耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(mrsa)的鑒定的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種鑒定細(xì)菌樣本中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，該方法包括以下步驟：將樣本中的細(xì)菌分類為金黃色葡萄球菌(SA)并確定是否存在酚溶性調(diào)控蛋白肽或其變體，其中，存在PSM?mec肽或其變體表明該金黃色葡萄球菌為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。該變體優(yōu)選為PSM?mec肽的甲?；凅w，該變體在單質(zhì)子化狀態(tài)的質(zhì)荷比為2415。
【專利說明】
耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的鑒定
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的鑒定，尤其是通過質(zhì)譜進(jìn)行鑒 定。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus) (S.aureus)為芽抱桿菌目和葡萄球菌 科細(xì)菌，常見于人類呼吸道和皮膚上。雖然金黃色葡萄球菌未必總是具有致病性，但它是皮 膚感染(例如癤）、呼吸系統(tǒng)疾病(例如鼻竇炎)和食物中毒的普遍原因。目前已證實(shí)，它有獲 得抗菌劑耐藥性的超常能力。20世紀(jì)80年代末，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)開始在 醫(yī)院傳播，隨后開始出現(xiàn)社區(qū)獲得性菌株(CA-MRSA)。目前它仍是醫(yī)院獲得性感染的五個(gè)最 常見原因之一，并且通常是手術(shù)后傷口感染的原因。如今，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (MRSA)給全世界大多數(shù)國家的醫(yī)院衛(wèi)生帶來了問題。
[0003] 對甲氧西林的耐藥性通過mec操縱子介導(dǎo)，該操縱子是葡萄球菌盒式染色體mec (SCCmec)的一部分。耐藥性通過mecA基因獲得，該基因編碼改變的青霉素結(jié)合蛋白（例如 PBP2a)，該蛋白結(jié)合β-內(nèi)酰胺(青霉素、頭孢菌素和碳青霉烯類)的親和力較低。這使得在存 在內(nèi)酰胺的情況下，啟動(dòng)轉(zhuǎn)肽酶活性，從而阻止它們抑制細(xì)胞壁合成。迄今為止，已檢測 出^^一種不同的SCCmec類型以及多種亞型和變體。這些盒式染色體在序列和集成移動(dòng)元件 方面顯示出高度多樣性。
[0004] 在臨床實(shí)驗(yàn)室中，完整細(xì)胞的基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F MS)正在越來越廣泛地用于患者樣本細(xì)菌的鑒定。通過MALDI-TOF MS鑒定細(xì)菌所使用的分 析物離子(尤其是核糖體蛋白離子)通常具有單電荷，因此人們只需要簡單參考離子的質(zhì)量 m。然而，更準(zhǔn)確的術(shù)語是"電荷相關(guān)質(zhì)量" m/z，實(shí)際上，這在質(zhì)譜中是必需的。
[0005] 已經(jīng)有多項(xiàng)研究分析了通過質(zhì)譜法(尤其是MALDI-TOF MS)區(qū)分甲氧西林敏感（易 感)金黃色葡萄球菌(MSSA)與MRSA的可能性：
[0006] -Edwards-Jones V 等，J.Med.Microbiol· ,2000,49,295-300: "Rapid discrimination between methici11 in-sensitive and methici11 in-resistant Staphylococcus aureus by intact cell mass spectrometry'，；
[0007] -Du Z.等，Anal.Chem.，2002,74,5487-5491: "Identification of Staphylococcus aureus and determination of its methiciIIin resistance by matrix-assisted laser desorption/ionization time-〇f-fIight mass spectrometry'，；
[0008] -Lu JJ·等，Anal·Chem.，2012，84，5685-5692:"Peptide biomarker discovery for identifica-tion of methici11 in-resistant and vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus strains by MLDI-TOF^;
