一種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供一種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器的制備方法，是先用L?半胱氨酸對多壁碳納米管進行功能化，得到Cys?MWCNTs，然后采用電化學(xué)法將銀納米粒子沉積到Cys?MWCNTs修飾電極的表面得到的。本發(fā)明還提供應(yīng)用該方法制備得到的無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器及其應(yīng)用。本發(fā)明首次利用銀納米粒子對活性氧的催化作用代替SOD酶以達到對超氧陰離子的檢測目的，方法簡單、易操作，且不易失活，可以長期保存使用。并且將該修飾電極成功應(yīng)用于檢測活細胞（PC12）釋放的超氧陰離子。本發(fā)明構(gòu)建的修飾電極對O2·?有很好的電化學(xué)響應(yīng)，具有線性范圍寬、靈敏度高、響應(yīng)時間短、穩(wěn)定性以及重復(fù)性好等特點。
【專利說明】
-種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 活性氧(ROS)是重要的細胞內(nèi)信號分子，主要調(diào)節(jié)DNA損傷、蛋白質(zhì)合成、細胞調(diào)亡 等等。其中，超氧陰離子(〇2 ?-)作為最重要且最活躍的ROS之一，參與了許多生理和病理過 程，會對生物器官造成損傷。近年來，〇2 ? 1 農(nóng)度與人類健康之間的關(guān)系引起了極大關(guān)注，從 體內(nèi)應(yīng)用學(xué)的角度，要求化?-的動態(tài)檢測線性范圍寬，不僅在毫摩爾、微摩爾的摩爾濃度， 甚至需要延伸至納摩爾級別的摩爾濃度。與此同時，由于化?-極不穩(wěn)定，很容易衰變?yōu)槠?它活性氧單元，因此，建立高效、可靠的定性定量檢測方法仍是一個難點。
[0003] 近年來電化學(xué)方法由于其簡單易用、低成本、可靠性高、靈敏度高、選擇性好、檢出 限低而受到廣泛關(guān)注。研究較為廣泛的是將銅-鋒超氧化物歧化酶(化-Zn SOD)固定在電極 表面構(gòu)建酶傳感器。然而，由于酶的活性中屯、被表面蛋白質(zhì)覆蓋，造成電子傳遞困難。此外， 酶的價格昂貴，容易失活，對環(huán)境要求較高，酶電極的制備較為繁瑣且不易儲存，運些不足 都大大限制了酶傳感器的發(fā)展。因此，研制具有低檢測限的無酶化傳感器就顯得尤為重 要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感 器及其制備方法和應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明的第一個目的是提供一種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器的制備方法，是先 用心半脫氨酸化-切S)對多壁碳納米管(MWCNTs)進行功能化，得到切S-MWCNTs，然后采用電 化學(xué)法將銀納米粒子(AgNPs)沉積到Cys-MWCNTs修飾電極的表面得到的。
[0006] 作為優(yōu)選，所述用心半脫氨酸化-切S)對多壁碳納米管(MWCNTs)進行功能化的具 體方法為:將純化后的多壁碳納米管與k半脫氨酸分散于超純水中，加入1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酷二亞胺鹽酸鹽和N-徑基班巧酷亞胺，室溫攬拌20-2化，離屯、后水洗，配成 分散液;作為優(yōu)選，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酷二亞胺鹽酸鹽和N-徑基班巧酷亞 胺的加入量均為多壁碳納米管質(zhì)量的20倍。
[0007] 作為優(yōu)選，所述多壁碳納米管與心半脫氨酸的質(zhì)量比為1:1。
