一種新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新的牛磺熊去氧膽酸含量以及有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，所述有關(guān)物質(zhì)為?；蛆Z去氧膽酸和熊去氧膽酸，包括：制備對(duì)照品溶液和對(duì)照品供試品溶液；分別注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中?；切苋パ跄懰岬姆迕娣e，按照外標(biāo)法，以無(wú)水?；切苋パ跄懰醽?lái)計(jì)算HPLC含量；制備雜質(zhì)對(duì)照品溶液和樣品溶液；分別注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中?；蛆Z去氧膽酸和熊去氧膽酸的峰面積，再按照外標(biāo)法計(jì)算牛磺熊去氧膽酸樣品中有關(guān)物質(zhì)的大小。本發(fā)明采用高效液相色譜法應(yīng)用RID檢測(cè)器。在同一個(gè)液相色譜條件下有效的分離和準(zhǔn)確定量檢測(cè)?；切苋パ跄懰岷托苋パ跄懰醿煞N極性相差比較大的膽酸類(lèi)物質(zhì)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種新的牛磺熊去氧膽酸含量以及有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] ?；切苋パ跄懰??；切苋パ跄懰?化學(xué)名稱(chēng)為3a，7P二羥基膽烷酰-N-牛磺酸，是 由熊去氧膽酸(熊去氧膽酸)的羧基與?；撬岬陌被g縮水而成的結(jié)合型膽汁酸。1902年 自熊膽中發(fā)現(xiàn)牛磺熊去氧膽酸，其為熊膽中主要膽汁酸，具有解痙、抗驚厥、抗炎及溶膽石 等作用。?；切苋パ跄懰崾切苣懼挠行С煞?，化學(xué)名為2-[[(3<!，50，70)-3,7-二羥基-24-氧代膽留烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物。臨床主要用于治療膽囊膽固醇結(jié)石、原發(fā)硬 化性膽管炎、原發(fā)膽汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。臨床研究表明，牛磺熊去氧膽酸 與傳統(tǒng)的膽石溶解藥熊去氧膽酸相比，存在以下優(yōu)點(diǎn)1、溶石速度加快、全溶率提高，且無(wú)明 顯的不良反應(yīng)。2、?；切苋パ跄懰峋哂兴苄院痛既苄?，相對(duì)于熊去氧膽酸在體內(nèi)吸收速 度快。
[0003] 現(xiàn)有的文獻(xiàn)和發(fā)明關(guān)于高效液相測(cè)定?；切苋パ跄懰岬暮亢推渲杏嘘P(guān)物質(zhì)大 小主要有以下三個(gè)文獻(xiàn)和發(fā)明。
[0004] 1: "HPLC-ELSD法測(cè)定熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸的含量"（趙勇、 咎麗霞、孫文基;《藥物分析雜志》，2006，26 (1 )，127)
[0005] 2:"高效液相色譜法測(cè)定熊膽粉中?；切苋パ跄懰岷团；蛆Z去氧膽酸含量的研 究"（許學(xué)哲、張小勇、金星華;《延邊大學(xué)學(xué)報(bào)》，1999,25(2)，93)
[0006] 3:"高效液相色譜法測(cè)定荷膽膠囊中?；切苋パ跄懰岬暮?（蘭鴻、楊務(wù)彬等； 《中國(guó)藥業(yè)》，2011，20(11)，23)
[0007] 由于結(jié)合型膽酸類(lèi)物質(zhì)如牛磺熊去氧膽酸、牛磺鵝去氧膽酸，以及游離型膽酸類(lèi) 物質(zhì)如熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸。這兩種類(lèi)型的膽酸類(lèi)物質(zhì)在紫外低波長(zhǎng)，末端吸收附近 響應(yīng)值差距非常大，在紫外低波長(zhǎng)條件下結(jié)合型膽酸類(lèi)物質(zhì)響應(yīng)值是游離型膽酸類(lèi)物質(zhì) 100倍左右。