[0009] -Bernardo K ·等，Proteomi cs，2002，2，747-753 : "I dent if i cat ion and discrimination of Staphylococcus aureus strains using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry"；
[0010] -Majcherczyk PA 等，F(xiàn)EMS Microbiol.Lett，2006,255,233-239: "The discriminatory power of MALDI-TOF mass spectrometry todifferentiate between isogenic teicoplanin-susceptible and teicoplanin-resistant strains of methicillin resis-tant Staphylococcus aureus'，；
[0011]-孫等，衛(wèi)生研究，2011，40,375-378:"基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜快速 鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌"。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 本發(fā)明提供一種鑒定細(xì)菌樣本中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，該方 法包括以下步驟:將樣本中的細(xì)菌分類為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)并 確定是否存在酚溶性調(diào)控蛋白肽或其變體，其中，存在PSM-mec肽或其變體表明該金黃色葡 萄球菌是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。變體優(yōu)選為PSM-me c肽的甲?；凅w，該變體在單質(zhì) 子化狀態(tài)的質(zhì)荷比為2415。
[0013] 可以通過獲得整個(gè)(完整）細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)譜并確定質(zhì)譜中存在至少一個(gè)m/z介于 2404和2420之間的質(zhì)量信號(hào)，尤其是存在m/z中心位置為2415的質(zhì)量信號(hào)，從而確定存在 PSM-mec肽或其變體。還可以可通過在細(xì)菌樣本中施加溶劑（例如類似如乙醇等的有機(jī)溶 劑），獲得所得到的上清液的質(zhì)譜并確定質(zhì)譜中存在至少一個(gè)m/z介于2404和2420之間的質(zhì) 量信號(hào)，尤其存在m/z中心位置為2415的質(zhì)量信號(hào)，從而來確定存在PSM-mec肽或其變體。此 外，還可選擇m/z介于2404和2420之間的母離子，尤其是m/z中心位置為2415的母離子，并通 過包含這些母離子的細(xì)菌樣本的串聯(lián)質(zhì)譜從而確定存在PSM-mec肽或變體。
[0014] 優(yōu)選通過以下方式將細(xì)菌分類為金黃色葡萄球菌:獲得細(xì)菌的樣本質(zhì)譜，并且將 該樣本質(zhì)譜與文庫中的參考質(zhì)譜進(jìn)行比較，所述文庫包括至少一個(gè)金黃色葡萄球菌的參考 質(zhì)譜。參考質(zhì)譜可以是眾所周知的細(xì)菌株系的測量質(zhì)譜，或者可以衍生自細(xì)菌株系的基因 序列。樣本質(zhì)譜優(yōu)選是整個(gè)(完整)細(xì)菌細(xì)胞的MALDI-T0F質(zhì)譜。使用質(zhì)譜分配細(xì)菌的分類學(xué) 類別（分類學(xué)分類/鑒定）在出版物Van Baar(FEMS Microbiology Reviews，24,2000,193-219:"Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ ionization and electrospray mass spectrometry"）和Jarman等人（Analytical Chemistry ,72(6),2002,1217-1223：An Algorithm for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry)中均有描述。優(yōu)選通過在樣本質(zhì)譜中至少存在一個(gè)m/z介于2404和2420之間 的質(zhì)量信號(hào)從而確定PSM-mec肽或其變體的存在，尤其是通過存在m/z中心位置為2415的質(zhì) 量信號(hào)確定PSM-mec肽或其變體的存在，其中，該樣本質(zhì)譜也用于分類學(xué)分類。
