鐵(ii)離子檢測(cè)劑以及使用其的檢測(cè)方法【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種能夠用熒光檢測(cè)快速且高靈敏度地檢測(cè)鐵(II)離子的鐵(II)離子檢測(cè)劑以及一種使用所述檢測(cè)劑的鐵(II)離子檢測(cè)方法。本發(fā)明涉及一種鐵(II)離子檢測(cè)劑，其通過(guò)組合具有至少三個(gè)配位位置的化合物和由通式(I)表示的化合物(熒光探針)形成(式中，R1和R2是低級(jí)烷基等；R3和R4是氫原子等；R5是氫原子、羥基或由式(A)：?NR51R52表示的基團(tuán)(式中，R51和R52是低級(jí)烷基等)；R6和R7是氫原子等；環(huán)A是芳環(huán)等；V是O或SiR10R11(R10和R11相同或不同，并且表示氫原子或低級(jí)烷基)；W是CH2、CO等；Z是O等；m和n相同或不同，并且是0或1)。本發(fā)明還涉及使用所述檢測(cè)劑的鐵(II)離子檢測(cè)方法?！緦?zhuān)利說(shuō)明】鐵（11)離子檢測(cè)劑以及使用其的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及一種Fe(II)離子檢測(cè)劑。具體地，本發(fā)明涉及一種能夠以高靈敏度選擇性測(cè)量在試管中或在活細(xì)胞中的Fe(II)離子的Fe(II)離子檢測(cè)劑?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]鐵是人體內(nèi)最豐富的過(guò)渡金屬物質(zhì)，并參與多種生命現(xiàn)象，包括呼吸系統(tǒng)的氧傳輸和電子轉(zhuǎn)移。然而，已提出鐵在體內(nèi)的異常水平與嚴(yán)重的疾病有關(guān)，例如癌癥、阿爾茨海默氏病和帕金森氏病。特別是，代表體內(nèi)大部分游離鐵離子的Fe(II)離子已被懷疑會(huì)導(dǎo)致石棉癌或丙型肝炎，因?yàn)樗鼈兙哂挟a(chǎn)生活性氧物質(zhì)的巨大潛勢(shì)（例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)1和2,以及非專(zhuān)利文獻(xiàn)1至5)。如果開(kāi)發(fā)出能夠在活細(xì)胞或活組織中選擇性檢測(cè)Fe(II)離子，并同時(shí)敏銳地檢測(cè)濃度變化的熒光探針，這將成為一種例如研究與Fe(II)離子相關(guān)的疾病和生命現(xiàn)象以及藥物開(kāi)發(fā)的極為重要的技術(shù)。[0003]近年來(lái)已經(jīng)見(jiàn)證了用于標(biāo)記生物分子、離子等的熒光探針的蓬勃發(fā)展。例如，已經(jīng)報(bào)道了許多具有作為骨架結(jié)構(gòu)的熒光團(tuán)（諸如熒光素和羅丹明）的熒光探針(例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)3和4以及非專(zhuān)利文獻(xiàn)6和7)。[0004]迄今為止報(bào)道的用于檢測(cè)鐵離子的熒光探針包括淬滅鐵離子檢測(cè)探針（例如，非專(zhuān)利文獻(xiàn)8和9)。然而，由于其對(duì)鐵離子的低檢測(cè)靈敏度或選擇性，難以使用該探針敏銳地檢測(cè)濃度變化。[0005]專(zhuān)利文獻(xiàn)5報(bào)道了用于測(cè)量鋁離子和/或鐵離子的熒光探針。然而，該探針的靶標(biāo)是Fe(III)離子，而不是Fe(II)離子。而且，該探針對(duì)金屬離子的選擇性不能令人滿(mǎn)意。[0006]為了解決上述問(wèn)題，專(zhuān)利文獻(xiàn)6報(bào)道了具有N-氧化物部分的Fe(II)離子檢測(cè)熒光探針(例如，RhoNox-1;參見(jiàn)圖1)。該熒光探針利用以下特點(diǎn)；即，N-氧化物部分與Fe(II)離子反應(yīng)，從而進(jìn)行脫氧反應(yīng)，由此增加熒光。該響應(yīng)于Fe(II)離子而產(chǎn)生熒光發(fā)射的熒光探針很有創(chuàng)意，與產(chǎn)生淬滅響應(yīng)的傳統(tǒng)熒光探針明顯不同。該熒光探針還對(duì)Fe(II)離子具有優(yōu)異的檢測(cè)靈敏度和選擇性。[0007]非專(zhuān)利文獻(xiàn)10至12報(bào)道了對(duì)專(zhuān)利文獻(xiàn)6所公開(kāi)的熒光探針（例如，RhoNox-1)進(jìn)行了改進(jìn)的熒光探針。具體地，專(zhuān)利文獻(xiàn)10至12的熒光探針是用羥基代替RhoNox-1的羅丹明骨架結(jié)構(gòu)中的羧基而得到的化合物(例如，圖1中的HMRhoNox-M和HMRhoNox-E)。[0008]引文列單[0009]專(zhuān)利文獻(xiàn)[0010]專(zhuān)利文獻(xiàn)1JP2011-79834A;[0011]專(zhuān)利文獻(xiàn)2:US2009/137612A;[0012]專(zhuān)利文獻(xiàn)3:W001/62755;[0013]專(zhuān)利文獻(xiàn)4:W099/01447;[0014]專(zhuān)利文獻(xiàn)5:JP2004-101389A;[0015]專(zhuān)利文獻(xiàn)6:JP2013-193990A。[0016]非專(zhuān)利文獻(xiàn)[0017]非專(zhuān)利文獻(xiàn)1:Bartzokis,G.etal.InvivoevaluationofbrainironinAlzheimer'sdiseaseandnormalsubjectsusingMRI.Biol.Psychiatry35,480-487(1994)；[0018]非專(zhuān)利文獻(xiàn)2:Cuajungco，M?P?etal?MetalchelationasapotentialtherapyforAlzheimer^disease.Ann.N.E.Acad.Sci.920:292-304(2000)；[0019]非專(zhuān)利文獻(xiàn)3:Dexter，D?T?etal?IncreasedNigralIronContentandAlterationsinOtherMetalIonsOccurringinBraininParkinson'sDisease.J.Neurochem.52，1830-1836(1989);[0020]非專(zhuān)利文南犬4:Toyokuni，S.ElucidationofAsbestos-inducedCarcinogenesisandItsApplicationtoPreventiondiagnosisandTreatmentinRelationtoIron.Japan.J.ofLungCancer49(4),362-367(2009)；[0021]非專(zhuān)利文獻(xiàn)5:NishinaS.，KorenagaM.，HidakaI?，ShinozakiA.，SakaiA.，GondoT.,TabuchiM.,KishiF.,HinoK.HepatitisCvirusproteinandironoverloadinducehepaticsteatosisthroughtheunfoldedproteinresponseinmice.LiverInt.30(5)683-92(2010)；[0022]非專(zhuān)利文南犬6:Kikuchi，K.，Komatsu，K.&Nagano，T.Zincsensingforcellularapplication.Currentopinioninchemicalbiology8，182-91(2004);[0023]非專(zhuān)利文獻(xiàn)7:Que，E.L.，Domaille，D.W.&Chang，C.J.Metalsinneurobiology:probingtheirchemistryandbiologywithmolecularimaging.Chemicalreviews108,1517-49(2008)；[0024]非專(zhuān)利文南犬8:Fakih，S.etal.Targetingthelysosome:fluorescentiron(III)chelatorstoselectivelymonitorendosomal/lysosomallabileironpools.Journalofmedicinalchemistry51,4539-52(2008)；[0025]非專(zhuān)利文獻(xiàn)9:Rauen，U.etal.AssessmentofChelatableMitochondrialIronbyUsingMitochondrion-SelectiveFluorescentIronIndicatorswithDifferentIron-BindingAffinities.ChemBioChem8,341-352(2007)；[0026]非專(zhuān)利文獻(xiàn)10:日本化學(xué)生物學(xué)會(huì)第八次年會(huì)(2013)學(xué)會(huì)概要集159頁(yè)；[0027]非專(zhuān)利文獻(xiàn)11:第七次生物相關(guān)化學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)(2013)學(xué)會(huì)概要集101頁(yè)；[0028]非專(zhuān)利文獻(xiàn)12:日本化學(xué)會(huì)第93次春季年會(huì)(2013)學(xué)會(huì)概要集，發(fā)表序號(hào)2E3-49?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0029]技術(shù)問(wèn)題[0030]專(zhuān)利文獻(xiàn)6報(bào)道了對(duì)Fe(II)離子具有優(yōu)異的檢測(cè)靈敏度和選擇性的熒光探針。然而，對(duì)Fe(II)離子的響應(yīng)速度不一定令人滿(mǎn)意。為了開(kāi)發(fā)探針在例如，臨床診斷、檢測(cè)試劑盒和自動(dòng)分析儀中的應(yīng)用，需要具有更快的熒光響應(yīng)性能的Fe(II)離子檢測(cè)劑。[0031]本發(fā)明的目的是提供一種能夠比專(zhuān)利文獻(xiàn)6中公開(kāi)的熒光探針更靈敏、更快速地?zé)晒鈾z測(cè)Fe(II)離子的Fe(II)離子檢測(cè)劑，并且提供一種使用該檢測(cè)劑的檢測(cè)方法。[0032]技術(shù)方案[0033]本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究以達(dá)到上述目的，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使氨基乙酸類(lèi)螯合化合物，例如氮川三乙酸(NTA)和乙二胺四乙酸(EDTA)與專(zhuān)利文獻(xiàn)6所公開(kāi)的Fe(II)離子選擇性熒光探針同時(shí)存在可顯著提高該Fe(II)離子熒光探針熒光響應(yīng)的響應(yīng)速度和對(duì)比度。更具體地，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，專(zhuān)利文獻(xiàn)6所公開(kāi)的熒光探針對(duì)Fe(II)離子的熒光響應(yīng)可更加靈敏。在上述發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上發(fā)明人進(jìn)行了進(jìn)一步研究，完成了本發(fā)明。[0034]本發(fā)明提供下述Fe(II)離子檢測(cè)劑。