同時(shí)游離型膽酸類(lèi)物質(zhì)的極性相對(duì)于游離型膽酸類(lèi)物質(zhì)來(lái)說(shuō)是非常小的，因此 在十八烷基硅膠柱即C18柱的條件下，保留時(shí)間非常靠后，該條件下游離型膽酸類(lèi)物質(zhì)不出 峰。因此當(dāng)檢測(cè)?；切苋パ跄懰針悠窌r(shí)，因此現(xiàn)有的牛磺熊去氧膽酸高效液相色譜條件下 熊去氧膽酸等游離型膽酸類(lèi)物質(zhì)的響應(yīng)值和保留時(shí)間不符合液相方法驗(yàn)證的要求。因此現(xiàn) 有的液相檢測(cè)方法只能夠分析和檢測(cè)結(jié)合型、極性較大的?；撬犷?lèi)膽酸物質(zhì)，如?；切苋?氧膽酸、?；蛆Z去氧膽酸，而對(duì)于其合成原料中的熊去氧膽酸以及熊去氧膽酸中的極性較 小的游離型膽酸類(lèi)物質(zhì)卻無(wú)法在一個(gè)液相色譜條件下分離，因此現(xiàn)有的檢測(cè)方法大部分是 通過(guò)薄層色譜法來(lái)檢測(cè)?；切苋パ跄懰嶂械男苋パ跄懰釟埩簟Ｒ虼藢?duì)于工業(yè)化生產(chǎn)?；切?去氧膽酸的中間產(chǎn)品控制，存在非常大的不便。不能有效，準(zhǔn)確的監(jiān)控牛磺熊去氧膽酸中熊 去氧膽酸的殘留。
[0008]故此，現(xiàn)有?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法有待于進(jìn)一步完善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種有效測(cè)定?；切苋パ?膽酸中有關(guān)物質(zhì)以及其中熊去氧膽酸限度的方法，本發(fā)明采用高效液相色譜法應(yīng)用RID檢 測(cè)器檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定?；切苋パ跄懰岬挠嘘P(guān)物質(zhì)和牛磺熊去氧膽酸的含量。本方法在同一 個(gè)液相色譜條件下有效的分離和準(zhǔn)確定量檢測(cè)?；切苋パ跄懰岷托苋パ跄懰醿煞N極性相 差比較大的膽酸類(lèi)物質(zhì)的方法的問(wèn)題。
[0010] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：
[0011] -種新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，所述有關(guān)物質(zhì)為?；蛆Z 去氧膽酸和熊去氧膽酸，其特征在于包括以下步驟：
[0012] A、取?；切苋パ跄懰?Sigma對(duì)照品為已知對(duì)照品，用稀釋劑溶解成濃度為0.5mg/ ml的對(duì)照品溶液，取牛磺熊去氧膽酸樣品用稀釋劑溶解為濃度為0.5ml/ml的對(duì)照品供試品 溶液；
[0013] B、分別取20ul注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中?；切苋パ跄懰岬姆迕娣e，按照 外標(biāo)法，以無(wú)水?；切苋パ跄懰醽?lái)計(jì)算HPLC含量，不小于99% ;
[0014] C、取中檢所對(duì)照品?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸，再用流動(dòng)相溶解成濃度為5ug/ ml的雜質(zhì)對(duì)照品溶液，取牛磺熊去氧膽酸樣品用稀釋劑溶解為濃度為0.5mg/ml的樣品溶 液；
[0015] D、分別取20ul注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中牛磺鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的 峰面積，再按照外標(biāo)法計(jì)算牛磺熊去氧膽酸樣品中有關(guān)物質(zhì)的大小，?；蛆Z去氧膽酸和熊 去氧膽酸不超過(guò)1.0 %和0.5 %。
[0016] 如上所述新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于所述流 動(dòng)相按以下方法制得:按O.lmol/L氯化銨水溶液：四氫呋喃：甲醇= 5:2:3的比例混合后，用 三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH為7.00。