[0015]根據(jù)本發(fā)明的方法可進(jìn)一步包括確定金黃色葡萄球菌的agr(附屬基因調(diào)節(jié)子)系 統(tǒng)狀態(tài)的步驟，即，金黃色葡萄球菌的agr是陽性還是陰性。存在agr系統(tǒng)和存在PSM-mec肽 或其變體表明該金黃色葡萄球菌是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，而存在agr系統(tǒng)但不存在 PSM-mec肽或其變體則表明該金黃色葡萄球菌是甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌?？梢酝ㄟ^ 是否存在δ毒素（delta-toxin)來確定agr系統(tǒng)的狀態(tài)，其中存在δ毒素表明存在 agr系統(tǒng) (agr陽性）?？梢酝ㄟ^質(zhì)譜確定δ毒素，其中，在細(xì)菌樣本的質(zhì)譜(最好是用于分類學(xué)鑒定的 樣本質(zhì)譜）中存在m/z中心位置為3007或3037的質(zhì)量信號(hào)，則表明存在δ毒素，因此存在agr 為陽性的金黃色葡萄球菌。如果agr為陰性狀態(tài)，則無法確定金黃色葡萄球菌是MRSA還是 MSSA0
[0016] 細(xì)菌樣本可來自于瓊脂平板上、營養(yǎng)肉湯中或血液培養(yǎng)中的培養(yǎng)物，或直接來自 涂片或體液?？蓮沫傊桨宓哪z狀培養(yǎng)基上生長的菌落收集細(xì)菌。在液體營養(yǎng)肉湯或血 液培養(yǎng)中培養(yǎng)的細(xì)菌可通過離心或過濾分離。在后一種情況中，優(yōu)選在裂解血細(xì)胞后再分 離。對涂片和血液等其他樣本而言，還必須裂解非細(xì)菌細(xì)胞。
[0017] 為了進(jìn)一步確定是否存在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，可以在確定存在PSM-mec 肽或其變體后執(zhí)行額外的抗生素敏感試驗(yàn)(AST)。該額外的抗生素敏感試驗(yàn)可以是常規(guī)試 驗(yàn)，其中，在抗生素的影響下確定營養(yǎng)肉湯中或瓊脂平板上的細(xì)菌生長，例如通過光學(xué)測量 確定營養(yǎng)肉湯的濁度或瓊脂平板的生長區(qū)。其他的抗生素敏感試驗(yàn)可基于質(zhì)譜，并且在例 如美國專利號(hào)US B8,293,496B2(Goverun等："Mass spectrometric measurement of microbial resistances"）和歐洲專利申請?zhí)?13002450.8(K.Sparbier 等："Mass spectrometric determination of microbial resistances"）和13002699.0(K.Sparbier 等："Determining the bacterial resistance by mass spectrometric easurement of the bacterial growth"）等中均有描述。
[0018] 在商業(yè)儀器中，在線性模式下使用基質(zhì)輔助激光解吸和電離飛行時(shí)間（MALDI-T0F)質(zhì)譜儀對微生物(如細(xì)菌)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定已為人們廣泛接受。然而，除了基質(zhì)輔助激光 解吸電離，其他類型的電離也可適用于獲得根據(jù)本發(fā)明的質(zhì)譜，例如電噴霧電離(ESI)或借 助后續(xù)化學(xué)電離(Cl)的解吸方法。此外，可以使用不同類型的質(zhì)量分析器，例如正交離子注 入的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜儀或四極桿過濾器。尤其四極桿過濾儀器可用于(例如） 通過選擇反應(yīng)監(jiān)測，從而確定是否存在m/z為2415的質(zhì)量信號(hào)。
[0019] 存在酚溶性調(diào)控蛋白肽(PSM-mec)或其變體還可以通過使用諸如MALDI-T0F MS或 四極桿過濾器等質(zhì)譜儀(尤其使用標(biāo)定物質(zhì)）來定量確定。如果已經(jīng)定量確定PSM-mec肽并 且細(xì)菌樣本中的細(xì)菌初始濃度已知，則可通過確定的PSM-mec肽的量確定抗藥性的強(qiáng)度。
【附圖說明】
[0020] 圖1示出了金黃色葡萄球菌菌株USA100的已測量MALDI-T0F質(zhì)譜以及該菌株的克 隆，其中可通過反義RNA的表達(dá)而使PSM-mec的表達(dá)下調(diào)。
[0021 ]圖2示出了根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方法的流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022]細(xì)菌的質(zhì)譜分類