[0035]項(xiàng)目1[0036]-種Fe(II)離子檢測(cè)劑，包括與具有至少三個(gè)配位位置的化合物組合的由式（I)表示的化合物(熒光探針）：[0038]其中，R1和R2相同或不同，并且表示低級(jí)烷基、羧基低級(jí)烷基、芳基或芳基低級(jí)烷基；[0039]R3和R4相同或不同，并且表示氫、鹵素或低級(jí)烷基；[0040]R1和R2可與它們所連接的氮原子一起形成吡咯烷環(huán)、哌啶環(huán)、嗎啉環(huán)或任選取代的哌嗪環(huán)；[0041]R1和R3可一起形成三亞甲基；[0042]R2和R4可一起形成三亞甲基；[0043]R5表示氫、任選受保護(hù)的羥基、低級(jí)烷氧基或由式(A):-NR51R52表示的基團(tuán)，其中R51和R52相同或不同，并且表示低級(jí)烷基、羧基低級(jí)烷基、芳基或芳基低級(jí)烷基，或R51和R52可與它們所連接的氮原子一起形成吡咯烷環(huán)、哌啶環(huán)、嗎啉環(huán)或任選取代的哌嗪環(huán)；[0044]R6和R7相同或不同，并且表示氫、鹵素或低級(jí)烷基；[0045]當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R6可一起形成三亞甲基，或R52和R7可一起形成三亞甲基；[0046]環(huán)A表示任選取代的芳環(huán)或任選取代的雜芳環(huán)；[0047]V表示0或SiR1%11，其中，R1()和R11相同或不同，并且表示氫或低級(jí)烷基；[0048]W表示CH2、C0或S(0)P;[0049]Z表示0或NR9，其中R9表示氫或烷基；[0050]m和n相同或不同，并且表示0或1;以及[0051]p表示1或2。[0052]項(xiàng)目2[0053]根據(jù)項(xiàng)目1所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，所述具有至少三個(gè)配位位置的化合物具有相同或不同的至少三個(gè)配位位置，所述至少三個(gè)配位位置選自由氨基、羥基、羧基、膦酸基和含氮雜芳環(huán)組成的組。[0054]項(xiàng)目3[0055]根據(jù)項(xiàng)目1或2所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，所述具有至少三個(gè)配位位置的化合物是亞氨基二乙酸（IDA)、氮川三乙酸(階4)、叱叱1^少'-乙二胺四乙酸江0了4)、1，3-丙二胺四乙酸（PDTA)、二亞乙基三胺五乙酸（DTPA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)、1，2-二氨基環(huán)己烷四乙酸(CyDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(GEDTA或EGTA)、N，N-雙（2-羥基芐基）乙二胺二乙酸(HBED)、乙二胺二丙酸(EDDP)、乙二胺二乙酸(EDDA)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、1，3_二氨基-2-羥基丙烷四乙酸(DPTA-OH)、二羥乙基甘氨酸(DHEG)、六亞甲基二胺四乙酸（HDTA)、羥乙基亞氨基二乙酸（HIDA)、二氨基丙烷四乙酸（甲基-EDTA)、氮川三丙酸(NTP)、L-谷氨酸二乙酸(GLDA)、0,0'-雙-2-氨基苯基-N，N，N'，N'_四乙酸(BAPTA)、乙二胺四（亞甲基膦酸）（EDTP0)、氮川三(亞甲基膦酸）（NTP0)、羥基亞乙基二膦酸(HEDP)、膦?；⊥槿人?PBTC)、三(2-吡啶基甲基)胺(TPA)、二甲基吡啶胺(DPA)、鄰氨基苯酚-N，N，〇-三乙酸(APTRA)、卟啉或其衍生物、酞菁或其衍生物、1，4,7_三氮雜環(huán)壬烷(丁八〇~)、1，4,7，10-四氮雜環(huán)十二烷(0￥〇^"、1，4,8，11-四氮雜環(huán)十四烷(0￥〇^^)，或它們的鹽。[0056]項(xiàng)目4[0057]根據(jù)項(xiàng)目1至3中任一項(xiàng)所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，式（I)中的環(huán)A由式(a)表示：[0059]其中，R8表示任選受保護(hù)的羥基、低級(jí)烷氧基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧羰基、-N=C=〇、_N=C=S、磺基或活性酯基;q表示0、1、2或3;并且當(dāng)q是2或3時(shí)，R8可相同或不同。[0060]項(xiàng)目5[0061]根據(jù)項(xiàng)目1至4中任一項(xiàng)所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，[0062]R1和R2相同或不同，并且表示6烷基；[0063]R1和R2可與它們所連接的氮原子一起形成嗎啉環(huán)或任選取代的哌嗪環(huán)；[0064]R3和R4表示氫，或者[0065]R1和R3可一起形成三亞甲基；[0066]R2和R4可一起形成三亞甲基；[0067]R5表示任選受保護(hù)的羥基或由式(A):-NR51R52表示的基團(tuán)；當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R52相同或不同，并且表示烷基；[0068]R6和R7表示氫;或者[0069]R51和R6可一起形成三亞甲基；[0070]R52和R7可一起形成三亞甲基；[0071]q是0;W是CH2或C0;Z是0;m是0;并且n是0。[0072]項(xiàng)目6[0073]根據(jù)項(xiàng)目1至5中任一項(xiàng)所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，R1和R2相同或不同，并且表示烷基;R3和R4表示氫;R5表示任選受保護(hù)的羥基，或由式(A):_NR51R52表示的基團(tuán)，當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R52相同或不同，并且表示Cn烷基;R6和R7表示氫;q是0;W是CH2或CO;Z是0;m是0;并且n是0。[0074]項(xiàng)目7[0075]根據(jù)項(xiàng)目1至6中任一項(xiàng)所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，所述由式(I)表示的化合物(熒光探針)和所述具有至少三個(gè)配位位置的化合物混合在一起。[0076]項(xiàng)目8[0077]根據(jù)項(xiàng)目1至6中任一項(xiàng)所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，所述Fe(II)離子檢測(cè)劑是試劑盒的形式，該試劑盒包括容納所述由式（I)表示的化合物（熒光探針）的容器和容納所述具有至少三個(gè)配位位置的化合物的容器。[0078]項(xiàng)目9[0079]一種用于檢測(cè)Fe(II)離子的方法，所述方法包括以下步驟：[0080](1)使含有Fe(II)離子的樣品與根據(jù)項(xiàng)目1至8中任一項(xiàng)所述的鐵(II)離子檢測(cè)劑混合；以及[0081](2)測(cè)量所得到的混合物的熒光光譜。[0082]項(xiàng)目10[0083]一種用于增加Fe(II)離子檢測(cè)靈敏度的方法，所述方法包括以下步驟：[0084](1)使含有Fe(II)離子的樣品與根據(jù)項(xiàng)目1至8中任一項(xiàng)所述的鐵(II)離子檢測(cè)劑混合；以及[0085](2)測(cè)量所得到的混合物的熒光光譜。[0086]項(xiàng)目11[0087]一種用于制備Fe(II)離子檢測(cè)劑的方法，所述方法包括以下步驟：[0088]使由式(I)表示的化合物(熒光探針)與具有至少三個(gè)配位位置的化合物混合，[0090]其中，R1和R2相同或不同，并且表示低級(jí)烷基、羧基低級(jí)烷基、芳基或芳基低級(jí)烷基；[0091]R3和R4相同或不同，并且表示氫、鹵素或低級(jí)烷基；[0092]R1和R2可與它們所連接的氮原子一起形成吡咯烷環(huán)、哌啶環(huán)、嗎啉環(huán)或任選取代的哌嗪環(huán)；[0093]R1和R3可一起形成三亞甲基；[0094]R2和R4可一起形成三亞甲基；[0095]R5可以是氫、任選受保護(hù)的羥基、低級(jí)烷氧基或由式(A):-NR51R52表示的基團(tuán)，其中R51和R52相同或不同，并且表示低級(jí)烷基、羧基低級(jí)烷基、芳基或芳基低級(jí)烷基，或R51和R52可與它們所連接的氮原子一起形成吡咯烷環(huán)、哌啶環(huán)、嗎啉環(huán)或任選取代的哌嗪環(huán)；[0096]R6和R7相同或不同，并且表示氫、鹵素或低級(jí)烷基；[0097]當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R6可一起形成三亞甲基，或R52和R7可一起形成三亞甲基；[0098]環(huán)A表示任選取代的芳環(huán)或任選取代的雜芳環(huán)；[0099]V表示0或SiR1%11，其中，R1Q和R11相同或不同，并且表示氫或低級(jí)烷基；[0100]W表示CH2、C0或S(0)P;[0101]Z表示0或NR9，其中R9表示氫或烷基；[0102]m和n相同或不同，并且表示0或1;以及[0103]p表示1或2。[0104]本發(fā)明的有益效果[0105]根據(jù)本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑包括由式（I)表示的化合物（熒光探針)和具有至少三個(gè)配位位置的化合物。該檢測(cè)劑能夠比單獨(dú)的熒光探針更靈敏、更快速地?zé)晒鈾z測(cè)Fe(II)咼子。[0106]具體地，上述熒光探針選擇性地與Fe(II)離子反應(yīng)，N-氧化物被還原并轉(zhuǎn)變成氨基，從而發(fā)射出強(qiáng)的熒光。專(zhuān)利文獻(xiàn)6(JP2013-193990A)指出，已經(jīng)認(rèn)識(shí)到上述熒光探針對(duì)于已經(jīng)被螯合劑(例如2,2'_聯(lián)吡啶)穩(wěn)定的非活性Fe(II)離子是沒(méi)有響應(yīng)的(例如，專(zhuān)利文獻(xiàn)6第[0024]和[0098]段和圖7)。但是，與所預(yù)期的相反，已發(fā)現(xiàn)將具有至少三個(gè)配位位置的化合物加入上述熒光探針中使探針能夠以更高的靈敏度更快速地?zé)晒鈾z測(cè)Fe(II)離子。例如，單獨(dú)使用熒光探針測(cè)量所需一小時(shí)的時(shí)間段可以顯著縮短到約5至10分鐘（例如，測(cè)試?yán)?以及圖2的圖表(e)和(f))[0107]根據(jù)本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)方法僅是將廉價(jià)且容易獲得的具有至少三個(gè)配位位置的化合物（例如NTA(氮川三乙酸）和乙二胺四乙酸(EDTA))與熒光探針混合，并且該方法可通過(guò)非常簡(jiǎn)單的操作來(lái)執(zhí)行。因此，該方法是非常靈活的。[0108]根據(jù)本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑能夠用熒光顯微鏡等快速且高靈敏度地、選擇性且定量地檢測(cè)在試管或細(xì)胞中的Fe(II)離子的增加或減少。因此，該檢測(cè)劑在闡明與鐵相關(guān)的疾病的病理狀況的研究中是非常有用的。該檢測(cè)劑在需要快速檢測(cè)的多種情況(例如臨床實(shí)踐和藥物開(kāi)發(fā)）中也是非常有用的。[0109]另外，F(xiàn)e(II)離子在材料鐵發(fā)生腐蝕的初始階段起作用。因此，該檢測(cè)劑也可用于查明海洋船只等中鐵腐蝕機(jī)制的研究。更明確地，根據(jù)本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑不僅有助于醫(yī)療科學(xué)而且有助于材料科學(xué)?！靖綀D說(shuō)明】[0110]圖1:上部示出用于Fe(II)離子的含有N-氧化物的熒光探針?lè)肿咏Y(jié)構(gòu)，各自含有熒光團(tuán)RhoNox-1、羥甲基羅丹明（HMRhoNox-M、HMRhoNox-E)或羥甲基對(duì)甲氨基酚(HMFluNox-M、HMFluNox-E)。下部示出在本說(shuō)明書(shū)中使用的多齒配體化合物的結(jié)構(gòu)和名稱(chēng)。[0111]圖2:圖表(a)至(d)示出當(dāng)將硫酸亞鐵（II)加入到多齒配體化合物存在的RhoNox-1中時(shí)觀察到的熒光光譜的變化。圖表(a)示出不存在多齒配體化合物的情況下熒光光譜的變化，圖表(b)示出存在NTA的情況，圖表(c)示出存在EDTA的情況，以及圖表⑷示出存在TPA的情況。虛線(xiàn)表示不存在多齒配體化合物的情況下在1小時(shí)內(nèi)觀察到的熒光強(qiáng)度。