[000引作為優(yōu)選，所述采用電化學(xué)法將銀納米粒子(AgNPs)沉積到切S-MWCNTs修飾電極 的表面的具體方法為:將心半脫氨酸功能化的多壁碳納米管分散液滴涂于預(yù)處理的裸玻碳 電極，烤干后，得到k半脫氨酸功能化多壁碳納米管修飾的玻碳電極;再將此修飾電極插入 含有硝酸銀的硝酸鐘電解質(zhì)溶液中，進行電化學(xué)沉積，制得沉積有銀納米粒子的無酶超氧 陰離子電化學(xué)傳感器。
[0009]作為優(yōu)選，所述電化學(xué)沉積是在OV下用計時電流法電化學(xué)沉積1-300S;作為優(yōu)選， 電化學(xué)沉積200s。
[0010]在該電化學(xué)沉積時間內(nèi)，均能得到修飾電極，當(dāng)電化學(xué)沉積時間為200s時，修飾電 極對超氧陰離子的電化學(xué)響應(yīng)峰電流最大。
[0011]作為優(yōu)選，所述硝酸銀的濃度為0.01-3111111〇1/1;作為優(yōu)選，濃度為1mmol/L。
[0012] 在該濃度范圍內(nèi)，均能得到修飾電極，當(dāng)硝酸銀的濃度為1mmol/L時，修飾電極對 超氧陰離子的電化學(xué)響應(yīng)峰電流最大。
[0013] 本發(fā)明的第二個目的是提供應(yīng)用上述方法制備得到的無酶超氧陰離子電化學(xué)傳 感器。
[0014] 本發(fā)明的第=個目的是提供上述無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器在檢測超氧陰離 子中的應(yīng)用。
[0015] 作為優(yōu)選，所述超氧陰離子為被AA刺激的PC12細胞釋放的。
[0016] 作為優(yōu)選，所述超氧陰離子為細胞PC12直接釋放的。
[0017] 本發(fā)明優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果是： 1、本發(fā)明構(gòu)建了一個基于心半脫氨酸功能化碳納米管和銀納米粒子的無酶化傳感 器，首次利用銀納米粒子對活性氧的催化作用代替SOD酶W達到對超氧陰離子的檢測目的， 相比于傳統(tǒng)酶傳感器的價格昂貴，容易失活，制備繁瑣且不易儲存等缺點，該傳感器制備方 法簡單，易操作，且不易失活，可W長期保存使用。
[001引2、本發(fā)明的修飾電極對化?-有超靈敏的電化學(xué)響應(yīng)，響應(yīng)時間短，寬的線性范圍： 7X10-ll~7.41X10-5mol/L，低的檢測限：2.33X10-llmol/L，W及好的穩(wěn)定性和重復(fù)性等 優(yōu)點。
[0019] 3、本發(fā)明的傳感器不僅能夠檢測到被AA刺激的PC12細胞釋放的〇2' -，還能直接檢 測細胞PC12釋放的化運表明該修飾電極在生命病理分析中具有極大的潛在價值，并有望 應(yīng)用于與化?-有關(guān)的醫(yī)學(xué)疾病診斷。
[0020]表1本發(fā)明與現(xiàn)有的〇2?節(jié)感器對測性能的比較

【附圖說明】
[0021] 附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與本發(fā)明的實 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1為本發(fā)明的修飾電極Ag化s/切s-MWCNTs/GCE的掃描電鏡圖（SEM); 圖2為a:裸電極;b: AgNPs/切s-MWCNTs/GCE分別在含有l(wèi).OmM的化?-的化飽和的0.2M PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安曲線。C是Ag化s/切s-MWCNTs/GCE在不含〇2 ?-的化飽和的0.2M PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安曲線。掃速:50mV/s; 圖3為AgNPs/切s-MWCNTs/GCE對不同濃度的化?-檢測的計時電流曲線圖（圖3A，3B， 3D，3E)及化?-的還原峰電流與其濃度之間的線性關(guān)系圖（圖3C，3巧； 圖4為Ag化s/切s-MWCNTs/GCE在含有1 X IO5個鼠腎上腺嗜銘細胞(PC12)的生理PBS緩 沖溶液中，通過連續(xù)滴加 IyM抗壞血酸(AA)刺激，檢測PC12釋放出的化?的計時電流曲線 圖。
【具體實施方式】