[0017] 如上所述新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于所述的 液相色譜儀中采用C4色譜柱，流速:1.0ml/min，柱溫:40°C，檢測(cè)器采用示差折光檢測(cè)器。
[0018] 如上所述新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于所述的 稀釋劑為流動(dòng)相。
[0019] 如上所述新的牛磺熊去氧膽酸含量以及有關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在于還包括 有系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)定：
[0020] 分別取約25mg牛磺熊去氧膽酸，牛磺鵝去氧膽酸，熊去氧膽酸對(duì)照品用稀釋劑溶 解，搖勻并定容到50ml;取20ul進(jìn)樣記錄色譜圖各峰的分離度和理論塔板數(shù)，分離度的大小 要不小于1.5,理論踏板數(shù)不小于1500。
[0021] 綜上所述，本發(fā)明的有益效果：
[0022] -、本發(fā)明方法能夠快速準(zhǔn)確的測(cè)定?；切苋パ跄懰岬暮恳约捌渲信；蛆Z去氧 膽酸，熊去氧膽酸的含量。
[0023]二、相對(duì)現(xiàn)有的一些應(yīng)用ELSD檢測(cè)器的液相檢測(cè)方法，本發(fā)明方法應(yīng)用普通的RID 檢測(cè)器，檢測(cè)成本大大降低，非常有利于工業(yè)化大生產(chǎn)。
[0024]三、現(xiàn)有的HPLC檢測(cè)方法中，無(wú)法在一個(gè)液相條件下分離結(jié)合型和游離型的膽酸 類(lèi)物質(zhì)，即無(wú)法同時(shí)分離和檢測(cè)極性差異非常大的兩類(lèi)膽酸類(lèi)物質(zhì)，如無(wú)法同時(shí)定量牛磺 熊去氧膽酸和熊去氧膽酸，而本方法解決了這個(gè)問(wèn)題，在響應(yīng)值一樣的情況下，同時(shí)分離和 定量了了兩種極性相差比較大的膽酸類(lèi)物質(zhì)。
[0025] 四、該方法應(yīng)用RID檢測(cè)器，反相高效液相色譜法，本方法靈敏度高、可靠性強(qiáng)，檢 測(cè)成本低，適用于?；切苋パ跄懰嵘a(chǎn)中任何一步中間體的考察，也適用于?；切苋パ跄?酸本身的質(zhì)量控制檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
[0027] 本發(fā)明新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法中所述有關(guān)物質(zhì)為牛 磺鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸；
[0028] 1、本發(fā)明所采用的色譜條件：
[0029] 1.1色譜柱:04色譜柱
[0030] 1.2流動(dòng)相：按0. lmol/L氯化銨水溶液：四氫呋喃：甲醇=5: 2:3比例混合后，用三 乙胺調(diào)節(jié)溶液pH為7.00。
[0031] 1.3稀釋劑:流動(dòng)相
[0032] 1 ? 4流速：1 ? Oml/min柱溫:4(TC 進(jìn)樣體積：20ul
[0033] 1.5檢測(cè)器:示差折光檢測(cè)器
[0034] 2:HPLC?；切苋パ跄懰嵊嘘P(guān)物質(zhì)以及含量測(cè)定的方法
[0035] 2.1取?；切苋パ跄懰?sigma對(duì)照品為已知對(duì)照品，用稀釋劑溶解成濃度為 0.5mg/ml的對(duì)照品溶液，取?；切苋パ跄懰針悠酚孟♂寗┤芙鉃闈舛葹?.5ml/ml的對(duì)照品 供試品溶液。分別取20ul進(jìn)樣記錄色譜圖中?；切苋パ跄懰岬姆迕娣e，按照外標(biāo)法，以無(wú)水 ?；切苋パ跄懰醽?lái)計(jì)算HPLC含量，不小于99%。