圖表(e)示出在光譜變化中575nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化;灰色圓：不存在多齒配體化合物；實(shí)心正方形:NTA;實(shí)心三角:EDTA;實(shí)心圓：TPA。圖表(f)示出圖表(e)中從0秒到900秒的部分的放大圖。測(cè)量條件：測(cè)量用在50mMHEPES緩沖液（pH7.4)中的2福RhoNox-l、20yMFeSCk和200yM多齒配體化合物進(jìn)行。激發(fā)波長(zhǎng):540nm。[0112]圖3:圖表(a)和(b)示出當(dāng)將硫酸亞鐵(II)加入到NTA存在的HMRhoNox-M中時(shí)觀察到的熒光光譜的變化。圖表(a):不存在NTA。圖表(b):存在NTA。圖表(c)示出在光譜變化中575nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化;灰色圓：不存在NTA;實(shí)心圓：NTA。圖表(d)示出圖表(c)中從0秒到900秒的部分的放大圖。測(cè)量條件:測(cè)量用在50mMHEPES緩沖液(pH7.4)中的2yMHMRhoNox-M、20yMFeSCk和200yMNTA進(jìn)行。激發(fā)波長(zhǎng)：550nm。圖表（e)和（f)示出當(dāng)將硫酸亞鐵（II)加入到NTA存在的HMFluNox-M中時(shí)觀察到的熒光光譜的變化。圖表（e):不存在NTA;圖表(f):存在NTA。圖表(g)在光譜變化中535nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化;灰色圓：不存在NTA;實(shí)心圓圈：存在NTA。圖表(h)示出圖表(g)中從0秒到900秒的部分的放大圖。測(cè)量條件：測(cè)量用在50mMHEPES緩沖液（pH7.4)中的2yMHMFluNox-M、20yMFeSCk和200福NTA進(jìn)行。激發(fā)波長(zhǎng):520nm〇[0113]圖4:圖表(a)示出FluNox-1的結(jié)構(gòu)。圖表(b)至（e)示出通過(guò)將金屬化合物加入多齒配體化合物存在的FluNox-1中，并在30分鐘后用酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度而得到的結(jié)果。豎軸表示相對(duì)于標(biāo)記"1"的熒光強(qiáng)度值，標(biāo)記"1"表示當(dāng)僅加入熒光探針時(shí)(在圖中表示為"沒(méi)有金屬"）觀察到的熒光強(qiáng)度。在圖表（13)10六、（(：）抑^、（(1沾014和（6燈?4中，激發(fā)波長(zhǎng)是490nm，測(cè)量波長(zhǎng)是510nm至570nm。[0114]圖5:圖表(a)示出FluNox-2的結(jié)構(gòu)。圖表(b)至（e)示出通過(guò)將金屬化合物加入多齒配體化合物存在的FluNox-2中，并在30分鐘后用酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度而得到的結(jié)果。豎軸表示相對(duì)于標(biāo)記"1"的熒光強(qiáng)度值，標(biāo)記"1"表示當(dāng)僅加入熒光探針時(shí)(在圖中表示為"沒(méi)有金屬"）觀察到的熒光強(qiáng)度。在圖表（13)10六、（(：）抑^、（(1沾014和（6燈?4中，激發(fā)波長(zhǎng)是490nm，測(cè)量波長(zhǎng)是510nm至570nm。[0115]圖6:圖表(a)示出RhoNox-1的結(jié)構(gòu)。圖表(b)至（e)示出通過(guò)將金屬化合物加入多齒配體化合物存在的RhoNox-1中，并在30分鐘后用酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度而得到的結(jié)果。豎軸表示相對(duì)于標(biāo)記"1"的熒光強(qiáng)度值，標(biāo)記"1"表示當(dāng)僅加入熒光探針時(shí)(在圖中表示為"沒(méi)有金屬"）觀察到的熒光強(qiáng)度。在圖表（13)10六、（(：）抑^、（(1沾014和（6燈?4中，激發(fā)波長(zhǎng)是525nm，測(cè)量波長(zhǎng)是580至640nm。[0116]圖7:圖表(a)示出RhoNox-2的結(jié)構(gòu)。圖表(b)至（e)示出通過(guò)將金屬化合物加入多齒配體化合物存在的RhoNox-2中，并在30分鐘后用酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度而得到的結(jié)果。豎軸表示相對(duì)于標(biāo)記"1"的熒光強(qiáng)度值，標(biāo)記"1"表示當(dāng)僅加入熒光探針時(shí)(在圖中表示為"沒(méi)有金屬"）觀察到的熒光強(qiáng)度。在圖表（13)10六、（(：）抑^、（(1沾014和（6燈?4中，激發(fā)波長(zhǎng)是525nm，測(cè)量波長(zhǎng)是580至640nm。[0117]圖8:圖表(a)示出RhoNox-3的結(jié)構(gòu)。圖表(b)至（e)示出通過(guò)將金屬化合物加入多齒配體化合物存在的RhoNox-3中，并在30分鐘后用酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度而得到的結(jié)果。豎軸表示相對(duì)于標(biāo)記"1"的熒光強(qiáng)度值，標(biāo)記"1"表示當(dāng)僅加入熒光探針時(shí)(在圖中表示為"沒(méi)有金屬"）觀察到的熒光強(qiáng)度。在圖表（13)10六、（(：）抑^、（(1沾014和（6燈?4中，激發(fā)波長(zhǎng)是525nm，測(cè)量波長(zhǎng)是580至640nm。[0118]圖9:圖表(a)示出Si-RhoNox-1的結(jié)構(gòu)。圖表(b)示出通過(guò)將金屬化合物加入TPA存在的Si-RhoNox-1中，并在30分鐘后用酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度而得到的結(jié)果。豎軸表示相對(duì)于標(biāo)記"1"的熒光強(qiáng)度值，標(biāo)記"1"表示當(dāng)僅加入熒光探針時(shí)(在圖中表示為"沒(méi)有金屬"）觀察到的熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng):625nm，測(cè)量波長(zhǎng):660至720nm〇[0119]圖10:圖表(a)至(f)示出通過(guò)將硫酸亞鐵(II)加入多齒配體化合物存在的熒光探針中，并用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化而得到的結(jié)果。豎軸表示相對(duì)于標(biāo)記"1"的熒光強(qiáng)度值，標(biāo)記"1"表示當(dāng)僅加入熒光探針時(shí)觀察到的熒光強(qiáng)度。在圖表(a)FluNox-1、（b)FluNox_2、（c)RhoNox-l、（d)RhoNox_2、（e)RhoNox_3和（f)Si-RhoNox-l中，符號(hào)表示以下內(nèi)容：灰色圓：不存在多齒配體化合物；實(shí)心三角：IDA;實(shí)心正方形:NTA;實(shí)心圓：EDTA;實(shí)心倒三角：TPA。激發(fā)波長(zhǎng)：500nm(FluNox-l和FluNox-2)，530nm(RhoNox-l、RhoNox-2和RhoNox-3)和630nm(SiRhoNox_l)。測(cè)量波長(zhǎng)：530nm(FluNox_l和FluNox-2)，570nm(RhoNox_l、RhoNox_2和RhoNox-3)和665nm(SiRhoNox_l)?！揪唧w實(shí)施方式】[0120]在下文中更詳細(xì)地描述本發(fā)明。[0121]1、本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑[0122]本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑包括與具有至少三個(gè)配位位置的化合物(其在下文可稱(chēng)為"多齒配體化合物"）組合的由式(I)表示的化合物(熒光探針）。[0123](i)由式(I)表示的化合物(熒光探針）[0124]由式（I)表示的化合物（熒光探針)含有N-氧化物位點(diǎn)，其選擇性地與Fe(II)離子反應(yīng)從而轉(zhuǎn)變成氨基。因?yàn)樗a(chǎn)生的含氨基化合物發(fā)射強(qiáng)的熒光，所以由式(I)表示的化合物能夠高選擇性且高靈敏性地檢測(cè)Fe(II)(熒光特性）。因此，該化合物用作Fe(II)離子選擇性熒光探針。[0125]本發(fā)明檢測(cè)的目標(biāo)Fe(II)離子不僅包括游離的Fe(II)離子，而且包括含有與配體類(lèi)化合物(例如，檸檬酸、氨基酸和原卟啉IX)配位的Fe(II)離子的化合物。[0126]由R1、R2、R3、R4、R51、R52、R6或R7表示的"低級(jí)烷基"的實(shí)例包括直鏈或支鏈&―6烷基。具體實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、新戊基、正己基、異己基和3-甲基戊基。優(yōu)選的實(shí)例包括Cm烷基（即，甲基、乙基、正丙基和異丙基），并且更優(yōu)選的實(shí)例包括甲基和乙基。[0127]由R\R2、R51或R52表示的"羧基低級(jí)烷基"是由上述低級(jí)烷基的至少一個(gè)氫原子被羧基取代而形成的基團(tuán)。實(shí)例包括具有1至3個(gè)(特別是1個(gè))羧基的直鏈或支鏈烷基。具體實(shí)例包括羧甲基、2-羧乙基、3-羧丙基和4-羧丁基，優(yōu)選2-羧乙基。[0128]由R\R2、R51或R52表示的"芳基"的實(shí)例包括單環(huán)或雙環(huán)芳基。具體實(shí)例包括苯基、甲苯甲酰基(toluyl)、二甲苯基和萘基，優(yōu)選苯基。[0129]由R\R2、R51或R52表示的"芳基低級(jí)烷基"是由上述低級(jí)烷基的至少一個(gè)氫原子被芳基取代而形成的基團(tuán)。實(shí)例包括苯基-&-6烷基，例如芐基和苯乙基，優(yōu)選芐基。[0130]由R3、R4、R6或R7表示的"鹵素"的實(shí)例包括氟、氯、溴和碘。[0131]由R5表示的"低級(jí)烷氧基"的實(shí)例包括直鏈或支鏈Ch烷氧基。具體實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基、異丙氧基、正丁氧基、異丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、新戊氧基、正己氧基、異己氧基和3-甲基戊氧基。[0132]在由R5表示的"任選受保護(hù)的羥基"中的保護(hù)基團(tuán)的實(shí)例包括甲氧基甲基(M0M)、2_四氫吡喃基(THP)和乙酰基(Ac)。[0133]表述"R1和R2可與它們所連接的氮原子一起形成吡咯烷環(huán)、哌啶環(huán)、嗎啉環(huán)或任選取代的哌嗪環(huán)"是指由下式(其中R1和R2如上所限定)表示的基團(tuán)：[0135]優(yōu)選是由下式表示的基團(tuán)：[0137]其中X表示0、CH2或NR12,其中R12表示氫或烷基羰基。[0138]由R12表示的"烷基羰基"的實(shí)例包括C2-6烷基羰基。具體實(shí)例包括乙酰基、丙?；?、丁?；彤惗□；?。優(yōu)選的實(shí)例包括C2-3烷基羰基，例如乙酰基和丙?；⑶腋鼉?yōu)選的實(shí)例包括乙?；0139]表述"R1和R3可一起形成三亞甲基"（-CH2CH2CH2_;下文中同樣適用）和/或表述"R2和R4可一起形成三亞甲基"是指由下式(其中R1、R2、R3和R4如上所限定)表示的基團(tuán)：[0141]是由下式表示的基團(tuán)：[0143]其中R\R2、R3和R4如上所限定。[0144]當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R52可與它們所連接的氮原子一起形成吡咯烷環(huán)、哌啶環(huán)或嗎啉環(huán)。