[0023]通過質(zhì)譜對細(xì)菌進(jìn)行分類學(xué)分類通常開始于在陪替氏培養(yǎng)皿中的凝膠狀培養(yǎng)基 中培養(yǎng)清晰分離的菌落(分離物）。使用小棉棒(例如木質(zhì)牙簽)將少量細(xì)菌從菌落點(diǎn)涂到質(zhì) 譜樣本板上。采用公知方法將細(xì)胞裂解，添加基質(zhì)材料的溶液并使其干燥，并將樣本板插入 到借助基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)電離操作的飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(TOF)的離子源中。通過脈沖 激光發(fā)射生成離子，并測量它們的飛行時(shí)間。通常將上百個(gè)單一質(zhì)譜相加以改善信噪比。術(shù) 語通過MALDI-T0F質(zhì)譜儀獲得的"細(xì)菌質(zhì)譜"或"樣本質(zhì)譜"通常指許多單一質(zhì)譜相加的總質(zhì) 譜。
[0024] 在Van Baar的綜述中詳細(xì)說明了如何借由質(zhì)譜鑒定細(xì)菌（"FEMS Microbiology Reviews"，24，2000，193-219:"Characterization of bacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry"）。例如，可通過 分析細(xì)菌樣本質(zhì)譜和文庫中儲(chǔ)存的公知細(xì)菌菌株的參考質(zhì)譜的相似度來進(jìn)行鑒定。每次與 參考質(zhì)譜的相似度比較，都可計(jì)算相似度值。如果與確切參考質(zhì)譜的相似度值明顯優(yōu)于與 所有其他參考質(zhì)譜的相似度值，并且優(yōu)于預(yù)選相似度閾值，則該細(xì)菌可視為已鑒定細(xì)菌。根 據(jù)各個(gè)種的代表性參考質(zhì)譜的數(shù)量，分類學(xué)分類的鑒定通?？上蛳逻M(jìn)行到種級(jí)別。在 Jarman等人的出版物（"Analytical Chemistry"，72(6)，2002,1217-1223: "An Algorithm for Automated Bacterial Identification Using Matrix-Assisted Laser Desorp-1 tion/Ionization Mass Spectrometry"）中，描述了自動(dòng)生成參考質(zhì)譜和對待研究中的樣 本的質(zhì)譜與自動(dòng)生成的參考質(zhì)譜進(jìn)行相似度分析的計(jì)算機(jī)輔助方法。
[0025]測得m/z為2415的細(xì)菌混合物的鑒定
[0026]已經(jīng)有多項(xiàng)研究分析過使用MALDI-T0F MS區(qū)分甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌 (MSSA)與MRSA的可能性。尤其是，MRSA菌株與其同基因 MSSA突變體（在儲(chǔ)存期間丟失 SCCmec)的比較表明細(xì)胞提取物的質(zhì)譜沒有任何差異，從而說明mecA、PBP2a或其他抗藥性 變體編碼的蛋白質(zhì)過大(76kDa)或存在的量太少，從而在常規(guī)測量期間無法通過細(xì)胞提取 物的MALDI-T0F MS檢測到。
[0027] 使用完整的MRSA和MSSA細(xì)胞，即直接將整個(gè)細(xì)胞放置在靶上而不事先進(jìn)行提取， 可在Rhine-Hesse克?。ㄐ蛄蓄愋停⊿T)225，克隆群（clonal complex)(CC)5)的MRSA菌株中 檢測到m/z為2415的質(zhì)量信號(hào)。在這些菌株的細(xì)胞提取物中未觀察到m/z為2145的質(zhì)量信 號(hào)。質(zhì)量信號(hào)對應(yīng)于酚溶性調(diào)控蛋白（PSM)PSM-mec的甲?；姹镜膯坞姾?質(zhì)子化)離子的 已計(jì)算的質(zhì)量。
[0028]為了證明m/z為2415的質(zhì)量信號(hào)由PSM-mec肽產(chǎn)生，可構(gòu)建這樣的一個(gè)株系，其中， 可通過反義RNA的表達(dá)從而使PSM-mec的表達(dá)下調(diào)。因此，寡核苷酸psmmecfor (aattcgcctgaatgcaagtcttgattaaatcaat-aatgcttgtaataacaccagtt)和psmmecrev (ctagaactggtgttattacaagcattattgatttaatcaagacttgcattca-ggcg)相互退火并直接與 EcoRI/Xbal消化的載體pEPSA5結(jié)合，從而產(chǎn)生pEPSA5-psm-mec。產(chǎn)生的株系包含50bp的 PSM-mec片段，位于反義方向木糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子之后。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)換為ST5USA100分離物 (NRS382)，其包含A類mec基因復(fù)合體。株系在LB瓊脂上生長，該瓊脂包含34mg/l的氯霉素， 作為隔夜是否存在50mM木糖的選擇劑。細(xì)胞材料直接放置在MALDI-T0F MS研磨鋼靶板上， 從而形成細(xì)菌融合層。在接下來的步驟中，將UU的甲酸(70%)添加到細(xì)菌層，然后添加 UU 的乙腈，小心混合并風(fēng)干。然后，在每個(gè)樣本上覆蓋2μ1的基質(zhì)（α-氰基-4-羥基-肉桂酸的 50%乙腈/2.5%三氟乙酸的飽和溶液)并再次在室溫下風(fēng)干。使用1^1^1-1'0?1^分析樣本， 并在正線性模式下測量。
