 檢抗體競爭抗原位點(diǎn)，來自單抗雜交瘤細(xì)胞株編號HybasviglOl (武漢中國細(xì)胞庫）；抗鼠 冊R酶標(biāo)二抗，作用和單抗結(jié)合，提供冊R酶活性，由Invihogen公司提供；陰性牛血清防止 非特異性反應(yīng)，由Gibco公司提供;硫柳隸具有防腐保質(zhì);蛋白保護(hù)劑具有保護(hù)蛋白的作用， 來自Thermo公司產(chǎn)品 Conjagate s1:abilizer p;rod#37548。
[0020] 本發(fā)明的另一面，一種藍(lán)舌病抗體競爭液的配制方法，包括W下步驟： 步驟A:在C-ELISA的基礎(chǔ)上使用抗原固化板，將BTV單抗直接包被在抗原固化板上提供 檢測使用，通過真空干燥包裝使抗原固定板能夠在4°C保存1年W上，其中抗原固化板的制 備包括W下步驟:通過薦糖梯度離屯、獲得純化藍(lán)舌病病毒；用0.05M P朋.6碳酸緩沖液稀釋 病毒，包被板過夜;將包被板進(jìn)行真空干燥包裝，放入4° C備用。
[0021] 步驟B:將C-ELISA中的BTV單抗和抗鼠冊R酶標(biāo)二抗整合成抗體競爭液。
[0022] 本發(fā)明的再一面，如圖1所示，一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速化ISA檢測方法，包括 W下步驟： 步驟S1:基于BTV抗原固化板通過待檢抗體和抗體競爭液競爭得到抗原位點(diǎn)，具體包 括：步驟Sla:取出4Γ保存的真空包裝BTV抗原固化化ISA板，撕開封口，按樣品數(shù)量取出 ELISA板(條)并進(jìn)行編號，每個(gè)樣品測量巧L，陽性對照2-4孔，陰性對照4孔;步驟Sib:按每 孔20ul把樣品、對照樣加到相應(yīng)孔中；步驟Sic:配制檢測競爭液，具體用競爭混合劑按1/ 100用稀釋液配制檢測競爭液;步驟Sid:將上述檢測競爭液按50ul每孔加到化ISA板中并在 37°C溫箱里溫育40-60分鐘，具體為把檢測競爭液按50ul每孔加到化ISA板中，所有孔都要 加，運(yùn)時(shí)板中有孔中都有70ul液體(20ul血清加50ul檢測競爭液），W及溫育過程中有條 件可進(jìn)行震蕩；步驟Sle:將溫育結(jié)束的化ISA板取出，甩掉里面的液體，洗板至少5次，甩干 準(zhǔn)備顯色。
[0023] 步驟S2:基于抗原位點(diǎn)進(jìn)行底物顯色，具體包括步驟S2a:在BTV抗原固化板中加 TMB單組份顯色液每孔50ul，室溫5-10分鐘，顯色充分后加50ul終止液終止反應(yīng)； 步驟S2b:在酶標(biāo)儀450nm處讀板，每孔計(jì)算抑制率，具體為抑制率(PI )=(陰性對照平均 0D-樣品0D)/陰性對照平均0D，其中抑制率巧0%為陽性，抑制率介于40%和50%為可疑，低于 40%為陰性，W及強(qiáng)陽性對照應(yīng)該大于80%，弱陽性對照60-80%，陰性對照應(yīng)該小于40%。
[0024] 本發(fā)明減少原來藍(lán)舌病抗體檢測C-化ISA的操作步驟，從4步減少到2步，檢測一份 樣品的時(shí)間從原來4-5小時(shí)縮短到45分鐘；在縮短檢測時(shí)間和步驟的同時(shí)，保持了BTV C- ELISA的特異性和敏感性，能夠用于國際貿(mào)易中。下面用表一和表二說明快速化ISA和常規(guī) C-ELISA對比的結(jié)果。
[0025] 在本發(fā)明中，快速競爭化ISA和常規(guī)C-化ISA的特異性相同，表一為快速化ISA和常 規(guī)C-ELISA的特異性對比實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)檢測BTV陽性、弱陽性、陰性血清的抑制率，其中BTV陰性 血清中還包括藍(lán)舌病類似病毒馬鹿出血熱病毒陽性、口蹄疫陽性、阿卡邦病毒陽性血清?？?W看出，快速競爭ELISA在檢測陽性血清和弱陽性血清時(shí)和常規(guī)C-ELISA結(jié)果相同，在檢測 陰性血清時(shí)所有血清抑制率低于10%，而常規(guī)C-ELISA檢測陰性血清時(shí)有二個(gè)樣品的抑制率 超過20%，用快速競爭化ISA檢測的陰性血清標(biāo)準(zhǔn)差為ο. 033，而常規(guī)C-化ISA陰性血清標(biāo)準(zhǔn) 差為0.102,說明快速競爭化ISA穩(wěn)定性要高于常規(guī)C-ELISA。從強(qiáng)陽性血清、弱陽性血清、陰 性血清綜合檢測效果來看，快速競爭化ISA和常規(guī)C-ELISA的特異性相同。
[0026] 表一
在表一中，*結(jié)果表示為抑制率，其中強(qiáng)陽性對照應(yīng)該大于80%，弱陽性對照60-80%，陰 性對照應(yīng)該小于40%。
[0027] 快速競爭化ISA和常規(guī)C-化ISA的敏感性相同表二為7頭綿羊人工感染藍(lán)舌病 (BTV-16)后的每二天采血一次的檢測結(jié)果，結(jié)果表明快速競爭化ISA和常規(guī)C-ELISA都在第 8天檢測出抗體陽性，陽性率分別為3/7和2/7,第12天都檢測出6/7的陽性，說明兩只方法的 敏感性相同。