這是指由下式(其中R51和R52如上所限定)表示的基團(tuán)：[0146]優(yōu)選是由下式表示的基團(tuán)：[0148]其中Y表示0、CH2或NR13，其中R13表示氫或烷基羰基。[0149]由R13表示的"烷基羰基"的實(shí)例包括C2-6烷基羰基。具體實(shí)例包括乙?；⒈；⒍□；彤惗□；?。優(yōu)選的實(shí)例包括C2-3烷基羰基，例如乙?；捅；?。更優(yōu)選的實(shí)例包括乙?；?。[0150]當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R6可一起形成三亞甲基，和/或R52和R7可一起形成三亞甲基。這是指由下式(其中1?51、妒2、1?6、1?7和11如上所限定)表示的基團(tuán)：[0152]是由下式表示的基團(tuán)：[0154]其中R51、R52、R6和R7如上所限定。[0155]環(huán)A中"任選取代的芳環(huán)"的芳環(huán)的實(shí)例包括單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)芳環(huán)。具體實(shí)例包括苯環(huán)、萘環(huán)、蒽環(huán)和菲環(huán)。該芳環(huán)的取代基的實(shí)例包括任選受保護(hù)的羥基、低級(jí)烷氧基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧羰基、-N=C=0、-N=C=S、磺基和活性酯基。該芳環(huán)可具有1至3個(gè)這些取代基。[0156]環(huán)A中"任選取代的雜芳環(huán)"的雜芳環(huán)的實(shí)例包括含有選自由氧、氮和硫組成的組中的1至3個(gè)原子的單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)雜芳環(huán)。實(shí)例包括噻吩環(huán)、呋喃環(huán)、吡咯環(huán)、咪唑環(huán)、吡啶環(huán)、吡嗪環(huán)、嘧啶環(huán)、噠嗪環(huán)、吲哚環(huán)、喹啉環(huán)、異喹啉環(huán)、酞嗪環(huán)、萘啶環(huán)、喹喔啉環(huán)、喹唑啉環(huán)和吖啶環(huán)。該雜芳環(huán)的取代基的實(shí)例包括任選受保護(hù)的羥基、低級(jí)烷氧基、鹵素、羧基、低級(jí)燒氧羰基、4=0=0、4=0=3、磺基和活性酯基。該雜芳環(huán)可具有1至3個(gè)這些取代基。[0157]環(huán)A優(yōu)選由式(a)表示：[0159]其中R8表示任選受保護(hù)的羥基、低級(jí)烷氧基、鹵素、羧基、低級(jí)烷氧羰基、-N=C=〇、_N=C=S、磺基和活性酯基;q表示0、1、2或3;并且當(dāng)q是2或3時(shí)，兩個(gè)或三個(gè)R8可相同或不同。[0160]連接至環(huán)A(包括R8)的取代基"任選受保護(hù)的羥基"中的保護(hù)基的實(shí)例包括甲氧基甲基(M0M)、2_四氫吡喃基(THP)和乙酰基(Ac)。[0161]連接至環(huán)A(包括R8)的取代基"低級(jí)烷氧基"的實(shí)例包括直鏈或支鏈(^-6(特別是Cl-3)烷氧基。具體實(shí)例包括甲氧基、乙氧基、正丙氧基和異丙氧基。[0162]連接至環(huán)A(包括R8)的取代基"鹵素"的實(shí)例包括氟、氯、溴和碘。[0163]連接至環(huán)A(包括R8)的取代基"低級(jí)烷氧羰基"的實(shí)例包括直鏈或支鏈(&-6烷氧）羰基，例如甲氧羰基、乙氧羰基、正丙氧羰基、異丙氧羰基和叔丁氧羰基。[0164]連接至環(huán)A(包括R8)的取代基活性酯基是其中羧基(-C00H)被高度反應(yīng)性的活性酯基取代的基團(tuán)。實(shí)例包括用N-羥基琥珀酰亞胺得到的活性酯基(例如，-C(=0)0Su:Su是琥珀酰亞胺基）、將羧酸轉(zhuǎn)變成混合酸酐而形成的基團(tuán)（例如，_C(=0)0C(=0)R:1?是&-6燒基），以及使用CDI得到的咪唑?；╥midazolide)(例如，-C(=0)-Im:Im是1-咪唑基）。[0165]在式(a)中，q優(yōu)選為0、1或2,更優(yōu)選0或1，并且特別更優(yōu)選0。當(dāng)q是1時(shí)，R8鍵合至苯環(huán)的鍵合位點(diǎn)優(yōu)選如下所示：[0167]其中R8、W和Z如上所限定。[0168]W是CH2、C0或S(0)P，優(yōu)選CH2或⑶，更優(yōu)選C0。[0169]Z是0或NR9,其中R9是氫或烷基，并且Z優(yōu)選0。[0170]由R9表示的烷基的實(shí)例包括直鏈或支鏈Ch烷基，并且具體實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基和異丙基。[0171]m是0或1，并且優(yōu)選0。[0172]n是0或1，并且優(yōu)選0。[0173]p是1或2,并且優(yōu)選2。[0174]由式（I)表示的化合物的優(yōu)選實(shí)例包括如下化合物，在這些化合物中，R1和R2相同或不同，并且表示Cm烷基;R1和R2可與它們所連接的氮原子一起形成嗎啉環(huán)或任選取代的哌嗪環(huán)(優(yōu)選任選取代的哌嗪環(huán)，并且更優(yōu)選烷基羰基取代的哌嗪環(huán)）；R3和R4是氫，或者R1和R3可一起形成三亞甲基;R2和R4可一起形成三亞甲基;R5可以是任選受保護(hù)的羥基或由式(A):-NR51R52表示的基團(tuán)；當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R52相同或不同，并且表示烷基;R6和R7表示氫，或者R51和R6可一起形成三亞甲基;R52和R7可一起形成三亞甲基;q是0;W是CH2或CO;Z是0;m是0以及n是0。[0175]由式（I)表示的化合物的更優(yōu)選實(shí)例包括如下化合物，在這些化合物中，R1和R2相同或不同，并且表示&-6烷基;R3和R4是氫，或者R1和R3可一起形成三亞甲基;R2和R4可一起形成三亞甲基;R5可以是任選受保護(hù)的羥基或由式(A):-NR51R52表示的基團(tuán)；當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R52相同或不同，并且表示烷基;R6和R7表示氫，或者R51和R6可一起形成三亞甲基;R52和R7可一起形成三亞甲基;q是0;W是CH2或CO;Z是0;m是0以及n是0。[0176]本發(fā)明中化合物的更加優(yōu)選的實(shí)例包括由式（I)表示的化合物，其中，R1和R2相同或不同，并且表示Ch烷基;R3和R4是氫;R5可以是任選受保護(hù)的羥基或由式(A):-NR51R52表示的基團(tuán)；當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R51和R52相同或不同，并且表示烷基;R6和R7是氛;R8是氛;q是〇;W是CH2或C0;Z是0;m是0以及n是0。[0177]本發(fā)明中化合物的更加特別優(yōu)選的實(shí)例包括由式(IA)表示的化合物，[0179]其中W'表示CH2或C0;并且R1、R2、R3、R4、R51、R52、R6、R7和V如上所限定。[0180]V是0或SiR1QRn，并且優(yōu)選和R11相同或不同，并且表示氫或低級(jí)烷基，優(yōu)選低級(jí)烷基。R1()或R11的低級(jí)烷基的實(shí)例包括直鏈或支鏈烷基、優(yōu)選Ch烷基。具體實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基和異丙基。[0181]在這些化合物中，特別優(yōu)選的化合物是其中V是0;妒、1?2、1?51和R52相同或不同，并且表示&-3烷基(更優(yōu)選甲基或乙基，特別是更優(yōu)選乙基）；并且R3、R2、R6和R7是氫的那些化合物。[0182]在由式（I)表示的化合物中，當(dāng)基團(tuán)R5包含給電子原子時(shí)，例如氮和氧，（例如，_NR51R52和羥基），咕噸骨架結(jié)構(gòu)中苯環(huán)共輒體系中的雙鍵因?yàn)榻o電子效應(yīng)而可以移位，從而形成環(huán)打開(kāi)的化合物。例如，當(dāng)基團(tuán)R5是_NR51R52時(shí)，環(huán)打開(kāi)，從而產(chǎn)生由式（la)表示的化合物：[0184]其中1^、1?2、1?3、1?4、1?5、1?6、1?7、1?8丄胃、2、環(huán)八、111和11如上所限定。作為另一個(gè)實(shí)例，當(dāng)基團(tuán)R5是羥基時(shí)，環(huán)打開(kāi)，從而產(chǎn)生由式(lb)表示的化合物：[0186]其中妒、1?2、1?3、1?4、1?5、1?6、1?7、1?8丄胃、2、環(huán)八、111和11如上所限定。[0187]當(dāng)由式(I)表示的化合物和/或由式（la)表示的化合物溶解在介質(zhì)(溶劑）中時(shí)，由式（I)表示的化合物和由式（la)表示的化合物通常處于平衡狀態(tài)。平衡點(diǎn)因介質(zhì)（溶劑）的極性、pH或其他因素而改變。因此，在本說(shuō)明書(shū)中，由式(I)表示的化合物和由式(la)表示的化合物統(tǒng)稱(chēng)為"由式(I)表示的化合物"。[0188]由式(I)表示的化合物例如可通過(guò)下述方法制備。[0190]其中妒、護(hù)、1?3、1?4、1?5、1?6、礦、1?8、￥、￥、2、環(huán)4、111和11如上所限定。[0191]由式(II)表示的化合物容易獲得，或者通過(guò)或參考已知的方法制備。[0192]在由式(II)表示的化合物中，其中W是C=0的化合物可商購(gòu)，或可通過(guò)或參考例如Bioorg.Med.Chem.17(2009)6952-6958,Org.Lett.12(2007)496-499,Org.Lett.13(2010),6354-6357,Tetrahedron61(2005)3097-3105中公開(kāi)的方法制備。[0193]在由式（II)表示的化合物中，其中W是CH2的化合物可通過(guò)或參考例如OrganicLetters2010,12,3219-21，J.Am.Chem.Soc.2011,133,12960-3中公開(kāi)的方法制備。[0194]由式（I)表示的化合物可通過(guò)使由式（II)表示的化合物氧化（用于氧化氮原子的反應(yīng))來(lái)制備。例如，由式(I)表示的化合物可通過(guò)或參考專(zhuān)利文獻(xiàn)6中公開(kāi)的方法來(lái)制備。[0195]因?yàn)楣緡嵐羌芙Y(jié)構(gòu)中苯環(huán)共輒體系中的雙鍵由于與R1和R2連接的氮原子的給電子效應(yīng)而移位，從而打開(kāi)環(huán)，所以作為起始原料的由式(II)表示的化合物可轉(zhuǎn)變成由式(Ila)表示的化合物：[0197]其中妒、護(hù)、1?3、1?4、1?5、1?6、礦、1?8、￥、1、2、環(huán)4、111和11如上所限定。[0198]該化合物通常發(fā)射強(qiáng)的熒光。當(dāng)由式(II)表示的化合物和/或由式(Ila)表示的化合物溶解在介質(zhì)(溶劑）中時(shí)，由式（II)表示的化合物和由式（IIa)表示的化合物通常處于平衡狀態(tài)。平衡點(diǎn)因介質(zhì)（溶劑）的極性、pH或其他因素而改變。因此，在本說(shuō)明書(shū)中，由式(II)表不的化合物和由式（IIa)表不的化合物統(tǒng)稱(chēng)為"由式（II)表不的化合物"。[0199](ii)具有至少三個(gè)配位位置的化合物[0200]具有至少三個(gè)配位位置的化合物（多齒配體化合物）的實(shí)例包括具有相同或不同的至少三個(gè)配位位置的化合物，所述至少三個(gè)配位位置選自由氨基、羥基、醚(-〇-)、羧基、膦酸基和含氮雜芳環(huán)組成的組。[0201]如本文中所使用，"氨基"是指含有具有sp3雜化軌道的氮原子的部分。[0202]上述"含氮雜芳環(huán)"是指具有連接至其上的1至3個(gè)氮原子的雜芳環(huán)的部分(例如，吡啶環(huán)、咪唑環(huán)和吡咯環(huán)）。含氮雜芳環(huán)可任選具有1至3個(gè)取代基(例如，芳基，諸如苯基、甲苯甲?