基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)dnmt1的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMT1的方法，包括以Fe3O4納米顆粒為固相載體，制備出表面被DNMT1單克隆抗體共價(jià)修飾的免疫磁性顆粒，將DNMT1標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品采用所述免疫磁性顆粒捕獲并富集分離，然后向分離后所得的產(chǎn)物中加入被量子點(diǎn)標(biāo)記的DNMT1多克隆抗體，使抗體與待測(cè)抗原結(jié)合，采用多功能微孔板讀數(shù)儀以270 nm激發(fā)下進(jìn)行熒光檢測(cè)，根據(jù)熒光強(qiáng)度與DNMT1標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品濃度的關(guān)系建立回歸方程。該方法步驟簡(jiǎn)單且由該方法建立的回歸方程對(duì)DNMT1檢測(cè)的線性范圍寬、檢測(cè)限低、精密度、準(zhǔn)確度高且具有良好的特異性。
【專利說(shuō)明】
基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMT1的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及了一種基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMTl 的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在檢測(cè)領(lǐng)域中，常常需要對(duì)各類抗原或抗體進(jìn)行定性或定量檢測(cè)?，F(xiàn)有技術(shù)中，已 經(jīng)以"雙抗夾心"為基礎(chǔ)衍生出多種免疫反應(yīng)分析方法，如:放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué) 發(fā)光法、時(shí)間分辨熒光法和熒光免疫法等，可用于確定病原微生物，對(duì)人體的特異性蛋白定 量檢測(cè)從而對(duì)疾病進(jìn)行輔助診斷或監(jiān)測(cè)等等，用途非常廣泛。這類免疫反應(yīng)分析方法的通 常作法是:將捕獲抗體固定于固相載體，然后與抗原（目標(biāo)蛋白）反應(yīng)，洗滌后再與標(biāo)記抗體 反應(yīng)，洗滌，加入底物檢測(cè)光信號(hào)或直接檢測(cè)熒光信號(hào)。雖然上述方法的自動(dòng)化免去了人工 洗滌的煩瑣，但存在固相載體的分離效率較低、檢測(cè)精度不高等缺點(diǎn)。
[0003] 為了解決以上存在的問(wèn)題，人們一直在尋求一種理想的技術(shù)解決方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，從而提供一種以納米固相顆粒為載體，具 有分離效率高、檢測(cè)精度高且具有高度特異性的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMTl的方法。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè) DNMTl的方法，具體步驟包括： 提供一種表面被·MTl單克隆抗體共價(jià)修飾的Fe3O4納米免疫磁性顆粒懸浮液，記作為 Fe3〇4@McAb; 提供一種表面被量子點(diǎn)標(biāo)記的DNMT1多克隆抗體，記作為QD sOPcAb; 將經(jīng)CB緩沖液稀釋后的所述Fe3O4麵cAb與經(jīng)I3BS緩沖液稀釋后的DNMTl標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè) 目標(biāo)物進(jìn)行溫育反應(yīng)50 min~60 min，使得所述DNMTl標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物被Fe3〇4@McAb捕 獲、富集分離； 然后將經(jīng)PBST緩沖液稀釋后的所述QDsOPcAb與被Fe3O4OMcAb捕獲、富集分離的所述 MT1標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物進(jìn)行溫育反應(yīng)110 min~130 min，使得所述QDsOPcAb與所述 DNMTl標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物相結(jié)合;經(jīng)PBST緩沖液稀釋后，在多功能微孔板讀數(shù)儀上測(cè)定 270 nm激發(fā)下反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度； 根據(jù)檢測(cè)的熒光強(qiáng)度與所述DNMTl標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物濃度之間的關(guān)系，分段建立檢 測(cè)DNMTl的回歸方程。
[0006] 需要說(shuō)明的是，上述各步驟中，CB代表碳酸鹽緩沖液、PBS代表磷酸鹽緩沖溶液、 PBST代表添加 Tween-20非離子表面活性劑的磷酸鹽緩沖溶液。
[0007] 基于上述，所述基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法，還包括采用ELISA法檢測(cè) 提供的所述Fe3〇4麵cAb的生物活性的步驟。