[0022] W下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市 售。
[0023] 本發(fā)明實施過程中所使用的儀器和藥品： CHI 660C電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司）用于進行循環(huán)伏安、計時電流的實驗，石 英管加熱式自動雙重純水蒸饋器（1810B，上海亞太技術(shù)玻璃公司）用于蒸超純水。電子天平 (北京賽多利斯儀器有限公司），用于稱量藥品。超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司）。 =氧化二侶打磨粉(0.30曲1，0.05曲1，上海辰華儀器試劑公司）用于處理玻碳電極。飽和甘隸 參比電極，銷對電極，憐酸二氨鋼、憐酸氨二鋼、氯化鐘、硝酸銀、硝酸鐘(西安化學(xué)試劑廠）； 多壁碳納米管(深圳納米港有限公司）。實驗過程中使用的水均為超純水，實驗所用的試劑 均為分析純。
[0024] 本發(fā)明的一種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器的制備方法如下： a. 多壁碳納米管的純化：W混酸為氧化劑對多壁碳納米管(MWCNTs)進行純化，將 MWCNTs與體積比為3:1的濃硫酸和濃硝酸的混合溶液超聲后，70°C加熱回流化，用超純水洗 涂至中性，50°C真空干燥； b. 制備k半脫氨酸-多壁碳納米管復(fù)合材料:取等質(zhì)量純化后的多壁碳納米管與心半 脫氨酸分散于超純水中，隨后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酷二亞胺鹽酸鹽和N-徑 基班巧酷亞胺，兩者的加入量均為碳納米管(或心半脫氨酸）質(zhì)量的20倍。1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酷二亞胺鹽酸鹽和N-徑基班巧酷亞胺為交聯(lián)劑，可W促進碳納米管上的簇 基和k半脫氨酸上的氨基發(fā)生酷胺化反應(yīng)產(chǎn)生酷胺鍵，室溫攬拌2地，12000rmp離屯、，水洗4 次，配成l.Omg ? mL-i的分散液，待用； C.制備Ag化s/切S-MWCNTs修飾電極:將化L的心半脫氨酸功能化的多壁碳納米管分 散液滴涂于預(yù)處理的裸玻碳電極，置于紅外燈下烤干，制得k半脫氨酸功能化多壁碳納米 管修飾的玻碳電極;再將此修飾電極插入含有0.01-3mM硝酸銀的0 . IM硝酸鐘電解質(zhì)溶液 中，在OV下用計時電流法電化學(xué)沉積1-300S，從而制得沉積有銀納米粒子的心半脫氨酸功 能化多壁碳納米管修飾的玻碳電極(AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE)。
[0025] 實施例1 本發(fā)明的一種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器的制備方法如下： a. 多壁碳納米管的純化：W混酸為氧化劑對多壁碳納米管(MWCNTs)進行純化，將 MWCNTs與體積比為3:1的濃硫酸和濃硝酸的混合溶液超聲后，70°C加熱回流化，用超純水洗 涂至中性，50°C真空干燥； b. 制備k半脫氨酸-多壁碳納米管復(fù)合材料:取等質(zhì)量純化后的多壁碳納米管與心半 脫氨酸分散于超純水中，隨后加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酷二亞胺鹽酸鹽和N-徑 基班巧酷亞胺，兩者的加入量均為碳納米管(或心半脫氨酸）質(zhì)量的20倍。1-乙基-(3-二甲 基氨基丙基)碳酷二亞胺鹽酸鹽和N-徑基班巧酷亞胺為交聯(lián)劑，可W促進碳納米管上的簇 基和k半脫氨酸上的氨基發(fā)生酷胺化反應(yīng)產(chǎn)生酷胺鍵，室溫攬拌2地，12000rmp離屯、，水洗4 次，配成l.Omg ? mL-i的分散液，待用； C.制備Ag化s/切S-MWCNTs修飾電極:將化L的心半脫氨酸功能化的多壁碳納米管分 散液滴涂于預(yù)處理的裸玻碳電極，置于紅外燈下烤干，制得k半脫氨酸功能化多壁碳納米 管修飾的玻碳電極;再將此修飾電極插入含有0.1 mM硝酸銀的0.1 M硝酸鐘電解質(zhì)溶液中，在 OV下用計時電流法電化學(xué)沉積200s，從而制得沉積有銀納米粒子的心半脫氨酸功能化多壁 碳納米管修飾的玻碳電極(AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE)。