；?、二甲苯基和三甲苯基;和烷基，諸如甲基和乙基）。[0203]在上述配位位置中，優(yōu)選氨基、羧基、膦酸基和含氮雜芳環(huán)（例如，吡啶環(huán)和吡咯環(huán)）。更優(yōu)選氨基、羧基和吡啶環(huán)。還更優(yōu)選氨基和吡啶環(huán)。化合物中配位位置的數(shù)量通常是3至16,優(yōu)選4至12,更優(yōu)選4至10,并且還更優(yōu)選4至5。[0204]當(dāng)具有至少三個(gè)配位位置的化合物含有氮原子時(shí)，配位位置的數(shù)量?jī)?yōu)選在5以?xún)?nèi)。[0205]當(dāng)具有至少三個(gè)配位位置的化合物含有吡啶環(huán)時(shí)，配位位置的數(shù)量?jī)?yōu)選在3以?xún)?nèi)。[0206]似乎上述具有至少三個(gè)配位位置的化合物與Fe(II)離子快速形成絡(luò)合物，并且該絡(luò)合物與由式(I)表示的化合物(熒光探針)發(fā)生反應(yīng)，從而有利于N-氧化物的還原反應(yīng)(脫氧）。鑒于這種反應(yīng)機(jī)理，當(dāng)具有至少三個(gè)配位位置的化合物與Fe(II)離子形成絡(luò)合物時(shí)，優(yōu)選該化合物形成可與熒光探針?lè)磻?yīng)的空配位點(diǎn)。[0207]具有至少三個(gè)配位位置的化合物的具體實(shí)例包括氨基羧酸化合物，諸如亞氨基二乙酸（IDA)、氮川三乙酸（NTA)、N，N，N'，N'_乙二胺四乙酸（EDTA)、1，3-丙二胺四乙酸(PDTA)、二亞乙基三胺五乙酸（DTPA)、羥乙基乙二胺三乙酸（HEDTA)、三亞乙基四胺六乙酸(TTHA)、1，2-二氨基環(huán)己烷四乙酸（CyDTA)、乙二醇醚二胺四乙酸(GEDTA或EGTA)、N，N-雙(2-羥基芐基）乙二胺二乙酸(HBED)、乙二胺二丙酸(EDDP)、乙二胺二乙酸(EDDA)、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、1，3_二氨基-2-羥基丙烷四乙酸(DPTA-OH)、二羥乙基甘氨酸(DHEG)、六亞甲基二胺四乙酸(HDTA)、羥乙基亞氨基二乙酸(HIDA)、二氨基丙烷四乙酸（甲基-EDTA)、氮川三丙酸(NTP)、L-谷氨酸二乙酸(GLDA)、0,0'_雙-2-氨基苯基-N，N，N'，N'_四乙酸(BAPTA)和〇-氨基苯酚-N，N，0-三乙酸(APTRA);膦酸化合物，諸如乙二胺四（亞甲基膦酸）（EDTP0)、氮川三（亞甲基膦酸）（NTP0)、羥基亞乙基二膦酸(HEDP)和膦?；⊥槿人?PBTC);吡啶基甲基胺化合物，諸如三(2-吡啶基甲基)胺(TPA)和二甲基吡啶胺(DPA);環(huán)多胺化合物，諸如1，4,7-三氮雜環(huán)壬烷(了六0?、1，4,7，10_四氮雜環(huán)十二烷(0￥0^)和1，4,8，11-四氮雜環(huán)十四烷(CYCLAM);卟啉及其衍生物;原卟啉IX及其衍生物;酞菁及其衍生物;環(huán)聚吡咯衍生物；以及這些化合物的鹽。其中，優(yōu)選的實(shí)例包括吡啶基甲基胺化合物和氨基羧酸化合物，更優(yōu)選的實(shí)例包括吡啶基甲基胺化合物。[0208]具有至少三個(gè)配位位置的化合物的鹽的實(shí)例包括堿金屬鹽(例如，鋰鹽、鈉鹽和鉀鹽）、堿土金屬鹽(例如，鈣鹽）、銨鹽和四烷基銨鹽。特別是，當(dāng)該化合物含有羧酸時(shí)，優(yōu)選堿金屬鹽(鈉鹽）。[0209](iii)Fe(II)離子檢測(cè)劑[0210]根據(jù)本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑包括與具有至少三個(gè)配位位置的化合物（多齒配體化合物)組合的由式(I)表示的化合物(熒光探針）。[0211]根據(jù)本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑沒(méi)有特別限制，只要該檢測(cè)劑包括上述兩種組分，并且該檢測(cè)劑可以是多種形式。實(shí)例包括由式(I)表示的化合物(熒光探針)與具有至少三個(gè)配位位置的化合物（多齒配體化合物）的混合物形式的檢測(cè)劑(例如，組合物和組合試劑），和各自容納在單獨(dú)容器中的獨(dú)立組分形式的檢測(cè)劑(例如，試劑盒）?；旌衔镄问降臋z測(cè)劑還包括固體形式(例如，粉末和晶體）的檢測(cè)劑以及通過(guò)將組分溶解或分散在介質(zhì)（例如，水和緩沖液）中而得到的溶液或分散體形式的檢測(cè)劑。各自容納在單獨(dú)容器中的獨(dú)立組分形式的檢測(cè)劑也可以是單獨(dú)的固體形式或通過(guò)將組分溶解或分散在介質(zhì)（例如，水和緩沖液)中而得到的單獨(dú)的溶液或分散體形式。[0212]2、檢測(cè)Fe(II)離子的方法[0213]根據(jù)本發(fā)明的測(cè)量(或檢測(cè))Fe(II)離子的方法包括以下步驟：（1)使含有Fe(II)離子的樣品與根據(jù)本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑混合；以及(2)測(cè)量所得到的混合物的熒光光譜。具體地，F(xiàn)e(II)離子可通過(guò)以下步驟來(lái)測(cè)量:在合適的緩沖液中混合含有Fe(II)離子的樣品和本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑，溫育該混合物，然后用激發(fā)光照射該溫育的混合物來(lái)測(cè)量熒光。[0214]使用的緩沖液沒(méi)有特別限制，其實(shí)例包括已知的緩沖液，例如HEPES緩沖液液(pH7.4)〇[0215]緩沖液中由式⑴表示的化合物（焚光探針）的濃度沒(méi)有特別限制，通常為約O.luM至ImM，優(yōu)選約lyM至0.1mM，并且更優(yōu)選約5yM至20yM。緩沖液中具有至少三個(gè)配位位置的化合物（多齒配體化合物）的濃度也沒(méi)有特別限制，通常為約0.lyM至10mM，優(yōu)選約lyM至ImM，并且更優(yōu)選約10yM至500yM。[0216]在緩沖液中，對(duì)于每摩爾由式(I)表示的化合物(熒光探針），具有至少三個(gè)配位位置的化合物(多齒配體化合物)通常以約1至1000摩爾的量，優(yōu)選約1〇至1〇〇摩爾的量存在。[0217]溫育的溫度和時(shí)間段沒(méi)有特別限制。例如，溫育可以在約0至40°C下進(jìn)行約10分鐘至2小時(shí)。當(dāng)樣品是細(xì)胞或組織時(shí)，優(yōu)選施加適于培養(yǎng)的溫度(例如，對(duì)于人類(lèi)來(lái)源的細(xì)胞或組織來(lái)講是37°C)。[0218]熒光可使用商購(gòu)的熒光計(jì)來(lái)測(cè)量。Fe(II)離子在細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)可使用已知的技術(shù)進(jìn)行觀察來(lái)研究，諸如焚光顯微鏡和共聚焦激光掃描焚光顯微鏡。[0219]與使用專(zhuān)利文獻(xiàn)6所公開(kāi)的熒光探針相比，使用根據(jù)本發(fā)明的方法可以更靈敏和更快速地?zé)晒鈾z測(cè)Fe(II)離子。[0220]實(shí)施例[0221]下述實(shí)施例詳細(xì)描述了本發(fā)明。但是，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。[0222]下述實(shí)施例使用硅膠柱色譜法或氧化鋁色譜法來(lái)純化化合物，并且使用薄層色譜法(TLC)、ESI-MS(JEOLJMS-T100TD)JH-NMR或13C-NMR(JE0LECA-500光譜儀)來(lái)鑒定化合物。[0223]實(shí)施例1[0224]根據(jù)專(zhuān)利文獻(xiàn)6中公開(kāi)的方法合成3'-(二乙氨基)-N，N_二乙基-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'-咕噸]-6'-胺氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"RhoNox-1"）。[0225]實(shí)施例2[0226](1)以如下所述方法合成3'-(二甲氨基)-N，N_二甲基-3H-螺[異苯并呋喃_1，9'_咕噸]-6'-胺氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"HMRhoNox-M"或"RhoNox-2"）。[0227]根據(jù)例如OrganicLetters2010，12,3219-21，J.Am.Chem.Soc.2011，133，12960-3中公開(kāi)的方法合成前體化合物N3'，N3'，N6'，N6'-四甲基-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'_咕噸]-3'，6'_二胺。將90mg(0.24mmol)N3'，N3'，N6'，N6'-四甲基-3H-螺[異苯并呋喃-1,9'-咕噸]_3'，6'_二胺在攪拌下溶解在18mL乙酸乙酯中并冷卻至0°C。將83mg(0.48mmol)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中，并且使上述混合物回到室溫下，隨后攪拌1小時(shí)。減壓蒸餾除去溶劑，并通過(guò)氧化鋁柱色譜法（氯仿：甲醇=50:1至20:1)純化得到的殘余物，由此得到無(wú)色粉末HMRhoNox-M(64mg，產(chǎn)率71%)。[0228]NMR(400MHz，CDCl3)S:7.91(d，J=2.3Hz，lH)，7.44(dd，J=8.6Hz，2.3Hz，lH)，7.37(m，2H)，7.26(m，lH)，7.04(d，J=8.6Hz，lH)，6.90(d，J=7.4Hz，lH)，6.80(d，J=6.9Hz，lH)，6.46(m，2H)，5.30(dd，J=20.0Hz，12.6Hz，2H)，3.58(d，J=4.0Hz，6H)，2.97(s，6H)〇[0229]13CNMR(MHz，CDC13)S:154.5,151.5,151.3,150.9,144.5,139.1,129.9,129.2，128.4,128.2,128.2,125.7,123.8,120.7，114.2，111.7,109.2,109.0，98.5,83.3,72.1，63.2,63.1,40.3〇[0230]HRMS(ESI+):m/zC24H25N2〇3+計(jì)算值：389.I860,實(shí)測(cè)值：389.1871。[0231](2)以如下所述方法合成3'-(二乙氨基)-N，N-二乙基-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'_咕噸]-6'-胺氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"HMRhoNox-E"）。[0232]根據(jù)例如OrganicLetters2010，12,3219-21，J.Am.Chem.Soc.2011，133，12960-3中公開(kāi)的方法合成前體化合物N3'，N3'，N6'，N6'-四乙基-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'_咕噸]_3'，6'_二胺。將267mg(0.62mmol)N3'，N3'，N6'，N6'-四乙基-3H-螺[異苯并呋喃-1,9'-咕噸]_3'，6'-二胺在攪拌下溶解在20mL乙酸乙酯中并冷卻至0°C。將214mg(1.24mmo1)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中，并且使上述混合物回到室溫下，隨后攪拌1小時(shí)。減壓蒸餾除去溶劑，并通過(guò)氧化鋁柱色譜法（氯仿：甲醇=20:1至10:1)純化得到的殘余物，由此得到淺紫色粉末HMRhoNox-E(145mg，產(chǎn)率53%)。[0233]4NMR(500MHz，CDCl3)S:7.78(d，J=1.9Hz，lH)，7.37(m，2H)，7.28(m，2H)，7.03(d,J=8.7Hz,lH),6.92(d,J=7.7Hz,lH),6.77(d,J=8.7Hz,lH),6.42(m,4H),5.29(dd,J=16.4Hz，12.6Hz，2H)，3.70(m,4H)，3.35(q，J=7.1Hz，4H)，1.16(q，J=6.6Hz，12H)。