[0029] 圖1示出了菌株USA100(圖1Α)、存在木糖時(shí)含有pEPSA5-psm-mec的菌株USA100(圖 1B)和不存在木糖時(shí)含有pEPSA5-psm-mec的菌株USA100(圖1C)的測量質(zhì)譜。m/z為3007的質(zhì) 量信號(hào)由δ毒素產(chǎn)生，而m/z為2415的質(zhì)量信號(hào)(對應(yīng)于PSM-mec肽)被存在木糖時(shí)反義RNA的 表達(dá)所抑制。結(jié)果顯示，在向含有重組PEPSA5載體的株系添加木糖后m/z為2415的信號(hào)大幅 降低，這證明了通過這種方法觀察到的m/z為2415的信號(hào)確實(shí)是PSM-mec。
[0030] 通過A類mec基因復(fù)合體鑒定MRSA
[0031] PSMnec是小分泌肽，在包含A類mec基因復(fù)合體的三個(gè)SCCmec盒（II、III和VIII 型）上編碼（Chatter jee等人："Distribution and regulation of the mobile genetic element-encoded phenol-soluble modulin PSM-mec in methici11 in-resistant Staphylococcus aureus"，2011，PloS 0ne，6:e28781)。所有PSM的產(chǎn)生均由agr系統(tǒng)調(diào)節(jié)， 該系統(tǒng)參與金黃色葡萄球菌中的群體感應(yīng)，并直接通過AgrA的磷酸化形式調(diào)節(jié)δ毒素和PSM 的表達(dá)。因此，可通過δ毒素(m/z為3007(大部分CC)或在CCl菌株中m/z為3037)的表達(dá)來判 斷菌株的agr狀態(tài)，這通常表示整個(gè)細(xì)胞的質(zhì)譜中最強(qiáng)的信號(hào)。如金黃色葡萄球菌Mu50等 agr陰性類型菌株表不未產(chǎn)生δ毒素和PSM-mec，同樣在δ毒素陰性類型菌株或臨床分離物中 未觀察到PSM-mec的產(chǎn)生。
[0032]然而，A類mec基因復(fù)合體出現(xiàn)在多種醫(yī)院相關(guān)性MRSA譜系中，例如美國、東亞和歐 洲(紐約/日本株系或USA100)的ST5SCCmecII型醫(yī)院相關(guān)性MRSA和近緣ST225SCCmec II型 MRSAAT225菌株在中歐的醫(yī)院流行，并且去年占本地區(qū)MRSA分離物的70%以上。此外，這一 分組包括在澳大利亞、亞洲和美洲以及東歐（巴西/匈牙利株系)流行的ST239SCCmec III型 菌株以及以EMRSA-16OJSA200)為代表的ST36SCCmec II型MRSA，其只存在于歐洲、澳大利亞 和美國以及ST45菌株USA600中。
[0033] 表1:被測菌株
[0035]在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，在一系列的菌株和得到良好表征的常規(guī)臨床MRSA和MSSA分離 物中測試是否存在PSM-mec(表1)。根據(jù)其克隆群(CC)分組菌株。如果懷疑存在A類mec基因 復(fù)合體，則通過多重PCR執(zhí)行SCCmec盒分型。如果發(fā)生意外陰性或陽性測量，則還可通過PCR 檢測是否存在PSM-mec，以確認(rèn)在冷藏保存期間未丟失SCCmec或部分SCCmec，或排除MSSA中 存在肽的可能性。
[0036]使用兩種不同的方法制備MALDI樣本:可將整個(gè)新鮮菌落涂抹到靶板上并直接覆 蓋MALDI基質(zhì)，或者按照上述方法放置在靶上后直接使用甲酸/乙腈提取細(xì)胞。
[0037] 如上所述，agr陰性類型菌株表示未產(chǎn)生δ毒素和PSM-mec，同樣在δ毒素陰性類型 菌株或臨床分離物中未觀察到PSM-mec的產(chǎn)生。因此，在表2的評(píng)估中排除未顯不δ毒素信號(hào) 的所有曲線（12 %的涂抹和11.5 %的提取樣本）。
[0038] 表2:通過MALDI-TOF MS在含有A類mec基因復(fù)合體的agr陽性MRSA菌株內(nèi)檢測PSM-mec的敏感性和特異性
[0040] 在第一種類型的評(píng)估中，m/z介于2404和2420之間的所有信號(hào)（不論強(qiáng)度如何）均 包含在內(nèi)，從而導(dǎo)致使用靶上提取的整體敏感性為0.94,特異性大約為0.96。當(dāng)放置在靶上 后直接在樣本上覆蓋基質(zhì)時(shí)，敏感性稍微提高，但是測量的特異性低于0.8。假陽性菌株 (PSM-mec PCR陰性)在質(zhì)量稍低時(shí)(m/z < 2411)信號(hào)弱。