[0008] 基于上述，提供一種所述Fe3〇4@McAb的步驟包括： (1) 清洗:將Fe3〇4納米顆粒懸浮液經(jīng)超聲、磁分離棄上清處理后采用濃度為O. Ol mol/ L~0.015 mol/L、pH為6.0的MES緩沖液對(duì)其平衡2 min~5 min，然后進(jìn)行磁分離棄上清得 到第一沉淀物。其中MES代表嗎啉乙磺酸緩沖液； (2) 活化：向所述第一沉淀物中依次加入濃度為8 mg/mL~10 mg/mL EDC溶液和濃度為 8 mg/mL~11 mg/mL NHS溶液進(jìn)行禍旋反應(yīng)10 min~15 min，磁分離、棄上清處理后采用 MES緩沖液對(duì)其洗滌3次，然后再進(jìn)行磁分離、棄上清處理得到第二沉淀物。其中，EDC代表 (1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液、NHS代表N-羥基琥珀酰亞胺溶液、MES 代表嗎啉乙磺酸緩沖液、mg/mL代表毫克每毫升； (3) 緩沖體系轉(zhuǎn)換:采用PBS緩沖液對(duì)所述第二沉淀物洗滌3~4次次，磁分離得到第三 沉淀物； (4) 偶聯(lián)：向所述第三沉淀物中加入D匪Tl單克隆抗體和I3BS緩沖液進(jìn)行渦旋反應(yīng)1.5h ~2h，經(jīng)磁分離、棄上清處理后采用PBS緩沖液對(duì)其清洗2次，磁分離、棄上清得到第四沉淀 物； (5) 封閉：向所述第四沉淀物中加入BSA封閉液，進(jìn)行渦旋反應(yīng)0.5h~Ih，磁分離、棄上 清處理后，采用PBST緩沖液清洗3~4次，磁分離、棄上清得到第四沉淀物即Fe 3O4麵cAb;其中 BSA封閉液代表牛血清白蛋白封閉液； (6) 保存:在偶聯(lián)產(chǎn)物?63〇4麵〇413中加入?83緩沖液，輕晃搖勻，4°(：保存?zhèn)溆谩?br>[0009] 基于上述，所述基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法中，采用ELISA法檢測(cè)提供 的所述Fe3〇4麵cAb的生物活性的步驟包括： (1) 將經(jīng)濃度為45 mmol/L~50 mmol/L、pH為9·0~9·6的CB緩沖液稀釋的Fe3O4OMcAb 加入到酶標(biāo)板中，磁分離，采用PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板;其中mmol/L代表毫摩爾每升； (2) 采用I3BS緩沖液配制濃度為300 ng/mL~400 ng/mL的·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)品，并將其加入上 述酶標(biāo)板中，恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理并采用PBST緩沖液清洗 所述酶標(biāo)板;其中ng/mL代表納克每毫升； (3) 采用封閉液將DNMTl多克隆抗體稀釋400~500倍，然后將其以每孔100微升加入到 所述酶標(biāo)板中，35°C~37°C恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理并采用 PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板； (4) 用封閉液將HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋4000~5000倍，以每孔100微升將其加入 到所述酶標(biāo)板中，35°C~37°C恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理并采用 PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板； (5 )將TMB顯色劑A液和B液等體積混合，將其加入到所述酶標(biāo)板中，35 °C~37 °C避光溫 育反應(yīng)15 min~20 min;顯色反應(yīng)后，向所述酶標(biāo)板中加入H2SO4終止液，并立即在酶標(biāo)儀上 檢測(cè)各孔的吸光度0D，其中，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。
[0010] 基于上述，所述基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMTl的方法，還包括采用夾心法檢測(cè)提 供的所述QDsOPcAb的熒光強(qiáng)度及抗體活性的步驟。
[0011] 基于上述，基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMTl的方法，其特征在于，提供一種所述 QDsOPcAb的步驟包括： 將pH為7.0~7.4的硼酸鹽緩沖液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入濃度為0.5 微摩爾每升~1微摩爾每升的QDs和濃度為0.5 mg/mL~I mg/mL的·MTl多克隆抗體，每次 加入上述物質(zhì)后均需振蕩混勻;其中、mg/mL代表毫克每毫升； 然后向所述PE管中加入濃度為8 mg/mL~10 mg/mL的EDC溶液，在18°C~25°C下渦旋反 應(yīng)1.5h~2h，反應(yīng)結(jié)束后向所述PE管中加入含0.5%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)BSA封閉液的PBS緩沖液，在 18°C~25°C下渦旋反應(yīng)20 min~30 min; 所得反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)離心、超濾除去EDC后溶于BS緩沖液中，4°C保存，從而制得所述QDsO PcAb0
[0012] 基于上述，所述基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMTl的方法中，采用夾心法檢測(cè)提供的 所述QDsOPcAb的熒光強(qiáng)度及抗體活性的步驟包括:將經(jīng)濃度為45 mmol/L~50 mmol/L、pH 為9.0~9.6的CB緩沖液稀釋的QDsOPcAb加入到黑色96孔酶標(biāo)板中，恒溫溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離并采用PBST緩沖液清洗所述黑色96孔酶標(biāo)板，然后加入PBST在多功微 孔板讀數(shù)儀上測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0013] 基于上述，所述的一種基于量子點(diǎn)焚光免疫檢測(cè)DNMTl的方法，還包括將上述各步 驟中各參數(shù)的優(yōu)化的步驟，然后根據(jù)優(yōu)化參數(shù)建立檢測(cè)DNMTl的回歸方程，其中，在DNMTl標(biāo) 準(zhǔn)品濃度為5 ·0 ng/mL~1500 ng/mL范圍內(nèi)，所建立的回歸方程為Y=O ·00775X+20 · 77161， 其中，Y代表熒光值RFU，X為DNMTl標(biāo)準(zhǔn)品濃度，相關(guān)系數(shù)r為0.9873;在·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 0 · I ng/mL~5 · 0 ng/mL范圍內(nèi)，本方法檢測(cè)DNMTl的回歸方程為Y=O · 02779X+1 · 29858，其中 Y代表1gRFU，X代表1gDNMTl，相關(guān)系數(shù)r為0.9877。