[0234]13C匪R(125MHz，CDC13)S:151?7，151?0，149?0，148?8，144?4，139?2，129?6，129.4,128.3,128.1,125.5,123.8,120.6,115.5,111.1,110.7,108.5,97.5,83.3,71.9,66.9,44.4,12.5,8.3〇[0235]HRMS(ESI+):m/zC28H33N203+計(jì)算值:445.2486,實(shí)測(cè)值:445.2501。[0236](3)以如下所述方法合成3'-羥基-N，N_二甲基-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'_咕噸]-6'_胺氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"HMFluNox-M"）。[0237]根據(jù)例如OrganicLetters2010，12,3219-21，J.Am.Chem.Soc.2011，133，12960-3中公開(kāi)的方法合成前體化合物3'-(二甲氨基)-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'_咕噸]-6'-醇。將34mg(0?098mmol)3'-(二甲氨基)-3H-螺[異苯并咲喃-1，9'-咕噸]-6'-醇在攪拌下溶解在4mL乙酸乙酯中并冷卻至0°C。將34mg(0.20mmol)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中，并且使上述混合物回到室溫下，隨后攪拌1小時(shí)。減壓蒸餾除去溶劑，并通過(guò)氧化鋁柱色譜法(氯仿：甲醇=10:1至8:1)純化得到的殘余物，由此得到無(wú)色粉末HMFluNox-M(21mg，產(chǎn)率58%)。[0238]咕NMR(400MHz，CDC13)S:8.47(s，1H)，7.28(s，2H)，7.18-7.17(111，1H)，7.ll(d，J=2.8Hz,lH),6.93(s,2H),6.83(d,J=8.0Hz,1H),6.67(d,J=8.8Hz,lH),6.48(dd,J=8.8Hz,2.4Hz,1H)5.24,(m,2H),3.52(s,6H)〇[0239]13C匪R(400MHz，CDC13)S:159.8,153.7,151.5,151.0,144.4,139.0,129.9,129.4,128.4,128.2,126.1，124.0,120.6,113.7,113.4,112.8,110.5,103.1，83.3,72.1，63.1,62.2〇[0240]HRMS(ESI+):m/zC22H2〇N〇4+計(jì)算值：362.1387,實(shí)測(cè)值：362.1389。[0241](4)以如下所述方法合成3'-羥基-N，N-二乙基-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'_咕噸]-6'-胺氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"HMFluNox-E"）。[0242]根據(jù)例如OrganicLetters2010，12,3219-21，J.Am.Chem.Soc.2011，133，12960-3中公開(kāi)的方法合成前體化合物3'-(二乙氨基)-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'-咕噸]-6'-醇。將10011^(0.27111111〇1)3'-(二乙氨基)-311-螺[異苯并呋喃-1，9'-咕噸]-6'-醇在攪拌下溶解在10mL乙酸乙酯中并冷卻至0°C。將93mg(0.54mmol)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中，并且使上述混合物回到室溫下，隨后攪拌1小時(shí)。減壓蒸餾除去溶劑，并通過(guò)氧化鋁柱色譜法(氯仿：甲醇=20:1至10:1)純化得到的殘余物，由此得到無(wú)色粉末HMFluNox-E(102mg，產(chǎn)率97%)。[0243]4NMR(400MHz，CDCl3)S:7.72(d，J=2.4Hz，lH)，7.33(m，3H)，7.19(t，J=7.5Hz，1H)，7.02(d，J=9.2Hz，lH)，6.72(d，J=8.7Hz，2H)，6.55(d，J=2.4Hz，lH)，6.46(dd，J=8?7Hz，2?4Hz，1H)，5?24(s，1H)，3?76(m，2H)，3?56(m，1H)，1?01(m，6H)。[0244]13C匪R(100MHz，CDC13)S:158.8,151.1,150.1,148.3,144.6,138.7,130.0，129.8.128.3.126.0.123.2.120.8.115.8.115.2.112.2.110.8.101.7，83.3,72.2,66.4，29.3.22.2.13.0.7.22〇[0245]HRMS(ESI+):m/zC24H24NO/計(jì)算值：390.1700,實(shí)測(cè)值：390.1695。[0246](5)以如下所述方法合成4-(3'_羥基-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-u'-咕噸]-6'-基)嗎啉-4-氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"FluNox-1"）。[0247]根據(jù)例如OrganicLetters,2011，13,6354-6357中公開(kāi)的方法合成前體化合物3'-羥基-6'-嗎啉代-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'-咕噸]-3-酮。將100mg(0?23mmol)3'-羥基-6'_嗎啉代-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'-咕噸]-3-酮溶解于10mL二甲基甲酰胺中，并在0°C下攪拌該混合物10分鐘。將47mg(0.27mmol)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中，并且使上述混合物回到室溫下，隨后攪拌3小時(shí)。再次將47mg(0.27mmo1)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中。攪拌混合物3小時(shí)，然后減壓蒸餾除去溶劑。通過(guò)硅膠柱色譜法(氯仿：甲醇=7:1)純化得到的殘余物，由此得到FluNox-1(37mg，產(chǎn)率63%)。[0248]4Mffi(CD30D，500MHz)S:8.10(d，lH，J=2.3Hz)，8.05(d，lH，J=7.4Hz)，7.80-7.71(m,2H),7.67(dd,lH,J=9.2,2.3Hz),7.22(d,lH,J=7.4Hz),7.00(d,lH,J=9.2Hz),6.65-6.58(m，2H),4.47(t，2H，J=11.2Hz),4.18-1.12(m，2H),3.94(d，2H，J=12.6Hz)，3.23(m,2H)〇[0249]13C匪R(CD30D，125MHz)S:169.7,160.1，155.2，115.3，113.0，109.9，109.2,102.4,82.4,66.9,61.6。[0250]HRMS(ESI+):m/zC24H2〇N〇6+計(jì)算值：418.1285,實(shí)測(cè)值：418.1304。[0251](6)以如下所述方法合成4-乙?；?i-CT-羥基-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-i，9'_咕噸]-6'-基)-哌嗪-1-氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"FluNox-2"）。[0252]根據(jù)例如ChemicalCommunications，2013,49，10474-10476中公開(kāi)的方法合成前體化合物3'-羥基-6'-(哌嗪-1-基）-3H-螺[異苯并呋喃_1，9'_咕噸]-3-酮。將78mg(0.16臟〇1)3'-羥基-6'-(哌嗪-1-基)-311-螺[異苯并呋喃-1，9'-咕噸]-3-酮溶解在21^吡啶中，并且在0°C下將148iiL(l.6mmol)乙酸酐逐漸加入其中。使上述混合物回到室溫下，并攪拌1小時(shí)。減壓蒸餾除去溶劑，并且通過(guò)硅膠柱色譜法(氯仿：甲醇=100:0至100:1)純化得到的殘余物，由此得到淺黃色粉末3'-(4_乙酰基哌嗪-1-基)-3_氧代-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'-咕噸]-6'-基-乙酸酯(68mg，產(chǎn)率91%)。[0253]咕NMR(CDCl3,500MHz)S:8.02(dd，J=7.6Hz，lH)，7.64(t，J=7.5Hz，lH)，7.62(t，J=7.5Hz,lH),7.17(d,J=7.6Hz,lH),7.06(d,J=2.0Hz,lH),6.81-6.76(m,2H),6.69(d,J=2.2Hz,lH),6.65(d,J=8.9Hz,lH),6.60(dd,J=8.9Hz,2.2Hz,1H),3.75-3.72(m,2H),3?60-3?58(m,2H)，3?25-3?20(m,4H)，2?32(s，3H)，2?12(s，3H)。[0254]13C匪R(CD30D，125MHz)S:169.2，168.9，168.8，152.7，152.4，152.0，151.8，151.7,135.0,129.7,129.0,128.7,126.4,124.9,123.9,117.2,116.6,112.2,110.1，109.2,102.2,82.5,48.1,47.9,45.6,40.8,21.2,21.0〇[0255]HRMS(ESI+):m/zC28H24N2〇6Na+計(jì)算值：507.1527,實(shí)測(cè)值：507.1554。[0256]隨后，將90mg(0.19mmol)得到的3'-(4-乙酰基哌嗪-丨-基)-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃_1，9'_咕噸]-6'-基-乙酸酯溶解在5mL二氯甲烷中，并在0°C下將48mg(0.28mmol)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中。使上述混合物回到室溫下，并攪拌5小時(shí)，隨后減壓蒸餾除去溶劑。通過(guò)硅膠柱色譜法(氯仿：甲醇=10:1)純化得到的殘余物，由此得到無(wú)色粉末1_(3'_乙酰氧基-3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-1，9'-咕噸]-6'-基)-4-乙酰基哌啶-1-氧化物(26mg，產(chǎn)率28%)。[0257]4匪1?(0)(：13,50冊(cè)1^)5:8.25((1，了=2.0他，11〇,8.06((1，了=7.61^，111)，7.72-7.66(m，2H)，7.61(dd，J=8.7Hz，2.0Hz，lH)，7.18(t，J=Hz，lH)，7.14(d，J=3.1Hz，lH)，6.96(t,J=8.7Hz,lH),6.85(s,2H),4.67(d,J=13.7Hz,2H),4.43(t,J=12.5Hz,2H),3.86-3.73(m,4H),3.21(t,J=10.6Hz,4H),2.33(s,3H),2.18(s,3H)〇HRMS(ESI+)：m/zC28H24N2〇7Na+計(jì)算值:523?1476，實(shí)測(cè)值:523?1483〇[0258]隨后，將18mg(0.036mmol)得到的無(wú)色粉末溶解于1.5mL甲醇中，并將15mg(0.llmmol)碳酸鉀的0.5mL水溶液加入其中，隨后在室溫下攪拌30分鐘。然后加入1MHclaq以中和該混合物。用二氯甲烷(5mLX5)萃取所得到的中和的混合物。用硫酸鎂干燥有機(jī)層，并減壓蒸餾除去溶劑。通過(guò)硅膠柱色譜法(氯仿：甲醇=10:1至7:1)純化得到的殘余物，由此得到無(wú)色粉末FluNox-2(14mg，產(chǎn)率82%)。