一種七聯(lián)金標檢測卡及其的制備方法
【專利摘要】一種七聯(lián)金標檢測卡,本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于酵母重組表達自身抗原的新型自身抗體七聯(lián)金標檢測卡。為能迅速的給醫(yī)生提供綜合判斷依據(jù)，本發(fā)明提供一種金標檢測盒，所述的檢測盒包括有上殼體和下殼體，所述的下殼體內(nèi)設(shè)有檢測單元，所述的上殼體上設(shè)有觀測窗；所述的檢測單元包括有硝酸纖維素膜，設(shè)于硝酸纖維素膜上層前端的包被的金標墊，液體吸收墊，樣品墊，以及檢測帶。本發(fā)明的有益效果在于，通過對血清或血漿中的七種自身抗體的聯(lián)合檢測可提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、混合性結(jié)締組織病、肌炎/皮肌炎診斷的敏感性，更有利于全面分析病情所處的階段，對病情的分型、追蹤和預(yù)后判定有重要的意義。
【專利說明】
一種七聯(lián)金標檢測卡及其的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于酵母重組表達自身抗原的新型自身抗體七聯(lián)金標檢測卡。
【背景技術(shù)】
[0002]自身免疫性疾病是繼心血管疾病和癌癥后排位第三的最為常見的疾病，其總體發(fā)病率占世界人口的3%?5%，并且還在呈上升趨勢，而且自身免疫性疾病范圍廣，包括SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)、SS (干燥綜合癥)、混合性結(jié)締組織病(MCTD)、多發(fā)性肌炎/皮肌炎抗體(PM/DM)等，各種臨床癥狀存在著部分交迭，難以確立明確的判斷標準。
[0003]抗Sm抗體對SLE的診斷具有較高特異性，是目前公認的SLE的血清標志抗體，SmDl、SmB ’多肽是最常見的抗Sm特異性自身免疫應(yīng)答標靶，有利于SLE的早期診斷?？筍SA抗體又稱抗1?0抗體(&111:-1?03111:;[130(1168)，抗干燥綜合癥抗原4抗體，抗334抗體勒1抗原有521^)和60kD兩種核糖核酸蛋白。抗SSB抗體又稱抗La抗體(ant1-La antibodies)，抗干燥綜合癥抗原B抗體，抗SSA抗體和抗SSB抗體常常同時出現(xiàn)，同抗SSA抗體一樣，抗SSB抗體亦可引起新生兒狼瘡綜合癥(NLE)，在其他自身免疫性疾病中如出現(xiàn)抗SSB抗體，患者常伴有繼發(fā)性干燥綜合癥。抗Ul-snRNP抗體見于在混合性結(jié)締組織病(MCTD)患者，抗Ul-snRNP抗體也可在多種風(fēng)濕病中出現(xiàn)?？笿o-1抗體為多發(fā)性肌炎/皮肌炎抗體(PM/DM)的血清標志性抗體，且多數(shù)患者伴有間質(zhì)性肺疾病(ILD)和多關(guān)節(jié)炎或關(guān)節(jié)痛等，抗Jo-1抗體為多發(fā)性肌炎/皮肌炎抗體(PM/DM)的血清標志性抗體。
[0004]目前，國內(nèi)外用于自身抗體檢測采用的方法原理主要有間接免疫熒光法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法和膠體金法。間接免疫熒光需要技術(shù)熟練的技術(shù)人員進行操作，且耗時不能批量處理，化學(xué)發(fā)光需要專用分析儀，且價格昂貴，技術(shù)尚不夠成熟，酶聯(lián)免疫法大多采用96微孔板檢測，步驟繁瑣耗時，膠體金法操作簡單、使用方便、檢測速度快，同時由于各種臨床癥狀存在著部分交迭，而各自單獨診斷費用高昂，耗時大，難以給醫(yī)生提供綜合判斷依據(jù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述提到的問題，因此本發(fā)明使用七聯(lián)金標卡，所述的七聯(lián)金標卡能同時檢測七種自身抗體，即抗SmDl抗體、抗SmB’抗體、抗SSA52kD抗體、抗SSA60kD抗體、抗SSB抗體、抗U1-snRNP抗體、抗Jo-1抗體，不僅可以單獨檢測出系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、混合性結(jié)締組織病、肌炎/皮肌炎診斷的敏感性，綜合參考更有利于提高確診率。本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:
一種七聯(lián)金標檢測盒，所述的檢測盒包括有上殼體和下殼體，所述的下殼體內(nèi)設(shè)有兩個以上的檢測單元，所述的檢測單元并列排設(shè)下殼體內(nèi)。所述的上殼體上設(shè)有兩個以上分別與兩個以上所述的檢測單元配合使用的用于添加樣品的樣品孔和用于觀測檢測結(jié)果的觀測窗;所述的檢測單元包括有設(shè)于下殼體上隔離槽和設(shè)于隔離槽內(nèi)底層的抗原包被的硝酸纖維素膜，設(shè)于硝酸纖維素膜上層前端的包被的金標墊，設(shè)于硝酸纖維素膜上層后端的液體吸收墊，設(shè)于包被的金標墊上與樣品孔對應(yīng)位置的樣品墊，以及設(shè)于硝酸纖維素膜上層與觀測窗對應(yīng)的位置的對照帶和一條以上的檢測帶。
[0006]進一步的，所述的兩個以上檢測單元包含有用于檢測干燥綜合癥的干燥綜合癥檢測單元，所述的干燥綜合癥檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為SSA52kD抗原、SSB抗原和SSA60kD抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為SSA52kD抗原包被的檢測帶、SSB抗原包被檢測帶和SSA60kD抗原包被的檢測帶。
[0007]進一步的，所述的兩個以上檢測單元包含有用于檢測混合性結(jié)締組織病的混合性結(jié)締組織病檢測單元，所述的混合性結(jié)締組織病檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為Ul-snRNP抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為Ul-snRNP抗原包被的檢測帶。
[0008]進一步的，所述的兩個以上檢測單元包含有用于檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡的系統(tǒng)性紅斑狼瘡檢測單元，所述的混合性結(jié)締組織病檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為SmDl抗原和SmB’抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為SmDl抗原包被的檢測帶和SmB’抗原包被的檢測帶。
[0009]進一步的，所述的兩個以上檢測單元包含有用于檢測多發(fā)性肌炎/皮肌炎的多發(fā)性肌炎/皮肌炎檢測單元，所述的多發(fā)性肌炎/皮肌炎檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為Jo-1抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為Jo-1抗原包被的檢測帶。
[0010]進一步的，所述的對照帶為羊抗鼠IgG包被的對照帶。
[0011 ] 一種七聯(lián)金標檢測盒的制備方法，所述的制備方法包括如下步驟:
一、包被硝酸纖維素膜
1.1)配制包被液:將SmDl、SmB ’、SSA52、SSA60、SSB、Ul_snRNP及Jo-1抗原，以及羊抗鼠I gG分別配制成0.5mg/m I 一5mg/m I的包被液；
1.2)包被:將硝酸纖維膜裁成片，將1.1)中配置好的包被液包被在4條硝酸纖維膜上:一條硝酸纖維膜上包含SSA52KD、SSA60KD、SSB和羊抗鼠IgG包被液，一條硝酸纖維膜上包含Ul-snRNP和羊抗鼠IgG包被液，一條硝酸纖維膜包含SmDl、SmB ’和羊抗鼠IgG包被液，一條硝酸纖維膜上包含Jo-1和羊抗鼠IgG包被液；
1.3)干燥:將包被好的硝酸纖維膜條置于37°C恒溫干燥2個小時；
二、包被金標墊
