基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球菌快速檢測(cè)方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人 肺炎鏈球菌抗原的快速檢測(cè)方法及檢測(cè)試劑盒，W及該檢測(cè)試劑盒的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 人肺炎鏈球菌（Str巧tococ州Spneumoniae,Sp)是兒童呼吸道感染的重要病原 體。主要經(jīng)飛沫傳播而進(jìn)入呼吸道，從而寄生于人體的鼻咽部，或侵入人體不易清除的部位 引起一系列的疾病，如大葉性肺炎，腦膜炎，支氣管炎，中耳炎等。它是全球所有年齡組高發(fā) 病率和病死率的主要病原菌。其中，在發(fā)展中國(guó)家，嬰幼兒、老年人及免疫缺陷人群中尤為 嚴(yán)重。肺炎鏈球菌于1881年首次由己斯德化ouis化steur)及G.M.Sternberg分別在法 國(guó)及美國(guó)從患者姨液中分離出。其為革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列 的雙球菌，有毒株菌體外有化學(xué)成分為多糖的芙膜。其芙膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型 的依據(jù)。根據(jù)芙膜多糖抗原性的不同將肺炎球菌分為91個(gè)血清型。肺炎鏈球菌菌體抗原 主要為C多糖，其存在于肺炎鏈球菌細(xì)胞壁中，具有種特異性，為各型菌株所共有。C多糖 可被血清中C-反應(yīng)蛋白沉淀。在巧離子存在時(shí)，C多糖可與正常人血清中稱為C-反應(yīng)蛋 白（Creactiveprotein,CRP)的目球蛋白結(jié)合，發(fā)生沉淀。目前針對(duì)人肺炎鏈球菌抗原 的檢測(cè)亦主要是針對(duì)此抗原，而該抗原非肺炎鏈球菌獨(dú)有，如緩和鏈球菌亦含有該抗原。在 肺炎鏈球菌表面還有一種與毒力相關(guān)的重要抗原，為肺炎鏈球菌表面蛋白A(PspA)，其存在 于肺炎鏈球菌所有血清型中，是肺炎鏈球菌的特異性抗原。但是PspA分子結(jié)構(gòu)高度變異， 具有抗原多樣性，其富含脯氨酸的結(jié)構(gòu)域上游被稱為CDR域，具有多樣性。根據(jù)CDR域的不 同將PspA分為 3 個(gè)家族 6 亞類；Cladel，Clade2,Clade3,Clade4,Clade5,Clade6。其中 Cladel,Clade2 屬于Faml家族；Clade3,Clade4,Clade5 屬于Fam2 家族，Clade6 屬于Fam3 家族。具有Faml或Fam2家族PspA蛋白的人肺炎鏈球菌占到了臨床分離的人肺炎鏈球菌 種類的99%W上。我國(guó)目前還未見具有fam3家族PspA蛋白的肺炎鏈球菌的臨床分離報(bào) 道。研究表明同一家族亞類間PspA蛋白間存在廣泛的抗原抗體交叉反應(yīng)，而異家族亞類間 則無(wú)此交叉反應(yīng)。
[0003] 臨床病人由于不同的呼吸道病原體（如副流感病毒、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等）感染引起疾病癥狀可W十分相似，送導(dǎo)致了流行診斷比較困難， 確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可W得到明 確的診斷，便于實(shí)施針對(duì)性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0004] 盡管肺炎鏈球菌在全球范圍內(nèi)傳播，嬰幼兒的感染尤其普遍，但可用于實(shí)驗(yàn)室診 斷的標(biāo)準(zhǔn)化商品試劑的種類極少。目前，肺炎鏈球菌的檢測(cè)主要有W下幾種方法：
[0005] -、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)
[0006] 1、細(xì)菌分離
[0007] 實(shí)驗(yàn)室診斷肺炎鏈球菌的金標(biāo)準(zhǔn)是分離人肺炎鏈球菌毒株。采用鼻咽分泌物作為 病原體分離的標(biāo)本，可w用血培養(yǎng)的方法分離病原體。但是該法有嚴(yán)重的缺陷，因?yàn)榉窝祖?球菌是苛養(yǎng)菌，營(yíng)養(yǎng)要求高，培養(yǎng)所需時(shí)間長(zhǎng)，陽(yáng)性率低，更重要的是，若采樣前患者使用過(guò) 抗菌藥物，會(huì)造成培養(yǎng)結(jié)果的假陽(yáng)性。送樣在臨床方面對(duì)病人的治療就有一定的局限性。 [000引 2、血清學(xué)檢測(cè)
[0009] 即采用酶聯(lián)免疫法、放免法、微量免疫英光法等，檢測(cè)被檢者血清中肺炎鏈球菌抗 體水平，可間接提示肺炎鏈球菌感染的存在。然而，血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧性的診 斷，它需要同時(shí)檢測(cè)患者急性期和恢復(fù)期的雙份血清，如果恢復(fù)期中抗人肺炎鏈球菌抗體 效價(jià)比急性期高4倍或4倍W上才有診斷意義。另外，抗體出現(xiàn)的時(shí)機(jī)不易掌握，且因?yàn)榫?體血清型種類過(guò)多，導(dǎo)致其誘生的抗芙膜多糖抗體種類過(guò)多，對(duì)抗體的檢測(cè)造成了很大的 困難，故現(xiàn)有血清學(xué)方法的檢測(cè)質(zhì)量受到一定限制。