[0259]NMR(CD30D，500MHz)S:8.11(dd，J=5.2Hz，2.3Hz，lH)，8.03(d，J=7.5Hz，lH)，7.78(t,J=7.5Hz,lH),7.73(t,J=7.4Hz,lH),7.66-7.63(m,lH),7.20(d,J=7.5Hz,lH),6.99(d,J=8.6Hz,lH),6.73(d,J=2.3Hz,1H),6.64(d,J=9.2Hz,1H),6.58(d,J=8.6Hz,2.3Hz，lH),4.61(d，J=13.8Hz，1H),4.12-4.10(m，2H),4.00-3.98(m，2H),3.64-3.59(m,1H)，3?27-3?26(m，2H)，2?16(s，3H)。[0260]13C匪R(CD30D，125MHz)S:170.5,169.6,160.2,155.3,152.8,152.1,151.7，135.6,130.2,129.3,128.9,126.2,124.8,123.8,120.8,115.4,112.9,109.9,109.2，102.3,66.6,41.1,36.3,19.7。[0261]HRMS(ESI+):m/zC26H23N2〇6+計(jì)算值:459.1551，實(shí)測(cè)值:459.1553。[0262](7)以如下所述方法合成4-乙酰基-i-CT-G-乙?；哙?丨-基)-3-氧代-3H-螺[異苯并咲喃_1，9咕噸]-6'-基）哌嗪-1-氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"RhoNox-3"）。根據(jù)例如Org.Lett.2011,13,6354-6357中公開(kāi)的方法合成前體化合物二叔丁基-4,4'-(3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃_1，9'_咕噸]-3'，6'_二基)雙(哌嗪-1-羧酸酯）。將188mg(0.028mmol)二叔丁基-4,4'-(3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃_1，9'_咕噸]-3'，6'_二基)雙(哌嗪-1-羧酸酯)溶解于3mL甲醇中，并在0°C下將3mL2M的HC1/甲醇溶液滴加入其中。使上述混合物回到室溫下并攪拌10小時(shí)，隨后減壓蒸餾，由此得到殘余物(深紫色粉末）。將該殘余物溶解于5mL無(wú)水二氯甲烷中，并將196yL(1.41mmol)三乙胺和68yL(0.84mmol)吡啶加入其中。將混合物冷卻至〇°C，并將60此(0.28mmol)乙酰氯在二氯甲烷(3mL)中的溶液加入其中。使上述混合物回到室溫下，并在氮?dú)鈿夥障聰嚢?小時(shí)，隨后用30mL飽和碳酸氫鈉水溶液淬滅，然后用二氯甲燒(30mLX5)萃取。用50mL水和50mL鹽水清洗有機(jī)層。用無(wú)水硫酸鎂干燥得到的溶液，并減壓蒸餾除去溶劑。通過(guò)硅膠柱色譜法(氯仿：甲醇=20:1至10:1)純化得到的紫色粉末，由此得到紫色粉末1，1'-(4,4'-(3_氧代-3H-螺[異苯并呋喃_1，9'_咕噸]_3'，6'_二基)雙(哌嗪-4,1-二基）二乙酮）（142mg，產(chǎn)率92%)。[0263]XHNMR(CDCl3,400MHz)8：8.00(d,J=8.0Hz,lH),7.65-7.60(m,2H),7.17(d,J=7.2Hz,lH),6.69(m,2H),6.67(d,J=9.2Hz,2H),6.61(dd,J=8.8Hz,2.4Hz,2H),3.77-3.76(m,4H),3.66-3.61(m,4H),3.26-3.22(m,8H),2.15(s,6H)〇[0264]13C匪R(CDC13，100MHz)S:171.8,171.7,154.6,152.1,135.9,131.0,130.1,129.6,126.4,125.8,113.5,111.3，102.7,46.9,42.3,21.2。[0265]HRMS(ESI+):m/zC32H32N4Na〇5+計(jì)算值：575?2265，實(shí)測(cè)值：575?2288。[0266]隨后，將133mg(〇.24mm〇l)得到的l，^-(4,4'-(3-氧代-3H-螺[異苯并呋喃-l，9'-咕噸]-3'，6'-二基)雙(哌嗪-4，l-二基）二乙酮)溶解于4mL乙酸乙酯和2mL二氯甲烷中，并在0°C下將46mg(0.27mmol)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中。使上述混合物回到室溫下并攪拌1小時(shí)，隨后減壓蒸餾溶劑。通過(guò)硅膠柱色譜法(氯仿：甲醇=20:1至8:1)純化得到的殘余物，由此得到白色粉末RhoNox-3(60mg，產(chǎn)率44%)。[0267]NMR(CD30D，500MHz)S:8.12(dd，J=5.2Hz，2.3Hz，lH)，8.04(d，J=7.5Hz，lH)，7.78(t,J=8.0Hz,lH),7.73(t,J=7.5Hz,lH),7.65-7.62(m,lH),7.20(d,J=7.5Hz,lH),6.99(d,J=9.2Hz,lH),6.88(d,J=2.3Hz,1H),6.79(d,J=8.6Hz,2.3Hz,1H),6.67(d,J=9.2Hz,lH),4.63(d,J=13.8Hz,1H),4.15-4.12(m,2H),4.02-3.96(m,2H),3.72-3.61(m,5H)，3.32-3.25(m，6H)，2.18(s，3H)，2.13(s，lH)。[0268]13C匪R(CD30D，125MHz)S:170.5,170.4,169.7,155.3,153.1,152.8,152.1，151.9,135.5,130.2,129.3,128.4,126.3,124.7,123.8,120.8,115.3,112.6,109.9，108.4,101.8,82.3,66.6,45.7,41.1,41.0,36.3,19.8,19.7〇[0269]HRMS(ESI+):m/zC32H33N406+計(jì)算值：569.2395,實(shí)測(cè)值：569.2390。[0270](8)以如下所述方法合成3-(二乙氨基)-N，N-二乙基-5，5-二甲基-3'-氧代-3'H，5H-螺[二苯并[b，e]娃-10，1'-異苯并咲喃]-7-胺氧化物（以下簡(jiǎn)稱(chēng)為"Si-RhoNox-1"）。[0271]根據(jù)例如ChemicalCommunications2014，50，14374-14377中公開(kāi)的方法合成前體化合物3，7-雙(二乙氨基)-5，5-二甲基-3'H，5H-螺[二苯并[b，e]硅-10，1'異苯并呋喃]-3'-酮(娃-羅丹明）。將30011^(0.61]11]1〇1)娃-羅丹明溶解于10411^(1.21]11]1〇1)碳酸氫鈉在乙酸乙酯中的溶液（15mL)中，并且在0°C下將182mg(0.74mmo1)間氯過(guò)苯甲酸逐漸加入其中。將混合物加熱至室溫，然后攪拌30分鐘。通過(guò)硅藻土墊進(jìn)行過(guò)濾除去不溶物，隨后減壓蒸餾。通過(guò)硅膠柱色譜法(氯仿：甲醇=15:1)純化得到的殘余物，由此得到橙色粉末Si-RhoNox-1(172mg，產(chǎn)率55%)。[0272]咕NMR(400MHz，CDCl3)S:8.31(d，lH，J=2.4Hz)，8.01(d，lH，J=7.7Hz)，7.72(t，1H,J=7.0Hz),7.61(t,lH,J=7.5Hz),7.41(t,2H,J=7.5Hz),7.01(d,lH,J=9.2Hz),6.94(d,lH,J=2.9Hz),6.83(d,lH,J=9.2Hz),6.51(dd,lH,J=9.2,2.9Hz),3.66-3.62(m,4H),3.37(q,4H,J=7.1Hz),1.16-1.12(m,12H),0.68(d,6H,J=14.0Hz)〇[0273]13C匪R(100MHz，CDC13)S:-2.12,8.01，8.03，12.13.18.11，43.92,66.43,66.51，76.89,90.45,112.06,115.59,121.67,124.48,125.77,126.53,126.64,127.34,128.14，128.92,133.53,136.47,138.43,145.18,146.49,152.51,169.76〇[0274]HRMS(ESI+):m/zC3〇H37N2〇3Si+計(jì)算值：501?2568，實(shí)測(cè)值：501?2571。[0275]測(cè)試?yán)?:Rhonox_l和多齒配體化合物[0276]該測(cè)試使用RhoNox-1作為熒光探針。在該測(cè)試中，為每個(gè)樣品制備RhoNox-1在二甲亞砜中的ImM溶液，并加入緩沖液以獲得所需最終濃度。[0277]將RhoNox-1加入到50mM的HEPES緩沖液(pH7.4)中以產(chǎn)生最終濃度2yM，并進(jìn)一步將多齒配體化合物(NTA、EDTA和TPA)分別加入其中，以產(chǎn)生最終濃度200yM。然后將硫酸亞鐵(II)加入其中以產(chǎn)生最終濃度20yM，并且在室溫下攪拌的同時(shí)，每5分鐘測(cè)量一次混合物的熒光。激發(fā)波長(zhǎng):540nm〇[0278]如圖2的圖表(a)至(d)中所示，雖然僅加入Fe(II)離子的情況中熒光強(qiáng)度在1小時(shí)內(nèi)增加約30倍，但Fe(II)離子+NTA表現(xiàn)出100倍高的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)e(II)離子+TPA表現(xiàn)出200倍高的熒光強(qiáng)度，以及Fe(II)離子+EDTA表現(xiàn)出80倍高的熒光強(qiáng)度。圖2中圖表(e)和(f)揭示了在575nm處熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化表現(xiàn)出明顯區(qū)別，特別是在開(kāi)始時(shí)；即加入多齒配體化合物后約5分鐘，F(xiàn)e(II)離子+NTA、Fe(II)離子+TPA以及Fe(II)離子+EDTA立即表現(xiàn)出與不含多齒配體化合物的樣品在1小時(shí)后表現(xiàn)出的熒光強(qiáng)度基本同等水平的熒光強(qiáng)度。這表明加入這些多齒配體化合物能夠以更高靈敏度檢測(cè)Fe(II)離子。[0279]測(cè)試?yán)?:HMRhonox-M和NTA[0280]該測(cè)試使用HMRhoNox-M作為熒光探針。在該測(cè)試中，為每個(gè)樣品制備HMRhoNox-M在二甲亞諷中的ImM溶液，并加入緩沖液以獲得所需最終濃度。[0281]將HMRhoNox-M加入到50mM的HEPES緩沖液(pH7.4)中以產(chǎn)生最終濃度2虛，然后進(jìn)一步加入多齒配體化合物NTA以產(chǎn)生最終濃度200yM。然后將硫酸亞鐵（II)加入其中，以產(chǎn)生最終濃度20yM，并且在室溫下攪拌的同時(shí)，每5分鐘測(cè)量一次混合物的熒光。激發(fā)波長(zhǎng)：520nm〇[0282]如圖3的圖表(a)至(d)中所示，使用含羥甲基的HMRhoNox-M在NTA存在下的熒光測(cè)量揭示了可以以高靈敏度檢測(cè)Fe(II)離子。[0283]測(cè)試?yán)?:HMFluNox_M和NTA[0284]該測(cè)試使用HMFluNox-M作為熒光探針。在該測(cè)試中，為每個(gè)樣品制備HMFluNox-M在二甲亞諷中的ImM溶液，并加入緩沖液以獲得所需最終濃度。[0285]將HMFluNox-M加入到50mM的HEPES緩沖液(pH7.4)中以產(chǎn)生最終濃度2虛，然后進(jìn)一步加入多齒配體化合物NTA，以產(chǎn)生最終濃度200yM。然后將硫酸亞鐵(II)加入其中，以產(chǎn)生最終濃度20yM，并且在室溫下攪拌的同時(shí)，每5分鐘測(cè)量一次混合物的熒光。[0286]如圖3的圖表(e)至(h)中所示，使用含羥甲基的HMFluNox-M在NTA存在下的熒光測(cè)量揭示了可以以高靈敏度檢測(cè)Fe(II)離子。[0287]上述實(shí)驗(yàn)事實(shí)揭示了，使多種多齒配體化合物與由式（I)表示的熒光探針同時(shí)存在可顯著增加響應(yīng)于Fe(II)離子的響應(yīng)速度和熒光強(qiáng)度增強(qiáng)比。換句話(huà)說(shuō)，根據(jù)本發(fā)明的Fe(II)離子檢測(cè)劑可以高選擇性和高靈敏度快速檢測(cè)在各種樣品中含有的Fe(II)離子。