2.1)標記鼠抗人IgG:制備膠體金標記的0.5mg/ml 一5mg/ml鼠抗人I gG;
2.2)包被:將包被的金標墊裁成膜片，將2.1)中配制好的溶液包被在包被的金標墊上；
2.3)干燥:將包被好的包被金標墊條置于37°(:恒溫干燥2個小時；
三、貼合
3.1、將干燥好的樣品墊、包被的金標墊、硝酸纖維素膜和液體吸收墊按次序依次組合后黏貼在PVC板上，制成檢測條；
四、切割
4.1)將(三)中貼好的檢測條和隔離槽配合使用的條帶；
五、組裝
5.1)將條帶序依次裝入隔離槽內(nèi)，合緊上殼和下殼。
[0012]一種七聯(lián)金標檢測盒的使用方法，包括如下步驟:往四個加樣孔中分別加入ΙΟΟμΙ待測樣本，15-20分鐘后從觀察窗中判斷結(jié)果，若檢測帶和對照帶均顯色，則表明樣本中含有檢測帶所包被抗原的特異性抗體;若檢測帶不顯色，僅對照帶顯色，則表明樣本中不包含檢測帶所包被抗原的特異性抗體或濃度未達到可檢測水平;若檢測帶和對照帶均不顯色，則表明檢測無效。
[0013]本發(fā)明的有益效果在于，通過對血清或血楽中的抗SmDI抗體、抗SmB ’抗體、抗SSA52抗體、抗SSA60抗體、抗SSB抗體、抗Ul-snRNP抗體、抗Jo-1抗體等七種自身抗體的聯(lián)合檢測可提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合癥、混合性結(jié)締組織病、肌炎/皮肌炎診斷的敏感性，更有利于全面分析病情所處的階段，對病情的分型、追蹤和預(yù)后判定有重要的意義。
【附圖說明】
[0014]附圖1為本發(fā)明檢測卡的簡單示意圖；
圖2為本發(fā)明的A-A向視圖。
【具體實施方式】
[0015]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步的說明。
[0016]實施例1
請參照圖1和圖2，一種七聯(lián)金標檢測盒，所述的檢測盒包括有上殼體和下殼體，所述的檢測盒包括有所述的下殼體內(nèi)設(shè)有4個檢測單元(1、2、3、4)，所述的上殼體上設(shè)有4個與所述的檢測單元(1、2、3、4)配合使用的用于添加樣品的樣品孔7和用于觀測檢測結(jié)果的觀測窗11;所述的檢測單元(1、2、3、4)包括有設(shè)于下殼體上隔離槽5和設(shè)于隔離槽5內(nèi)底層的抗原包被的硝酸纖維素膜10，設(shè)于硝酸纖維素膜10上層前端的包被的金標墊8，設(shè)于硝酸纖維素膜10上層后端的液體吸收墊9，設(shè)于包被的金標墊8上與樣品孔對應(yīng)位置的樣品墊7，以及設(shè)于硝酸纖維素膜10上層與觀測窗11對應(yīng)的位置的對照帶C和一條以上的檢測帶T。所述的4G個檢測單元包含有用于檢測干燥綜合癥的干燥綜合癥檢測單元I，所述的干燥綜合癥檢測單元I內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為SSA52kD抗原、SSB抗原和SSA60kD抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為SSA52kD抗原包被的檢測帶11、338抗原包被檢測帶12和334601^)抗原包被的檢測帶T3 ;用于檢測混合性結(jié)締組織病的混合性結(jié)締組織病檢測單元2，所述的混合性結(jié)締組織病檢測單元2內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為Ul-snRNP抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為Ul-snRNP抗原包被的檢測帶T4;用于檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡的系統(tǒng)性紅斑狼瘡檢測單元3，所述的混合性結(jié)締組織病檢測單元3內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為SmDl抗原和SmB’抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為SmDl抗原包被的檢測帶T5和SmB’抗原包被的檢測帶T6;用于檢測多發(fā)性肌炎/皮肌炎的多發(fā)性肌炎/皮肌炎檢測單元4，所述的多發(fā)性肌炎/皮肌炎檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為Jo-1抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為Jo-1抗原包被的檢測帶T7;所述的對照帶為羊抗鼠IgG包被的對照帶C。