[0014]基于上述，所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法，對(duì)·ΜΤ1濃度的最低檢 測(cè)限為0.1 ng/mL。
[0015] 本發(fā)明相對(duì)現(xiàn)有技術(shù)具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，具體的說(shuō)，本發(fā)明將 Fe3O4納米顆粒的快速分離技術(shù)、免疫反應(yīng)的高度特異性和量子點(diǎn)的高熒光強(qiáng)度有機(jī)結(jié)合起 來(lái)，根據(jù)檢測(cè)的熒光強(qiáng)度與所述·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物濃度之間的關(guān)系，分段建立檢測(cè) D匪Tl的回歸方程，從而利用該方法計(jì)算樣品中DNMTl的含量，方法步驟簡(jiǎn)單且由該方法建 立的回歸方程對(duì)·ΜΤ1檢測(cè)的線性范圍寬、檢測(cè)限低、精密度、準(zhǔn)確度高且具有良好的特異 性。
【附圖說(shuō)明】
[0016] 圖1是本發(fā)明的Fe3〇4@McAb的生物活性檢測(cè)結(jié)果圖。
[0017] 圖2是本發(fā)明QDsOPcAb的熒光強(qiáng)度及抗體活性檢測(cè)結(jié)果圖。
[0018] 圖3是本發(fā)明不同稀釋倍數(shù)的Fe3〇4@McAb捕獲抗原時(shí)與反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。 [0019]圖4是本發(fā)明QDsOPcAb復(fù)合物濃度與反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。
[0020]圖5是本發(fā)明免疫緩沖液種類與反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。
[0021]圖6是本發(fā)明固相抗體捕獲抗原作用時(shí)間與反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。
[0022]圖7是本發(fā)明QDsOPcAb與抗原的作用時(shí)間對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度關(guān)系圖。
[0023]圖8是本發(fā)明建立的低濃度DNMTl檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
[0024]圖9是本發(fā)明建立的高濃度DNMTl檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面通過(guò)【具體實(shí)施方式】，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。
[0026] 本發(fā)明中所用的試劑種類如下：·ΜΤ1抗原(OriGene)，·ΜΤ1單克隆抗體(北京博 奧龍免疫技術(shù)有限公司），DNMT1多克隆抗體(ABclonal)，F(xiàn)e3〇4納米顆粒（自制），CdSe/ZnS量 子點(diǎn)（武漢珈源量子點(diǎn)公司），人DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3a ELISA試劑盒、人DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶3b ELISA試劑盒(上?？道噬锟萍加邢薰荆?，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG，牛血清白蛋白（BSA， 北京索萊寶科技有限公司），其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水Milli-Q超純水（電阻率大于 18.2 ΜΩ . cm)〇
[0027]本發(fā)明中所用的儀器如下：多功能微孔板讀數(shù)儀(SpectraMax M2e，美國(guó)），電熱恒 溫培養(yǎng)箱(DHG-9080型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），數(shù)控超聲波清洗儀(KQ-300DE型，昆 山市超聲儀器有限公司），可調(diào)微量加樣器(Eppendorf，德國(guó)），XH-C型渦旋混勻儀(金壇市 國(guó)旺實(shí)驗(yàn)儀器廠），低溫離心機(jī)(Centrifuge 5424 R，Eppendorf) 〇 [0028]本發(fā)明提供一種基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMTl的方法，具體步驟包括： 提供一種表面被·MTl單克隆抗體共價(jià)修飾的Fe3O4納米免疫磁性顆粒懸浮液，記作為 Fe3〇4iMcAb;并采用ELISA法檢測(cè)提供的所述Fe3〇4@McAb的生物活性； 提供一種的被量子點(diǎn)標(biāo)記的DNMTl多克隆抗體溶液，記作為QDsOPcAb;并采用夾心法檢 測(cè)提供的所述QDsOPcAb的熒光強(qiáng)度及抗體活性； 所述Fe3O4麵cAb經(jīng)CB緩沖液稀釋后加入到黑色96孔板中，并向其中加入經(jīng)I3BS緩沖液 稀釋的·ΜΤ1抗原進(jìn)行恒溫孕育50 min~60 min;然后向所述黑色96孔板中加入經(jīng)I3BST緩 沖液稀釋后的所述QDsOPcAb進(jìn)行溫育反應(yīng)110 min~130 min，最后向所述黑色96孔板中 加入PBST，在多功能微孔板讀數(shù)儀上測(cè)定熒光強(qiáng)度;然后根據(jù)優(yōu)化后的參數(shù)得到的熒光強(qiáng) 度與所述·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物濃度之間的關(guān)系，分段建立檢測(cè)·ΜΤ1的回歸方程。其 中，每次溫育反應(yīng)后均需對(duì)所述黑色96孔板進(jìn)行磁分離和PBST洗板處理。建立檢測(cè)DNMTl的 回歸方程，其中，在·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5.0 ng/mL~1500 ng/mL范圍內(nèi)，所建立的回歸方程 為Y=0.00 775X+20.77161，其中，Y代表熒光值RFU，X為DNMTl標(biāo)準(zhǔn)品濃度，相關(guān)系數(shù)r為 0.9873;在在·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.1 ng/mL~5.0 ng/mL范圍內(nèi)，本方法檢測(cè)DWTl的回歸 方程為Y=0.0 2779X+1.29858，其中Y代表1gRFU，X代表1gDNMTl，相關(guān)系數(shù)r為0.9877。