[0041] 在第二種類型的評(píng)估中，排除m/z值< 2411的所有相對較弱信號(hào)（例如強(qiáng)度<100 任意單位），將m/z 2 2411的所有相對較強(qiáng)信號(hào)(例如強(qiáng)度>100任意單位)視為陽性。由此， 因?yàn)橄怂屑訇栃跃?表2)，所以特異性大幅提高，從而表明在使用的菌株集合中僅 存在與SCCmec有關(guān)的PSM-mec。檢測到假陰性菌株的原因很可能是PSM-mec肽的低表達(dá)。 [0042]盲法試驗(yàn)的評(píng)價(jià)（"祀上提取"方法的135個(gè)樣本和直接涂抹到靶上的60個(gè)樣本)主 要包括含有 Π 型 SCCmec盒(ST5、ST225)的 CC5MRSA 并混有其他 CC (CC22、CC8、CC398)的MRSA 以及10種MSSA菌株，在之前采用細(xì)胞提取物的研究中，這些菌株無法與CC5MRSA進(jìn)行區(qū)分， 這表明只能鑒定出所有agr陽性CC5MRSA的95%。
[0043] 試驗(yàn)結(jié)果表明，可以通過MALDI-TOF MS鑒定包含A類mec基因復(fù)合體的agr陽性的 MRSA。與通過群集分析鑒定MRSA的早期嘗試相比，本發(fā)明使用PSM-mec肽作為具體標(biāo)記物。 標(biāo)記物的特性已知，并且它在多個(gè)SCCmec盒上編碼。由于該肽的陰離子性質(zhì)和存在于細(xì)胞 表面，可以在整個(gè)細(xì)胞測量期間檢測到該肽;并且在使用乙醇清洗細(xì)胞時(shí)(這是細(xì)胞提取常 規(guī)準(zhǔn)備的第一步），肽可能從細(xì)胞表面丟失。A類mec基因復(fù)合體存在于多個(gè)醫(yī)院相關(guān)性MRSA 譜系中。然而，無法通過此方法對含有SCCmec IV型盒的CA-MRSA菌株USA300、牲畜相關(guān)性 MRSA或醫(yī)院相關(guān)性CC22菌株(例如EMRSA-15)與MSSA進(jìn)行區(qū)分。
[0044]圖2示出了優(yōu)選方法的流程圖，包括以下步驟：（a)在瓊脂平板上培養(yǎng)待分析的樣 本；（b)選擇瓊脂平板上的至少一個(gè)細(xì)菌菌落作為細(xì)菌樣本；（c)獲得來自至少一個(gè)菌落的 細(xì)菌整個(gè)細(xì)胞的MALDI-TOF質(zhì)譜；（d)通過比較MALDI-TOF質(zhì)譜與文庫的參考質(zhì)譜對細(xì)菌進(jìn) 行分類，該文庫包含至少一個(gè)金黃色葡萄球菌的參考質(zhì)譜；以及(e)確定在MALDI-TOF質(zhì)譜 中是否存在第一和第二質(zhì)量信號(hào)，其中第一質(zhì)量信號(hào)的m/z中心位置為3007或3037,第二質(zhì) 量信號(hào)的m/z中心位置為2415,其中，當(dāng)存在第一和第二質(zhì)量信號(hào)時(shí)，至少一個(gè)菌落的細(xì)菌 被鑒定為耐甲氧西林，當(dāng)存在第一質(zhì)量信號(hào)但不存在第二質(zhì)量信號(hào)時(shí)，至少一個(gè)菌落的細(xì) 菌被鑒定為甲氧西林敏感。
[0045]由于檢測MRS主要子組的必要數(shù)據(jù)可在很多臨床實(shí)驗(yàn)室的金黃色葡萄球菌分類學(xué) 種鑒定期間獲得，因此根據(jù)本發(fā)明分析細(xì)菌樣本質(zhì)譜可提前檢測到至少部分醫(yī)院獲得性 MRSA菌株并提前隔離住院患者。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種鑒定細(xì)菌樣本中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，該方法包括以下步 驟:將樣本中的細(xì)菌分類為金黃色葡萄球菌(SA)并確定是否存在酚溶性調(diào)控蛋白肽(PSM-mec)或其變體，其中，存在PSM-mec肽或其變體表明所述金黃色葡萄球菌為耐甲氧西林金黃 色葡萄球菌。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)菌通過以下方式被分類為金黃色葡萄球 菌:獲得所述細(xì)菌的樣本質(zhì)譜，并且將所述樣本質(zhì)譜與文庫中的參考質(zhì)譜進(jìn)行比較，所述文 庫包含至少一個(gè)金黃色葡萄球菌的參考質(zhì)譜。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述樣本質(zhì)譜是整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的MALDI-TOF質(zhì)譜。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中，通過在所述樣本質(zhì)譜中存在m/z介于2404和2420 之間的質(zhì)量信號(hào)確定存在PSM-mec肽或其變體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中，通過在所述樣本質(zhì)譜中存在m/z中心位置為2415 的質(zhì)量信號(hào)確定存在PSM-mec肽或其變體。