[0010] 二、快速診斷
[0011] 直接檢查人肺炎鏈球菌蛋白抗原和菌體核酸可達(dá)到快速診斷的目的，目前主要有 膠體金免疫層析法、免疫英光法、免疫酶法和PCR法等。免疫英光法和免疫酶法均存在操作 步驟復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)（2hW上），成本較高等缺點(diǎn)。PCR方法快速、靈 敏、特異，是目前研究肺炎鏈球菌感染的重要手段，但由于PCR對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備W及操作要求較 高，且易出現(xiàn)假陽(yáng)性，在我國(guó)還不能作為常用的臨床診斷方法。膠體金免疫層析法的檢測(cè)目 標(biāo)抗原為C多糖抗原，但是膠體金法敏感度較低，對(duì)樣品材料質(zhì)量要求較高，同時(shí)還存在與 其他鏈球菌如緩和鏈球菌存在交叉反應(yīng)等缺陷。因此，建立具備高靈敏度的人肺炎鏈球菌 特異性抗原快速診斷法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 針對(duì)【背景技術(shù)】中存在的送些技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種基于磁性分離和量子點(diǎn) 標(biāo)記的能簡(jiǎn)便、快速、高靈敏度的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的檢測(cè)方法和試劑盒，W及該試劑 盒的制備及使用方法。
[0013] 本發(fā)明是通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0014] 一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的方法，其特征在于： 所述該方法包括W下步驟：
[001引1)兔抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體的制備；
[0016] 2)鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體的制備；
[0017] 如將步驟1)巧[J備的兔抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體分別 與納米磁珠通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，分別制備抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白免疫納米磁珠及抗人 肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白免疫納米磁珠，將抗人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白免疫納米磁珠 及抗人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白免疫納米磁珠等量混合即制得抗人肺炎鏈球菌免疫納米 磁珠；
[001引 4)將步驟2)制備的鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體分別 與納米量子點(diǎn)通過(guò)共價(jià)偶聯(lián)，分別制備量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球菌FamlPspA蛋白納米探 針W及量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白納米探針，將量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球 菌FamlPspA蛋白納米探針W及量子點(diǎn)標(biāo)記的人肺炎鏈球菌Fam2PspA蛋白納米探針等量混 合即制得量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米探針；
[0019]5)取人呼吸道分泌物樣本（包括但不限于咽拭子），用PBST緩沖液溶解后，加入 步驟3)制備得到的抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠，充分混合，反應(yīng)15-45min后進(jìn)行磁分 離，WPBST緩沖液洗涂2遍后，向磁分離得到的沉淀物中加入步驟4)制備得到的量子點(diǎn) 標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米探針，反應(yīng)25-45min后進(jìn)行磁分離，WPBST緩沖液洗涂2遍 后，使用英光酶標(biāo)儀讀取英光值；所述PBST緩沖液中各組分含量分別為8g/L化化，0. 2g/L KC1，0. 24g/LKH2PO4,1. 44g/L胞2冊(cè)〇4,0. 5ml/LTween-20,所述PBST緩沖液的抑=7. 4 ;