[0017]實施例2
所述七聯(lián)金標檢測卡制備方法如下:
一、包被硝酸纖維素膜
I)配制包被液:將SmDl、SmB ’、SSA52、SSA60、SSB、U1RNP及Jo-1抗原，以及羊抗鼠IgG質(zhì)控配制成相應(yīng)的包被濃度，分別為0.5mg/ml、l mg/ml、1.5 mg/mU2 mg/ml、2.5 mg/ml、3mg/ml、3.5 mg/ml、4 mg/ml、4.5 mg/ml、5mg/ml;
2)包被抗原:根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將硝酸纖維膜裁成膜片，通過物理吸附和共價結(jié)合的方式，將I)中配置好的點樣溶液以一定的排列次序包被在膜片上，分別為包被有采用酵母重組表達的SmDl、SmB’抗原的一條樣品帶、包被有采用酵母重組表達的SSA52KD、SSA60KD、SSB抗原的一條樣品帶、包被采用酵母重組表達的有U1-snRNP的一條樣品帶、包被采用酵母重組表達的Jo-1的一條樣品帶，共計四條硝酸纖維素膜，形成獨立的檢測線；
3)干燥:將包被好的膜片條放入37°C恒溫干燥2個小時；
二、包被金標墊
1)標記鼠抗人IgG:制備膠體金標記的鼠抗人I gG;
2)包被:根據(jù)免疫印跡點樣器的大小，將金標墊裁成膜片，通過物理吸附的方式，將I)中配制好的溶液包被在墊上；
3)干燥:將包被好的金標墊條放入37°C恒溫干燥2個小時；
三、貼膜
1、將干燥好的NC膜(硝酸纖維素膜)、金標墊和樣品墊、液體吸收墊按照一定順序組合黏貼在雙面粘性的PVC板的正面，如圖2所不；
切割
將(三)中貼好的膜片按照獨立檢測線切成一定寬度的條帶；
五、組裝
I)將切割成單人份的小條按照次序裝于金標外殼，合緊金標上蓋。
[0018] 實施例3
檢測時，將檢測卡平放于實驗臺上，用滴管或加樣槍在四個加樣孔中分別加入ΙΟΟμΙ待測樣本，15-20分鐘后從觀察窗中判斷結(jié)果，若檢測帶和對照帶均顯色，則表明樣本中含有檢測帶所包被抗原的特異性抗體，若檢測帶不顯色，僅對照帶顯色，則表明樣本中不包含檢測帶所包被抗原的特異性抗體或濃度未達到可檢測水平，若檢測帶和對照帶均不顯色，則表明檢測無效。在實際的操作中，該檢測卡的效果非常好，和單獨檢測相比，節(jié)省了大量的時間和費用，而且能給醫(yī)生一個綜合的評價參考。
【主權(quán)項】
1.一種金標檢測盒，所述的檢測盒包括有上殼體和下殼體，其特征在于，所述的下殼體內(nèi)設(shè)有兩個以上的檢測單元，所述的上殼體上設(shè)有兩個以上分別與兩個以上所述的檢測單元配合使用的用于添加樣品的樣品孔和用于觀測檢測結(jié)果的觀測窗;所述的檢測單元包括有設(shè)于下殼體上隔離槽和設(shè)于隔離槽內(nèi)底層的抗原包被的硝酸纖維素膜，設(shè)于硝酸纖維素膜上層前端的包被的金標墊，設(shè)于硝酸纖維素膜上層后端的液體吸收墊，設(shè)于包被的金標墊上與樣品孔對應(yīng)位置的樣品墊，以及設(shè)于硝酸纖維素膜上層與觀測窗對應(yīng)的位置的對照帶和一條以上的檢測帶。2.如權(quán)利要求1所述的檢測盒，其特征在于，所述的兩個以上檢測單元包含有用于檢測干燥綜合癥的干燥綜合癥檢測單元，所述的干燥綜合癥檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為SSA52kD抗原、SSB抗原和SSA60kD抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為SSA52kD抗原包被的檢測帶、SSB抗原包被檢測帶和SSA60kD抗原包被的檢測帶。