[0029] 其中，提供一種所述Fe3〇4@McAb的步驟包括： (1) 清洗:將Fe3〇4納米顆粒懸浮液經(jīng)超聲、磁分離棄上清處理后采用濃度為0.01 mol/ L~0.015 mol/L、pH為6.0的MES緩沖液對(duì)其平衡2 min~5 min，然后進(jìn)行磁分離棄上清得 到第一沉淀物，其中MES代表嗎啉乙磺酸緩沖液； (2) 活化：向所述第一沉淀物中依次加入濃度為8 mg/mL~10 mg/mL EDC溶液和濃度為 8 mg/mL~Ilmg/mL NHS溶液進(jìn)行禍旋反應(yīng)10 min~15 min，磁分離、棄上清處理后采用MES 緩沖液對(duì)其洗滌3次，然后再進(jìn)行磁分離、棄上清處理得到第二沉淀物，其中，EDC代表（ΙΟ-二甲氨基丙基 )-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽溶液、 NHS 代表 N-羥基琥珀酰亞胺溶液、 MES 代表 嗎啉乙磺酸緩沖液； (3) 緩沖體系轉(zhuǎn)換:采用PBS緩沖液對(duì)所述第二沉淀物洗滌3次，磁分離得到第三沉淀 物； (4) 偶聯(lián)：向所述第三沉淀物中加入D匪Tl單克隆抗體和I3BS緩沖液進(jìn)行渦旋反應(yīng)1.5h ~2h，經(jīng)磁分離、棄上清處理后采用PBS緩沖液對(duì)其清洗2次，磁分離、棄上清得到第四沉淀 物； (5) 封閉：向所述第四沉淀物中加入BSA封閉液，進(jìn)行渦旋反應(yīng)0.5h~Ih，磁分離、棄上 清后采用I3BST緩沖液清洗3次，磁分離、棄上清得到第四沉淀物即Fe 3O4麵cAb，其中BSA封閉 液代表牛血清白蛋白封閉液； (6) 保存:在偶聯(lián)產(chǎn)物?63〇4麵〇413中加入?83緩沖液，輕晃搖勻，4°(：保存?zhèn)溆谩?br>[0030] 采用ELISA法檢測(cè)提供的所述Fe3O4麵CAb的生物活性，檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，圖中顯 示DNMTl空白對(duì)照組具有較高的背景值，但低于實(shí)驗(yàn)組吸光度，同時(shí)可證明在Fe 3O4納米顆粒 表面成功修飾了 DNMTl單克隆抗體且不影響抗體活性。具體檢測(cè)步驟包括： (1) 將經(jīng)濃度為45 mmol/L~50 mmol/L、pH為9·0~9·6的CB緩沖液稀釋的Fe3O4OMcAb 加入到酶標(biāo)板中，每孔加入量為100微升，磁分離，采用PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板拍干備 用； (2) 采用I3BS緩沖液配制濃度為300 ng/mL~400 ng/mL的·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)品，并將其加入上 述酶標(biāo)板中，每孔加入量為100微升，恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理 并采用PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板； (3) 采用封閉液將DNMTl多克隆抗體稀釋400~500倍，然后將其以每孔100微升加入到 所述酶標(biāo)板中，35°C~37°C恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理并采用 PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板； (4) 用封閉液將HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋4000~5000倍，以每孔100微升將其加入 到所述酶標(biāo)板中，35°C~37°C恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理并采用 PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板； (5) 將TMB顯色劑A液和B液等體積混合，以每孔100微升將其加入到所述酶標(biāo)板中，35 °C~37°C避光溫育反應(yīng)15~20 min;顯色反應(yīng)后，向所述酶標(biāo)板中每孔加入50微升的濃度 為2 mol/L H2SO4終止液，并立即在酶標(biāo)儀上檢測(cè)各孔的吸光度0D，其中，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm〇
[0031] 其中，提供一種所述QDsOPcAb的步驟包括： 將pH為7.0~7.4的硼酸鹽緩沖液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入濃度為0.5 微摩爾每升~1微摩爾每升的QDs和濃度為0.5 mg/mL~I mg/mL的·MTl多克隆抗體，每次 加入上述物質(zhì)后均需振蕩混勻； 然后向所述PE管中加入濃度為8 mg/mL~10 mg/mL的EDC溶液，在18°C~25°C下渦旋反 應(yīng)1.5 h~2 h，反應(yīng)結(jié)束后向所述PE管中加入含0.5%質(zhì)量百分?jǐn)?shù)BSA封閉液的PBS緩沖液， 在18°C~25°C下渦旋反應(yīng)20 min~30 min; 所得反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)離心、超濾除去EDC后溶于BS緩沖液中，4°C保存，從而制得所述QDsO PcAb0