[0288]測(cè)試?yán)?:選擇性檢測(cè)Fe(II)離子[0289]該測(cè)試使用FluNox-1、FluNox-2、RhoNox_l、RhoNox-2、RhoNox_3或Si-RhoNox-1作為熒光探針，IDA、NTA、EDTA或TPA作為多齒配體化合物，以及MnS〇4、CoS〇4、NiS〇4、FeS〇4、卩6〇13、(：113〇4、2113〇4、恥(：1、1((：1、]\^(：12丄3(：12或[01(]\^^)4??6]作為金屬化合物。首先，制備了下述原液。[0290]金屬化合物原液[0291]除[Cu(MeCN)4PF6]之外的過(guò)渡金屬化合物：ImM水溶液[0292]堿金屬或堿土金屬化合物：100mM水溶液[0293][Cu(MeCN)4PF6]:ImM乙臆溶液[0294]熒光探針原液[0295]ImM二甲基甲酰胺溶液[0296]多齒配體化合物原液[0297]IDA(鈉鹽）：lOOmM水溶液[0298]NTA(鈉鹽）：lOOmM水溶液[0299]EDTA(鈉鹽）：lOOmM水溶液[0300]TPA:lOOmM二甲亞砜溶液[0301]將這些原液分別加入到緩沖液中以產(chǎn)生最終濃度以備使用。以下是具體方法。將熒光探針加入到50mM的HEPES緩沖液(pH7.4)中以產(chǎn)生最終濃度2yM，然后進(jìn)一步將多齒配體化合物加入其中以產(chǎn)生最終濃度200yM。將100yL所得到的溶液置于96孔板的每個(gè)孔中。然后將過(guò)渡金屬化合物加入每個(gè)孔中以產(chǎn)生最終濃度20yM或者將堿金屬或堿土金屬化合物加入到每個(gè)孔中以產(chǎn)生最終濃度2mM。將混合物在室溫下攪拌溫育30分鐘，并用酶標(biāo)儀(Gl〇MaX，Pr〇mega公司）測(cè)量熒光強(qiáng)度。使用適合于各熒光探針波長(zhǎng)的濾波器測(cè)量熒光強(qiáng)度。具體地，F(xiàn)luNox-1和FluNox-2使用490nm的激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在510nm至570nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度。RhoNox-1、RhoNox_2和RhoNox-3使用525nm的激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在580nm至640nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度。Si-RhoNox-1使用625nm的激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在660nm至720nm范圍內(nèi)的熒光強(qiáng)度。圖4至圖9示出了測(cè)量結(jié)果。[0302]測(cè)試?yán)?[0303]該測(cè)試使用FluNox-1、FluNox-2、RhoNox_l、RhoNox-2、RhoNox_3或Si-RhoNox-1作為熒光探針，IDA、NTA、EDTA或TPA作為多齒配體化合物，以及FeS〇4作為金屬化合物。以與測(cè)試?yán)?相同的方式制備原液。[0304]將上述原液分別加入到緩沖液中以產(chǎn)生所需最終濃度以備使用。以下是具體方法。將熒光探針加入到3mL50mM的HEPES緩沖液(pH7.4)中以產(chǎn)生最終濃度2yM，然后進(jìn)一步將多齒配體化合物加入其中以產(chǎn)生最終濃度200yM。然后加入FeSCk以產(chǎn)生最終濃度20yM。在時(shí)間點(diǎn)〇秒、10秒使用熒光分光光度計(jì)(FP-6600，JASC0)測(cè)量每種溶液的熒光光譜，然后在添加后60分鐘內(nèi)每300秒測(cè)量一次^對(duì)于FluNox-1和FluNox-2,激發(fā)波長(zhǎng)是500nnu對(duì)于RhoNox-1、RhoNox_2和RhoNox-3，激發(fā)波長(zhǎng)是530nm，以及對(duì)于SiRhoNox-1，激發(fā)波長(zhǎng)是630腦。測(cè)量了530nm(FluNox_l和FluNox-2)、570nm(RhoNox_l、RhoNox_2和RhoNox-3)和665nm(SiRhoNox-l)的熒光強(qiáng)度。圖10示出測(cè)量結(jié)果。【主權(quán)項(xiàng)】1.一種Fe(II)離子檢測(cè)劑，包括與具有至少S個(gè)配位位置的化合物組合的由式（I)表示的化合物(巧光探針）：其中，Ri和R2相同或不同，并且表示低級(jí)烷基、簇基低級(jí)烷基、芳基或芳基低級(jí)烷基；R3和R4相同或不同，并且表示氨、面素或低級(jí)烷基；Ri和R2可與它們所連接的氮原子一起形成化咯燒環(huán)、贓晚環(huán)、嗎嘟環(huán)或任選取代的贓嗦環(huán)；Ri和R3可一起形成=亞甲基；R2和R4可一起形成=亞甲基；R嗦示氨、任選受保護(hù)的徑基、低級(jí)烷氧基或由式(A)=-NRSiR5嗦示的基團(tuán)，其中R5哺R52相同或不同，并且表示低級(jí)烷基、簇基低級(jí)烷基、芳基或芳基低級(jí)烷基，或RSi和R52可與它們所連接的氮原子一起形成化咯燒環(huán)、贓晚環(huán)、嗎嘟環(huán)或任選取代的贓嗦環(huán)；R6和R7相同或不同，并且表示氨、面素或低級(jí)烷基；當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，RSi和R6可一起形成=亞甲基，或R52和R7可一起形成=亞甲基；環(huán)A表示任選取代的芳環(huán)或任選取代的雜芳環(huán)；V表示O或SiRiVi,其中，Ri哺Ri哺同或不同，并且表示氨或低級(jí)烷基；W表示C出、CO或S(O)P;Z表示0或NR9，其中R9表示氨或烷基；m和n相同或不同，并且表示0或1;W及P表示1或2。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，所述具有至少S個(gè)配位位置的化合物具有相同或不同的至少=個(gè)配位位置，所述至少=個(gè)配位位置選自由氨基、徑基、簇基、麟酸基和含氮雜芳環(huán)組成的組。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，所述具有至少S個(gè)配位位置的化合物是亞氨基二乙酸（IDA)、氮川S乙酸(NTA)、N，N，N'，N'-乙二胺四乙酸巧DTA)、l，3-丙二胺四乙酸(PDTA)、二亞乙基S胺五乙酸(DTPA)、徑乙基乙二胺S乙酸化EDTA)、S亞乙基四胺六乙酸（TTHA)、1，2-二氨基環(huán)己燒四乙酸（CyDTA)、乙二醇酸二胺四乙酸（G抓TA或EGTA)、N，N-雙（2-徑基芐基）乙二胺二乙酸化肥D)、乙二胺二丙酸化DDP)、乙二胺二乙酸化DDA)、乙二胺二班巧酸巧DDS)、1,3-二氨基-2-徑基丙烷四乙酸(DPTA-OH)、二徑乙基甘氨酸(D皿G)、六亞甲基二胺四乙酸化DTA)、徑乙基亞氨基二乙酸化IDA)、二氨基丙烷四乙酸(甲基-EDTA)、氮川S丙酸(NTP)a-谷氨酸二乙酸(GLDA)、0,0'-雙-2-氨基苯基-N，N，N'，N'-四乙酸(BAPTA)、乙二胺四（亞甲基麟酸）化DTPO)、氮川S(亞甲基麟酸）（NTPO)、徑基亞乙基二麟酸化EDP)、麟酷基下燒S簇酸(PBTC)、S(2-化晚基甲基)胺(TPA)、二甲基化晚胺(DPA)、鄰氨基苯酪-N，N，〇-S乙酸(APTRA)、化嘟或其衍生物、獻(xiàn)菁或其衍生物、1，4,7-S氮雜環(huán)壬燒（TACN)、1，4,7,10-四氮雜環(huán)十二燒（CYCLEN)、1，4,8,11-四氮雜環(huán)十四燒(CY化AM),或它們的鹽。4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，式（I)中的環(huán)A由式(a)表不：其中，R嗦示任選受保護(hù)的徑基、低級(jí)烷氧基、面素、簇基、低級(jí)燒氧幾基、-N=C=CK-N=C=S、橫基或活性醋基;q表示0、1、2或3;并且當(dāng)q是2或3時(shí)，R呵相同或不同。5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的化(II)離子檢測(cè)劑，其中，R哺R2相同或不同，并且表示打-6烷基；Ri和R2可與它們所連接的氮原子一起形成嗎嘟環(huán)或任選取代的贓嗦環(huán)；R3和R4表示氨，或者Ri和R3可一起形成=亞甲基；R2和R4可一起形成=亞甲基；R5表示任選受保護(hù)的徑基或由式(A):-NRS1r52表示的基團(tuán)；當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，RSi和R52相同或不同，并且表示Ci-6烷基；R6和R7表示氨;或者r5i和R6可一起形成=亞甲基；RS2和R7可一起形成=亞甲基；q是0;W是C出或CO;Z是0;m是0;并且n是0。6.根據(jù)權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，其中，Ri和R2相同或不同，并且表示Ci-3烷基;R3和R4表示氨;R5表示任選受保護(hù)的徑基，或由式(A):-NRS1r52表示的基團(tuán)，當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，R5哺R52相同或不同，并且表示Ci-3烷基;R哺R嗦示氨;q是0;W是C出或CO;Z是0;m是0;并且n是0。7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的化（II)離子檢測(cè)劑，其中，所述由式（I)表示的化合物(巧光探針)和所述具有至少=個(gè)配位位置的化合物混合在一起。8.根據(jù)權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的Fe(II)離子檢測(cè)劑，所述化（II)離子檢測(cè)劑是試劑盒的形式，該試劑盒包括容納所述由式（I)表示的化合物（巧光探針）的容器和容納所述具有至少=個(gè)配位位置的化合物的容器。9.一種用于檢測(cè)化（II)離子的方法，所述方法包括W下步驟：(1)使含有Fe(II)離子的樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的鐵(II)離子檢測(cè)劑混合；W及(2)測(cè)量所得到的混合物的巧光光譜。10.-種用于增加化(II)離子檢測(cè)靈敏度的方法，所述方法包括W下步驟：(1)使含有Fe(II)離子的樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至8中任一項(xiàng)所述的鐵(II)離子檢測(cè)劑混合；W及(2)測(cè)量所得到的混合物的巧光光譜。11.一種用于制備化(II)離子檢測(cè)劑的方法，所述方法包括W下步驟：使由式(I)表示的化合物(巧光探針)與具有至少=個(gè)配位位置的化合物混合，其中，Ri和R2相同或不同，并且表示低級(jí)烷基、簇基低級(jí)烷基、芳基或芳基低級(jí)烷基；R3和R4相同或不同，并且表示氨、面素或低級(jí)烷基；Ri和R2可與它們所連接的氮原子一起形成化咯燒環(huán)、贓晚環(huán)、嗎嘟環(huán)或任選取代的贓嗦環(huán)；Ri和R3可一起形成=亞甲基；R2和R4可一起形成=亞甲基；R可W是氨、任選受保護(hù)的徑基、低級(jí)烷氧基或由式(A)=-NRSiR5嗦示的基團(tuán)，其中R5哺R52相同或不同，并且表示低級(jí)烷基、簇基低級(jí)烷基、芳基或芳基低級(jí)烷基，或RSi和R52可與它們所連接的氮原子一起形成化咯燒環(huán)、贓晚環(huán)、嗎嘟環(huán)或任選取代的贓嗦環(huán)；R6和R7相同或不同，并且表示氨、面素或低級(jí)烷基；當(dāng)R5是由式(A)表示的基團(tuán)時(shí)，RSi和R6可一起形成=亞甲基，或R52和R7可一起形成=亞甲基；環(huán)A表示任選取代的芳環(huán)或任選取代的雜芳環(huán)；V表示O或SiRiVi,其中，Ri哺Ri哺同或不同，并且表示氨或低級(jí)烷基；W表示C出、CO或S(O)P;Z表示0或NR9，其中R9表示氨或烷基；m和n相同或不同，并且表示0或1;W及P表示1或2。【文檔編號(hào)】G01N31/00GK105917234SQ201580004511【公開(kāi)日】2016年8月31日【申請(qǐng)日】2015年1月16日【發(fā)明人】永澤秀子,平山祐【申請(qǐng)人】梅托珍尼克斯株式會(huì)社