[0036] 2.2取中檢所對(duì)照品?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸，再用流動(dòng)相溶解成濃度為5ug/ ml的雜質(zhì)對(duì)照品溶液，取?；切苋パ跄懰針悠酚孟♂寗┤芙鉃闈舛葹?.5mg/ml的樣品溶 液。分別取20ul進(jìn)樣記錄色譜圖中?；蛆Z去氧膽酸和熊去氧膽酸的峰面積，再按照外標(biāo)法 計(jì)算?；切苋パ跄懰針悠分杏嘘P(guān)物質(zhì)的大小，牛磺鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸不超過(guò)1.0% 和0.5%〇
[0037]為了驗(yàn)證本發(fā)明方法的系統(tǒng)適應(yīng)性，進(jìn)行了以下試驗(yàn)：
[0038]分別取約25mg?；切苋パ跄懰?，牛磺鵝去氧膽酸，熊去氧膽酸對(duì)照品用稀釋劑溶 解，搖勻并定容到50ml。取20ul進(jìn)樣記錄色譜圖各峰的分離度和理論塔板數(shù)，分離度的大小 要不小于1.5,理論踏板數(shù)不小于1500。
[0039]為了進(jìn)一步驗(yàn)證本方法，進(jìn)行了以下試驗(yàn)：
[0040] 一、?；切苋パ跄懰峋€性試驗(yàn)
[0041 ]取?；切苋パ跄懰岬幕瘜W(xué)對(duì)照品適量，用稀釋劑分別配置為0. lmg/ml、0.3mg/ml、 0.4mg/ml、0.6mg/ml、1. Omg/ml的供試品溶液。分別取20ul溶液，注入液相色譜儀中，記錄色 譜圖，各濃度的峰面積見(jiàn)下表1。
[0042]表1?；切苋パ跄懰峋€性實(shí)驗(yàn)
[0044] 以濃度對(duì)峰面積做線性回歸，得線性方程相關(guān)系數(shù)r2 = 0.9999。
[0045] 結(jié)果表明：?；切苋パ跄懰嵩?.1mg/ml~1.0mg/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。
[0046] 二、熊去氧膽酸線性實(shí)驗(yàn)
[0047]取熊去氧膽酸的化學(xué)對(duì)照品適量，用稀釋劑分別配置為lug/ml、2. Oug/ml、2.5ug/ ml、3. Oug/ml、4. Oug/ml的供試品溶液。分別取20u 1溶液，注入液相色譜儀中，記錄色譜圖， 各濃度的峰面積見(jiàn)下表2。
[0048]表2熊去氧膽酸的線性實(shí)驗(yàn)
[0050]以濃度對(duì)峰面積做線性回歸，得線性方程相關(guān)系數(shù)r2 = 0.9999。
[00511結(jié)果表明：熊去氧膽酸在1.0ug/ml~4.0ug/ml濃度范圍內(nèi)線性良好。
[0052]三、?；切苋パ跄懰釡?zhǔn)確度試驗(yàn)
[0053] 對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取牛磺熊去氧膽酸對(duì)照品約25mg，置于50ml量瓶中，稀 釋劑適量，使溶解，并用稀釋劑定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。
[0054] 供試品溶液的制備:分別精密稱(chēng)取?；切苋パ跄懰釋?duì)照品及供試品，含量為99%; 約20mg和20mg，25mg和25mg、30mg和30mg，分別置于100ml、100ml、100ml量瓶中，加稀釋劑適 量，使溶解，并用稀釋劑定容至刻度，搖勻，即得80%、100%、120%的樣品，每個(gè)濃度各配置 三份。按含量測(cè)定項(xiàng)下分別測(cè)定回收率，結(jié)果如下表3:
[0055] 表3回收率測(cè)定結(jié)果
[0057]結(jié)果表明：本法測(cè)定準(zhǔn)確度良好。
[0058]四、牛磺熊去氧膽酸精密度考察
[0059] 取上述準(zhǔn)確度項(xiàng)下100%的供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄主成分峰面積的精密 度如下表4。
[0060] 表4精密度試驗(yàn)結(jié)果
[0062]結(jié)果提示:方法的精密度良好。
[0063]五、?；切苋パ跄懰崛芤悍€(wěn)定性試驗(yàn)
[0064] 取上述準(zhǔn)確度項(xiàng)下100%的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、16、24小時(shí)，進(jìn)樣，記 錄主成分的峰面積變化，結(jié)果如下表5。