[0032]采用夾心法檢測(cè)提供的所述QDsOPcAb的熒光強(qiáng)度及抗體活性，結(jié)果如圖2所示，空 白對(duì)照為·ΜΤ1抗原空白，體系熒光強(qiáng)度隨QDsOPcAb稀釋比增大而降低，但均高于空白對(duì) 照，說(shuō)明QDsOPcAb偶聯(lián)產(chǎn)物制備成功，且標(biāo)記量子點(diǎn)后抗體的活性依然存在。具體檢測(cè)步驟 包括:將經(jīng)濃度為45臟〇1/1~50 111111〇1/14!1為9.0~9.6的08緩沖液稀釋的008即〇413加入 到黑色96孔酶標(biāo)板中，恒溫溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離并采用PBST緩沖液清洗 所述黑色96孔酶標(biāo)板，然后加入PBST在多功能微孔板讀數(shù)儀上測(cè)熒光強(qiáng)度。
[0033]由此可見(jiàn)，本發(fā)明提供的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法中對(duì)最終檢測(cè)精 度影響因素比較多，比如:Fe3〇4麵cAb稀釋比、QDsOPcAb稀釋比、免疫反應(yīng)緩沖液種類、固相 抗體捕獲抗原作用時(shí)間、QDsOPcAb作用時(shí)間等。
[0034] 下面就這些影響因素，對(duì)本發(fā)明提供的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)MMTl的方法作 進(jìn)一步的闡述。
[0035] 一、Fe3〇4@McAb 稀釋比優(yōu)化 為得到Fe3O4麵cAb的最優(yōu)用量，實(shí)驗(yàn)考察了不同稀釋倍數(shù)的Fe3O 4OMcAb捕獲抗原時(shí)對(duì) 反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖3所示，反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度隨稀釋倍數(shù)的增大先增加后 迅速降低，在Fe3O 4麵cAb稀釋比為1:50時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最大，其原因是Fe3O4納米顆粒對(duì)量 子點(diǎn)的熒光有淬滅作用，當(dāng)Fe 3O4OMcAb濃度過(guò)高時(shí)，F(xiàn)e3O4納米顆粒對(duì)量子點(diǎn)的熒光淬滅作 用增強(qiáng)，此外Fe 3O4納米顆粒自身的黑色對(duì)熒光也有掩蔽作用。因此選擇Fe3O4OMcAb的最優(yōu) 稀釋比為1:50。
[0036] 二、QDsOPcAb 稀釋比優(yōu)化 QDsOPcAb作為FLISA方法的熒光信號(hào)來(lái)源，其用量與方法靈敏度和線性范圍等密切相 關(guān)，因此實(shí)驗(yàn)考察了QDsOPcAb復(fù)合物濃度對(duì)反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度的影響，結(jié)果如圖4所示，隨 QDsOPcAb復(fù)合物濃度的增加，反應(yīng)體系熒光強(qiáng)度先增加后逐漸趨于穩(wěn)定，在QDsOPcAb復(fù)合 物稀釋比為1: :30時(shí)熒光強(qiáng)度較高，且當(dāng)繼續(xù)增加QDsOPcAb復(fù)合物濃度時(shí)，體系熒光強(qiáng)度增 加不明顯，因此選擇QDsOPcAb復(fù)合物的最佳稀釋比為1:30。
[0037]三、免疫反應(yīng)緩沖液種類優(yōu)化 免疫緩沖液對(duì)反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度也有一定的影響，實(shí)驗(yàn)選擇常用的四種緩沖液濃度 為0.01 mol/L、pH 7.4的PBS，濃度為0.01 mol/L、pH 7.4的PBST，濃度為0.01 mol/L、pH 7 的BS，濃度為0.05 mol/L、pH 9.6的BC進(jìn)行考察，結(jié)果如圖5所示，體系熒光強(qiáng)度從大到小對(duì) 應(yīng)的緩沖液分別為PBST、PBS、BS和CB，原因是CB緩沖液pH較高，對(duì)量子點(diǎn)的穩(wěn)定性可能造成 一定的影響，PBST與PBS相比添加了表面活性劑Tween-20,其能夠提高溶液中量子點(diǎn)的分散 性，減少因量子點(diǎn)團(tuán)聚而造成的熒光淬滅。因此選擇最佳的免疫反應(yīng)緩沖液為PBST。
[0038] 四、固相抗體捕獲抗原作用時(shí)間優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)對(duì)固相抗體捕獲樣品中待測(cè)抗原的作用時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果如圖6所示，固相抗體 與抗原作用時(shí)間為60 min時(shí)反應(yīng)已達(dá)到平衡，體系熒光強(qiáng)度最高，因此選擇最佳抗原作用 時(shí)間為60 min。
[0039] 五、QDsOPcAb作用時(shí)間優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)對(duì)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體QDsOPcAb與抗原的作用時(shí)間進(jìn)行考察，結(jié)果見(jiàn)如7所示，隨時(shí)間 增加，體系熒光強(qiáng)度逐漸增大，120 min達(dá)到最大后下降，因此選擇QDsOPcAb的作用時(shí)間為 120 min〇
[0040] 六、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用PBS將DNMTl標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度范圍為0.001 ng/mL~1500 ng/mL的試樣，按照優(yōu)化 后的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次，將樣品孔熒光值記為RFU。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn) 對(duì)于不同DWTl濃度范圍，熒光值與DWTl濃度的關(guān)系不同，因此，采用分段的方法繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線。