[002引 表二
W上所述，僅為本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉 本領(lǐng)域技術(shù)的技術(shù)人員在本發(fā)明公開的技術(shù)范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換，都應(yīng)涵蓋 在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)W所述權(quán)利要求的保護(hù)范圍為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種藍(lán)舌病抗體競爭液，其特征在于，包括以下原料組成:BTV單抗，抗鼠 HPR酶標(biāo)二 抗，陰性牛血清，硫柳汞，蛋白保護(hù)劑。2. -種藍(lán)舌病抗體競爭液的配制方法，其特征在于，包括以下步驟： 在C-ELISA的基礎(chǔ)上使用抗原固化板，將BTV單抗直接包被在抗原固化板上提供檢測使 用； 將BTV C-ELISA中的BTV單抗和抗鼠 HPR酶標(biāo)二抗整合成抗體競爭液。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的配制方法，其特征在于，其中抗原固 化板的制備包括以下步驟： 通過蔗糖梯度離心獲得純化藍(lán)舌病病毒； 用0.05M PH9.6碳酸緩沖液稀釋病毒，包被板過夜； 將包被板進(jìn)行真空干燥包裝，放入4° C備用。4. 一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速ELISA檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： 基于BTV抗原固化板通過待檢抗體和抗體競爭液競爭得到抗原位點(diǎn)； 基于抗原位點(diǎn)進(jìn)行底物顯色。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速ELISA檢測方法，其特征在于， 所述基于BTV抗原固化板通過待檢抗體和抗體競爭液競爭得到抗原位點(diǎn)的步驟還包括： 取出4°C保存的真空包裝BTV抗原固化ELISA板，撕開封口，按樣品數(shù)量取出ELISA板并 進(jìn)行編號，每個(gè)樣品測量2孔，陽性對照2-4孔，陰性對照4孔； 按每孔20ul把樣品、對照樣加到相應(yīng)孔中； 配制檢測競爭液； 將上述檢測競爭液按50ul每孔加到ELISA板中并在37°C溫箱里溫育40-60分鐘； 將溫育結(jié)束的ELISA板取出，甩掉里面的液體，洗板至少5次，甩干準(zhǔn)備顯色。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速ELISA檢測方法，其特征在于， 所述配制檢測競爭液的步驟中，用競爭混合劑按1/100用稀釋液配制檢測競爭液。7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速ELISA檢測方法，其特征在于， 所述將上述檢測競爭液按50ul每孔加到ELISA板中并在37°C溫箱里溫育40-60分鐘的步驟， 還包括在溫育的過程中進(jìn)行震蕩。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速ELISA檢測方法，其特征在于， 所述基于抗原位點(diǎn)進(jìn)行底物顯色的步驟還包括： 在BTV抗原固化板中加 TMB單組份顯色液每孔50ul，室溫5-10分鐘，顯色充分后加50ul 終止液終止反應(yīng)； 在酶標(biāo)儀450nm處讀板，每孔計(jì)算抑制率。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速ELISA檢測方法，其特征在于， 所述在酶標(biāo)儀450nm處讀板，每孔計(jì)算抑制率的步驟中，其中抑制率>50%為陽性，抑制率介 于40%和50%為可疑，低于40%為陰性。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的一種藍(lán)舌病抗體競爭液的快速ELISA檢測方法，其特征在于， 其中強(qiáng)陽性對照大于80%，弱陽性對照60-80%，陰性對照小于40%。
【文檔編號】G01N33/577GK105842450SQ201610314545
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年5月13日
【發(fā)明人】李樂, 李華春, 苗海生, 廖得芳, 寇美齡, 朱建波, 高林, 王金平
【申請人】云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院