[0065]表5溶液穩(wěn)定性考察
[0067]結(jié)果表明，24小時(shí)內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。
[0068]六、方法耐用性試驗(yàn)
[0069] 取上述準(zhǔn)確度項(xiàng)下為100 %的供試品溶液，對(duì)色譜條件中的流動(dòng)相的pH值、色譜柱 溫度等條件進(jìn)行小范圍改動(dòng)，考察主成分的保留時(shí)間的影響及含量測(cè)定結(jié)果情況，流動(dòng)相 溶液PH值大概為3.2左右.考察結(jié)果見(jiàn)下表6。
[0070] 表6含量測(cè)定方法耐用性考察
[0072]取本品，分別用兩根不同的品牌的色譜柱，按該方法測(cè)定?；切苋パ跄懰岬暮?， 結(jié)果如下表7:
[0073]表7不同色譜柱間的耐用性
[0075]本發(fā)明方法應(yīng)用RID檢測(cè)器，反相高效液相色譜法，本方法靈敏度高、可靠性強(qiáng)，檢 測(cè)成本低，適用于牛磺熊去氧膽酸生產(chǎn)中任何一步中間體的考察，也適用于牛磺熊去氧膽 酸本身的質(zhì)量控制檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，所述有關(guān)物質(zhì)為?；蛆Z去 氧膽酸和熊去氧膽酸，其特征在于包括以下步驟： A、 取?；切苋パ跄懰?sigma對(duì)照品為已知對(duì)照品，用稀釋劑溶解成濃度為0.5mg/ml的 對(duì)照品溶液，取?；切苋パ跄懰針悠酚孟♂寗┤芙鉃闈舛葹椹?5ml/ml的對(duì)照品供試品溶 液； B、 分別取對(duì)照品溶液對(duì)照品供試品溶液各20ul注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中?；?熊去氧膽酸的峰面積，按照外標(biāo)法，以無(wú)水?；切苋パ跄懰醽?lái)計(jì)算HPLC含量，不小于99%; C、 取中檢所對(duì)照品?；蛆Z去氧膽酸、熊去氧膽酸，再用流動(dòng)相溶解成濃度為5ug/ml的 雜質(zhì)對(duì)照品溶液，取?；切苋パ跄懰針悠酚孟♂寗┤芙鉃闈舛葹椹?5mg/ml的樣品溶液； D、 分別取雜質(zhì)對(duì)照品溶液、樣品溶液各20ul注入液相色譜儀中，記錄色譜圖中?；蛆Z 去氧膽酸和熊去氧膽酸的峰面積，再按照外標(biāo)法計(jì)算?；切苋パ跄懰針悠分杏嘘P(guān)物質(zhì)的大 小，?；蛆Z去氧膽酸和熊去氧膽酸不超過(guò)I. %和〇. 5%。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在 于所述流動(dòng)相按以下方法制得:按O.lmol/L氯化銨水溶液：四氫呋喃：甲醇=5: 2:3的比例 混合后，用三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH為7.00。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征 在于所述的液相色譜儀中采用C4色譜柱，流速：1.〇 1111/1^11，柱溫:40°(：，檢測(cè)器采用示差折 光檢測(cè)器。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在 于所述的稀釋劑為流動(dòng)相。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述新的?；切苋パ跄懰岷恳约坝嘘P(guān)物質(zhì)的檢測(cè)方法，其特征在 于還包括有系統(tǒng)適應(yīng)性測(cè)定： 分別取約25mg?；切苋パ跄懰?，?；蛆Z去氧膽酸，熊去氧膽酸對(duì)照品用稀釋劑溶解，搖 勻并定容到50ml;取20ul進(jìn)樣記錄色譜圖各峰的分離度和理論塔板數(shù)，分離度的大小要不 小于1.5,理論踏板數(shù)不小于1500。
【文檔編號(hào)】G01N30/62GK105891351SQ201610192203
【公開(kāi)日】2016年8月24日
【申請(qǐng)日】2016年3月30日
【發(fā)明人】婁良
【申請(qǐng)人】中山百靈生物技術(shù)有限公司