[0020] 6)根據(jù)步驟1)-步驟5)的方法分別檢測(cè)四份經(jīng)臨床確定為人肺炎鏈球菌陰性的 人群的呼吸道分泌物樣品，讀取英光值；所述人肺炎鏈球菌陰性的人群的呼吸道分泌物樣 品簡(jiǎn)稱人肺炎鏈球菌陰性對(duì)照樣品；所述四份人肺炎鏈球菌陰性對(duì)照樣品的英光值的平均 值與3倍標(biāo)準(zhǔn)差之和即為CUT-OFF值；若步驟5)中人呼吸道分泌物樣本的檢測(cè)英光值大于 CUT-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎鏈球菌抗原為陽(yáng)性；若步驟5)中人呼 吸道分泌物樣本的檢測(cè)英光值小于CUT-OFF值，則判斷為人呼吸道分泌物樣本中人肺炎鏈 球菌抗原為陰性。
[0021] 一種基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒，其特征在 于：所述基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒由具有富集人肺炎 鏈球菌功能的抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠、量子點(diǎn)標(biāo)記的抗人肺炎鏈球菌納米探針、質(zhì) 控品W及PBST緩沖液所組成；所述質(zhì)控品包括陽(yáng)性質(zhì)控品W及陰性質(zhì)控品；所述陽(yáng)性質(zhì)控 品由滅活的人肺炎鏈球菌干燥結(jié)合到拭子上而成；所述陰性質(zhì)控品是經(jīng)臨床確定為人肺炎 鏈球菌陰性的人群的咽拭子。
[0022] -種用于制備基于磁性分離和量子點(diǎn)標(biāo)記的檢測(cè)人肺炎鏈球菌抗原的試劑盒的 方法，其特征在于：所述制備方法包括W下步驟：
[0023] 1)抗人肺炎鏈球菌免疫納米磁珠的制備：
[0024] 1. 1)兔及鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG的制備
[002引 1. 1. 1)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白的制備、純化：
[002引 1. 1. 1. 1)對(duì)人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析，分別獲 取人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白胞外結(jié)構(gòu)域中抗原表位最為豐富的膚段，找到其 對(duì)應(yīng)的基因序列；
[0027] 1. 1. 1. 2)在步驟1. 1. 1. 1)中所得到的基因序列的5'端及3'端分別引入酶切位 點(diǎn)并分別化學(xué)合成全基因序列，同時(shí)標(biāo)記記為PspAl、PspA2 ;其序列參見序列表；
[0028] 1. 1. 1. 3)將步驟1. 1. 1. 2)中所得到的PspAl、PspA2按分子生物學(xué)方法分別克隆 入表達(dá)載體祀T-28a(+)后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中表達(dá)重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白；所述 重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白均W可溶性表達(dá)形式存在于基因工程菌體中；
[0029] 1. 1. 1. 4)用媒柱純化步驟1. 1. 1. 3)所得到的重組PspAl-His、PspA2-His融合 蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)其純度后，再W化a壯ord法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，調(diào)整二種蛋白濃度均為 0.2mg/mL后備用；
[0030] 1. 1. 2)兔及鼠抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體IgG的制備：
[003U 1. 1. 2. 1)W步驟1. 1. 1. 4)中所得到的重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白為完 全抗原，分別免疫新西蘭大白兔及豚鼠；分別制備兔抗重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋 白抗血清及鼠抗重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清；所述兔抗重組PspAl-His、 PspA2-His融合蛋白抗血清及鼠抗重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清的間接ELISA效價(jià)均大于IX 105 ;
[0032] 1. 1. 2. 2)采用用Protein G親和層析柱分別純化兔抗重組PspAl-His、PspA2-His 融合蛋白抗血清及鼠抗重組PspAl-His、PspA2-His融合蛋白抗血清中的多克隆抗體IgG ;
[0033] 1. 1. 2. 3)用凱基化aford蛋白含量檢測(cè)試劑盒測(cè)定步驟1. 1. 2. 2)所得到的四種 多克隆抗體IgG的濃度，將其蛋白濃度均調(diào)整為Img/mL后備用，此四種多克隆抗體IgG即 分別為兔抗人肺炎鏈球菌FamlPspA、Fam2PspA蛋白多克隆抗體Ig