[0041 ] 在DNMTl濃度為5.0 ng/mL~1500 ng/mL范圍內(nèi)，以DNMTl標(biāo)準(zhǔn)品濃度(Cdnmti)為橫 坐標(biāo)，熒光值RFU為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示，在5.0~1500 ng/mL范圍內(nèi)，本方法檢 測(cè)DNMTl 的回歸方程為Y=0.00 775X+20.77161 (Y為RFU，X為Cdnmti)，相關(guān)系數(shù)r為0.9873。 [0042] 在·ΜΤ1濃度為0.1 ng/mL~5.0 ng/mL范圍內(nèi)，對(duì)·ΜΤ1濃度以及相應(yīng)的熒光值 RFU取對(duì)數(shù)，以DNMTl標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)（IgC)為橫坐標(biāo)，熒光值RFU的對(duì)數(shù)（IgRFU)為縱坐標(biāo) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9所示，在0.1 ng/mL~5.0 ng/mL范圍內(nèi)，本方法檢測(cè)DNMTl的回歸方程 為Y=O · 02779X+1 · 29858(Y為IgRFU，X為IgCDNMTi)，相關(guān)系數(shù)r為0 · 9877。
[0043]七、該方法檢測(cè)條件的確立： 7.1檢獅艮 取濃度分別為0.001 ng/mL、0.005 ng/mL、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL的8個(gè)低濃度區(qū)的DNMTl試樣按照上述檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié) 果見(jiàn)表7.1，同時(shí)檢測(cè)6個(gè)·ΜΤ1抗原空白的樣品，X為16.131，SD為0.996，求出X+3SD的值為 19 · 119，RFU(q.5)>19 · 119，因此該方法的檢測(cè)限為0 · I ng/mL。
[0044] 表7.1低濃度DNMTl試樣檢測(cè)結(jié)果
7.2精密度 板內(nèi)和板間精密度的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7.2，對(duì)于高、中、低三個(gè)濃度的樣品，板內(nèi)精密度相 對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)的范圍為5.45%~11.29%，板間精密度RSD的范圍為7.03%~11.25%因此該 方法的檢測(cè)限為0.1 ng/mL板內(nèi)加標(biāo)回收率的范圍為91.67%~106.50%，板間加標(biāo)回收率的 范圍為92 · 18% ~108 · 50%。
[0045]表7.2板內(nèi)和板間精密度(n=3)
7.3準(zhǔn)確度 板內(nèi)和板間的回收率的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表7.3,對(duì)于高、中、低三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，板內(nèi)加標(biāo) 回收率的范圍為91.67%~106.50%，板間加標(biāo)回收率的范圍為92.18%~108.50%。
[0046]表7.3板內(nèi)和板間回收率
7.4特異性 由于FLISA將用于血清中·ΜΤ 1檢測(cè)，血清成分復(fù)雜，要求FLISA對(duì)·ΜΤ 1具有較高的特 異性，因此采用血清中與DNMTl結(jié)構(gòu)相似的·MT3a和·MT3b對(duì)方法的特異性進(jìn)行考察，將測(cè) 得的樣品熒光強(qiáng)度帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=0.02779X+1.29858(Y為lgRFU，X為lgC DNMTi)，計(jì)算得到相 當(dāng)于DNMTl的量，結(jié)果見(jiàn)表7.4,從表中可以看出DNMT3a和DNMT3b對(duì)FLISA的交叉反應(yīng)率分別 為4.0%和9.4%，交叉反應(yīng)率低，表明FLISA法用于檢測(cè)DNMTl特異性好。
[0047] 表7.4 FLISA測(cè)定DNMTl的特異性
[0048] (8 )、該方法檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證試驗(yàn)： 將實(shí)驗(yàn)中建立的FLISA回歸曲線方程應(yīng)用于血清樣品中DNMTl含量的檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié) 果與實(shí)驗(yàn)室建立的ELISA和MELISA進(jìn)行比較，同時(shí)以商品ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果對(duì)三種方 法進(jìn)行評(píng)價(jià)。此外，在血清樣品中加入一定濃度的·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)品，用所建立的方法進(jìn)行測(cè)定， 計(jì)算加標(biāo)回收率。
[0049] 8.1血清樣本收集與處理 血清樣本均取自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與重癥科室。所有血清樣本均在患者晨起 空腹?fàn)顟B(tài)下采集，抽取靜脈血3mL，置于非抗凝管內(nèi)，37 °C水浴30min，3000r/min離心5min， 分離血清存于干燥凍存管中密封，置于-80°C冰箱備用。棄去有溶血現(xiàn)象的血清樣本。
[0050] 8.2血清中DNMTl含量檢測(cè) 取30例血清樣品，用FLISA、ELISA和MELISA法檢測(cè)血清中DNMT1含量，并與商品ELISA試 劑盒檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。