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，獲得整個(gè)細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)譜，并通過在質(zhì)譜中存在 m/z中心位置為2415的質(zhì)量信號(hào)確定存在PSM-mec肽或其變體。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，向細(xì)菌樣本中添加溶劑，獲得所得到的上清液的 質(zhì)譜并通過在質(zhì)譜中存在m/z中心位置為2415的質(zhì)量信號(hào)確定存在PSM-mec肽或其變體。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，通過包含選擇的m/z中心位置為2415的母離子的 細(xì)菌樣本的串聯(lián)質(zhì)譜，從而確定存在PSM-mec肽或其變體。9. 根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述PSM-mec肽的變體是PSM-mec肽的 甲?；姹?。10. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)一步包括:確定細(xì)菌樣本的金黃色葡萄 球菌的agr系統(tǒng)的狀態(tài)，其中，存在agr系統(tǒng)并且存在PSM-mec肽或其變體表明所述金黃色葡 萄球菌是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。11. 根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項(xiàng)所述的方法進(jìn)一步包括:確定細(xì)菌樣本的金黃色葡萄 球菌的agr系統(tǒng)的狀態(tài)，其中，存在agr系統(tǒng)并且不存在PSM-mec肽或其變體表明所述金黃色 葡萄球菌是甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌。12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的方法，其中，在細(xì)菌樣本中確定是否存在δ毒素，存在δ 毒素則表明存在agr系統(tǒng)。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，當(dāng)細(xì)菌樣本的MALDI-TOF質(zhì)譜中存在m/z為3007 或3037的質(zhì)量信號(hào)時(shí)，則確定細(xì)菌樣本中存在δ毒素。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述細(xì)菌樣本源自于瓊脂平板、液 體營養(yǎng)肉湯、涂片、體液和血液培養(yǎng)之一。15. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，包括以下步驟： (a) 在瓊脂平板上培養(yǎng)待分析的樣本； (b) 選擇瓊脂平板上至少一個(gè)細(xì)菌菌落作為細(xì)菌樣本； (c) 獲得來自至少一個(gè)菌落的細(xì)菌整個(gè)細(xì)胞的MALDI-TOF質(zhì)譜； (d) 通過比較MALDI-TOF質(zhì)譜與文庫的參考質(zhì)譜對細(xì)菌進(jìn)行分類，所述文庫包含至少一 個(gè)金黃色葡萄球菌的參考質(zhì)譜；以及 (e) 確定在MALDI-TOF質(zhì)譜中是否存在第一和第二質(zhì)量信號(hào)，其中第一質(zhì)量信號(hào)的m/z 中心位置為3007或3037,第二質(zhì)量信號(hào)的m/z中心位置為2415; 其中，如果存在第一和第二質(zhì)量信號(hào)，則至少一個(gè)菌落的細(xì)菌被鑒定為耐甲氧西林，如 果存在第一質(zhì)量信號(hào)但不存在第二質(zhì)量信號(hào)，則至少一個(gè)菌落的細(xì)菌被鑒定為甲氧西林敏 感。16.根據(jù)權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在確定存在PSM-mec肽或其變體之 后執(zhí)行額外的抗生素敏感試驗(yàn)，以確認(rèn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的鑒定。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK105849567SQ201480070689
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2014年12月18日
【發(fā)明人】加布里埃萊·比爾鮑姆, 克里斯蒂安·塞卡特, 納赫德·阿爾薩比提, 米夏埃萊·約斯滕, 馬里昂·賴夫
【申請人】布魯克道爾頓有限公司