3.如權(quán)利要求1所述的檢測盒，其特征在于，所述的兩個以上檢測單元包含有用于檢測混合性結(jié)締組織病的混合性結(jié)締組織病檢測單元，所述的混合性結(jié)締組織病檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為Ul-snRNP抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為Ul-snRNP抗原包被的檢測帶。4.如權(quán)利要求1所述的檢測盒，其特征在于，所述的兩個以上檢測單元包含有用于檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡的系統(tǒng)性紅斑狼瘡檢測單元，所述的混合性結(jié)締組織病檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為SmDl抗原和SmB ’抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為SmDl抗原包被的檢測帶和SmB ’抗原包被的檢測帶。5.如權(quán)利要求1所述的檢測盒，其特征在于，所述的兩個以上檢測單元包含有用于檢測多發(fā)性肌炎/皮肌炎的多發(fā)性肌炎/皮肌炎檢測單元，所述的多發(fā)性肌炎/皮肌炎檢測單元內(nèi)的抗原包被的硝酸纖維素膜為Jo-1抗原包被的硝酸纖維素膜，相應(yīng)的檢測帶為Jo-1抗原包被的檢測帶。6.如權(quán)利要求1所述的檢測盒，其特征在于，所述的對照帶為羊抗鼠IgG包被的對照帶。7.—種七聯(lián)金標檢測盒的制備方法，其特征在于，所述的制備方法包括如下步驟: 一、包被硝酸纖維素膜 1.1)配制包被液:將SmDl、SmB ’、SSA52、SSA60、SSB、Ul_snRNP及Jo-1抗原，以及羊抗鼠I gG分別配制成0.5mg/ m I 一5mg/ m I的包被液； I.2)包被:將硝酸纖維膜裁成片，將1.1)中配置好的包被液包被在4條硝酸纖維膜上:一條硝酸纖維膜上包含SSA52KD、SSA60KD、SSB和羊抗鼠IgG包被液，一條硝酸纖維膜上包含Ul-snRNP和羊抗鼠IgG包被液，一條硝酸纖維膜包含SmDl、SmB ’和羊抗鼠IgG包被液，一條硝酸纖維膜上包含Jo-1和羊抗鼠IgG包被液； 1.3)干燥:將包被好的硝酸纖維膜條置于37°C恒溫干燥2個小時； 二、包被金標墊 2.1)標記鼠抗人IgG:制備膠體金標記的0.5mg/ml 一5mg/ml鼠抗人I gG; 2.2)包被:將包被的金標墊裁成膜片，將2.1)中配制好的溶液包被在包被的金標墊上； 2.3)干燥:將包被好的包被金標墊條置于37°C恒溫干燥2個小時； 三、貼合 3.1、將干燥好的樣品墊、包被的金標墊、硝酸纖維素膜和液體吸收墊按次序依次組合后黏貼在PVC板上，制成檢測條； 四、切割 4.1)將(三)中貼好的檢測條和隔離槽配合使用的條帶； 五、組裝 5.1)將條帶序依次裝入隔離槽內(nèi)，合緊上殼和下殼。8.—種七聯(lián)金標檢測盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟:往四個加樣孔中分別加入ΙΟΟμΙ待測樣本，15-20分鐘后從觀察窗中判斷結(jié)果，若檢測帶和對照帶均顯色，則表明樣本中含有檢測帶所包被抗原的特異性抗體;若檢測帶不顯色，僅對照帶顯色，則表明樣本中不包含檢測帶所包被抗原的特異性抗體或濃度未達到可檢測水平;若檢測帶和對照帶均不顯色，則表明檢測無效。
【文檔編號】G01N33/558GK105911276SQ201610542199
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年7月12日
【發(fā)明人】楊湘越, 王開宇, 馮福英, 廖劍, 趙猛, 陳敏, 蘭小鵬, 錢純亙, 王棟凱
【申請人】中國人民解放軍南京軍區(qū)福州總醫(yī)院, 深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司