[0051 ] 8.3血清樣品加標(biāo)回收率和精密度 分別在血清樣品中加入高、中、低（1000 ng/mL、500 ng/mL、50 ng/mL)三個(gè)濃度的 DNMTl標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定加標(biāo)樣品的熒光強(qiáng)度或吸光度，同時(shí)檢測(cè)未加標(biāo)血清的熒光強(qiáng)度或吸光 度，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，根據(jù)公式4.1計(jì)算加標(biāo)回收率，同時(shí)計(jì)算相應(yīng)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。 [0052] 表8.1 FLISA對(duì)血清中DNMTl含量的檢測(cè)結(jié)果
[0053] 用SPSS 21.0對(duì)以上檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，F(xiàn)LISA、ELISA以及商品ELISA試劑盒 的檢測(cè)結(jié)果均符合正態(tài)分布，分別將FLISA和商品ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果、ELISA和商品 ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果前者t=l. 913、P=0.233，后者t=0.256、P= 0.927,兩組數(shù)據(jù)P值均大于0.05,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中建立的FLISA、ELISA方法與商品ELISA試劑盒 對(duì)血清中DNMTl含量檢測(cè)結(jié)果的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0054]因此，由該方法建立的回歸方程對(duì)·MT 1檢測(cè)的線性范圍寬、檢測(cè)限低、精密度、準(zhǔn) 確度高且具有良好的特異性。
[0055]最后應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是：以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)其限制；盡 管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說(shuō)明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解:依然 可以對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換;而不脫離本發(fā) 明技術(shù)方案的精神，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請(qǐng)求保護(hù)的技術(shù)方案范圍當(dāng)中。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMT1的方法，具體步驟包括： 提供一種表面被DNMT1單克隆抗體共價(jià)修飾的Fe3〇4納米免疫磁性顆粒，記為Fe3〇4@ McAb ； 提供一種表面被量子點(diǎn)標(biāo)記的DNMT1多克隆抗體，記為QD sOPcAb; 將經(jīng)CB緩沖液稀釋后的所述Fe3〇4@McAb與經(jīng)PBS緩沖液稀釋后的·MT1標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目 標(biāo)物進(jìn)行溫育反應(yīng)50 min~60 min，使得所述·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物被Fe3〇4麵cAb捕 獲、富集分離； 然后將經(jīng)PBST緩沖液稀釋后的所述QDsOPcAb與被Fe3〇4@McAb捕獲、富集分離的所述 MT1標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物進(jìn)行溫育反應(yīng)110 min~130 min，使得所述QDsOPcAb與所述 DNMT1標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物相結(jié)合;經(jīng)PBST緩沖液稀釋后，在多功能微孔板讀數(shù)儀上測(cè)定 270 nm激發(fā)下反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度； 根據(jù)檢測(cè)的熒光強(qiáng)度與所述·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)樣或待測(cè)目標(biāo)物濃度之間的關(guān)系，分段建立檢 測(cè)DNMT1的回歸方程。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法，其特征在于，它還包 括采用ELI SA法檢測(cè)提供的所述Fe3〇4麵cAb的生物活性的步驟。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMT1的方法，其特征在于，提供 一種所述Fe3〇4麵cAb的步驟包括： (1) 清洗:將Fe3〇4納米顆粒懸浮液經(jīng)超聲、磁分離棄上清處理后，采用濃度為0.01 mol/ L~0.015 mol/L、pH為6.0的MES緩沖液對(duì)其平衡2min~5 min，然后進(jìn)行磁分離、棄上清處 理得到第一沉淀物； (2) 活化：向所述第一沉淀物中依次加入濃度為8 mg/mL~10 mg/mL的EDC溶液和濃度 為8 mg/mL~11 mg/mL的NHS溶液進(jìn)行禍旋反應(yīng)10 min~15 min，經(jīng)磁分離、棄上清處理后， 采用MES緩沖液對(duì)其洗滌3~4次，然后再進(jìn)行磁分離、棄上清處理得到第二沉淀物； (3) 緩沖體系轉(zhuǎn)換:采用PBS緩沖液對(duì)所述第二沉淀物洗滌3~4次次，磁分離得到第三 沉淀物； (4) 偶聯(lián)：向所述第三沉淀物中加入DNMT1單克隆抗體和roS緩沖液進(jìn)行渦旋反應(yīng)1.5 h ~2 h，經(jīng)磁分離、棄上清處理后采用PBS緩沖液對(duì)其清洗2次，磁分離、棄上清得到第四沉淀 物； (5) 封閉：向所述第四沉淀物中加入BSA封閉液，進(jìn)行渦旋反應(yīng)0.5 h~1 h，磁分離、棄 上清處理后，采用PBST緩沖液清洗3~4次，磁分離、棄上清得到第四沉淀物即Fe3〇4麵cAb; (6) 保存:在Fe3〇4@McAb中加入PBS緩沖液，輕晃搖勻，4°C保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)DNMT1的方法，其特征在于，采用 ELI SA法檢測(cè)提供的所述Fe3〇4麵cAb的生物活性的步驟包括： (1) 將經(jīng)濃度為45 mmol/L~50 mmol/L、pH為9 · 0~9 · 6的CB緩沖液稀釋的Fe3〇4iMcAb加 入到酶標(biāo)板中，磁分離，采用PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板拍干備用； (2) 采用roS緩沖液配制濃度為300 ng/mL~400 ng/mL的·ΜΤ1標(biāo)準(zhǔn)品，并將其加入上 述酶標(biāo)板中，恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理并采用PBST緩沖液清洗 所述酶標(biāo)板； (3) 采用封閉液將·ΜΤ1多克隆抗體稀釋400~500倍，然后將其以每孔100微升加入到 所述酶標(biāo)板中，35°C~37°C恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理并采用 PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板； (4)用封閉液將HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG稀釋4000~5000倍，以每孔100微升將其加入 到所述酶標(biāo)板中，35°C~37°C恒溫箱中溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離處理并采用 PBST緩沖液清洗所述酶標(biāo)板； (5 )將TMB顯色劑A液和B液等體積混合，將其加入到所述酶標(biāo)板中，35 °C~37 °C避光溫 育反應(yīng)15~20min;顯色反應(yīng)后，向所述酶標(biāo)板中加入H2SO4終止液，并立即在酶標(biāo)儀上檢測(cè) 各孔的吸光度OD，其中，檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法，其特征在于，它還包 括采用夾心法檢測(cè)提供的所述QDsOPcAb的熒光強(qiáng)度及抗體活性的步驟。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法，其特征在于，提供一 種所述QDsOPcAb的步驟包括： 將pH為7.0~7.4的硼酸鹽緩沖液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入濃度為0.5 微摩爾每升~1微摩爾每升的QDs和濃度為0.5 mg/mL~1 mg/mL的·MT1多克隆抗體，每次 加入上述物質(zhì)后均需振蕩混勻； 然后向所述PE管中加入濃度為8 mg/mL~10 mg/mL的EDC溶液，在18°C~25°C下渦旋反 應(yīng)1.5 h~2 h，反應(yīng)結(jié)束后向所述PE管中加入含質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為0.5%~1.0%的BSA封閉液的 PBS緩沖液，在18°C~25°C下渦旋反應(yīng)20 min~30 min; 所得反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)離心、超濾除去EDC后溶于BS緩沖液中，4°C保存，從而制得所述QDs@ PcAb〇7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法，其特征在于，采用夾 心法檢測(cè)提供的所述QDsOPcAb的熒光強(qiáng)度及抗體活性的步驟包括： 將經(jīng)濃度為45 mmol/L~50 mmol/L、pH為9.0~9.6的CB緩沖液稀釋的QDsOPcAb加入到 黑色96孔酶標(biāo)板中，恒溫溫育80 min~90 min，然后進(jìn)行磁分離并采用PBST緩沖液清洗所 述黑色96孔酶標(biāo)板，然后加入PBST在多功微孔板讀數(shù)儀上測(cè)熒光強(qiáng)度。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法，其特征在于，它還包 括將上述各步驟中各參數(shù)的優(yōu)化的步驟，然后根據(jù)優(yōu)化參數(shù)建立檢測(cè)DNMT1的回歸方程，其 中，在DNMT1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為5.0 ng/mL~1500 ng/mL范圍內(nèi)，所建立的回歸方程為Υ= 0.00775Χ+20.77161，其中，Υ代表熒光值RFU，X為DNMT1標(biāo)準(zhǔn)品濃度，相關(guān)系數(shù)r為0.9873;在 MT1標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.1 ng/mL~5.0 ng/mL范圍內(nèi)，本方法檢測(cè)·ΜΤ1的回歸方程為Y= 0.02779Χ+1.29858，其中Υ代表lgRFU，X代表lgDNMTl，相關(guān)系數(shù)r為0.9877。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的基于量子點(diǎn)熒光免疫檢測(cè)·ΜΤ1的方法，其特征在于，該方法 對(duì)DNMT1濃度的最低檢測(cè)限為0.1 ng/mL。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK105842451SQ201610324656
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月17日
【發(fā)明人】吳擁軍, 劉利娥, 熊亞敏, 玉崧成, 于斐, 何磊良, 屈凌波, 王華棟
【申請(qǐng)人】鄭州大學(xué)