[0026] 圖1為本發(fā)明所制備修飾電極(Ag化s/切s-MWCNTs/GCE)的掃描電鏡圖（SEM)。從圖 中可W看出通過電沉積合成銀納米粒子-1^-半脫氨酸功能化多壁碳納米管修飾電極中，尺 寸約在20nm的球形銀納米粒子均勻地分布在多壁碳納米管壁上，且沒有團聚現(xiàn)象。
[0027] d.采用步驟C所得到的修飾電極為工作電極、銷柱為對電極、飽和甘隸電極為參 比電極，組成S電極體系，將其共同浸入含有l(wèi).OmM化的化飽和的0.2M pH=7.0的憐酸鹽 緩沖溶液中進行循環(huán)伏安掃描，循環(huán)伏安技術(shù)的電位窗設(shè)置為-0.8V-0.2V，得到修飾電極 對化?的電化學(xué)響應(yīng)。
[002引圖2為a:裸電極;b: AgNPs/切s-MWCNTs/GCE分別在含有l(wèi).OmM的02 ?-的化飽和的 0.2M PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安曲線。C是Ag化s/切s-MWCNTs/GCE在不含02 ?-的化飽和的 0.2M PBS(pH=7.0)中的循環(huán)伏安曲線，掃速為50mV/s。
[0029] 由圖可得:相比于裸電極，〇2 ?-在AgNPs /切s-MWCNTs/GCE上的還原峰電位發(fā)生了 明顯的正移，且還原峰電流顯著的增大，運表明AgNPs /切s-MWCNTs/GCE對化?-的還原有明 顯的電催化作用，運主要歸因于銀納米粒子對化的還原有很強的催化性能，而且Cys- MWCNTs作為支持基質(zhì)，不僅可W有效的提高修飾電極的導(dǎo)電性，其大的比表面積還可W負 載更多的的銀納米粒子，運將進一步提高化?-在修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)。
[0030] 實施例2 本實施例與實施例1的不同之處在于:硝酸銀的濃度為0.0 lmM,在OV下用計時電流法電 化學(xué)沉積時間為300s。其余步驟均與實施例1相同。
[0031] 實施例3 本實施例與實施例1的不同之處在于:硝酸銀的濃度為3mM，在OV下用計時電流法電化 學(xué)沉積時間為1S。其余步驟均與實施例1相同。
[0032] 實施例4 本實施例與實施例1的不同之處在于:硝酸銀的濃度為2mM，在OV下用計時電流法電化 學(xué)沉積時間為20s。其余步驟均與實施例1相同。
[0033] 實施例5 本實施例與實施例1的不同之處在于:硝酸銀的濃度為1.5mM，在OV下用計時電流法電 化學(xué)沉積時間為100s。其余步驟均與實施例1相同。
[0034] 實施例6本發(fā)明的修飾電極AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE對化測的線性范圍 W本發(fā)明實施例1制備的修飾電極為工作電極，銷柱為對電極、飽和甘隸電極為參比電 極，組成S電極體系，在化飽和的0.2M pH=7.0的憐酸鹽緩沖溶液中，對不同濃度化?-進行 循環(huán)伏安掃描，電位窗設(shè)置為-0.8V-0.2V，結(jié)果參見圖3。
[0035] 圖3為AgNPs/Cys-MWCNTs/GCE對不同濃度的〇2 ?-檢測的計時電流曲線圖（A、B、D、 E，圖B為圖A的局部放大圖，圖E為圖D的局部放大圖）、化的還原峰電流與其濃度的線性關(guān) 系圖（C、F)。由圖可知，對02?-檢測的線性范圍為7X10-ll~7.57X10-8mol/L、5.59X10-7 ~7.41X10-5mol/L，檢測限為2.33X10-llmol/L。本發(fā)明與其他02?-傳感器相比，檢測范圍 寬，檢測限低，檢測過程簡單，靈敏度高、快速簡便。
[0036] 實施例7應(yīng)用本發(fā)明的修飾電極AgNPs/切s-MWCNTs/GCE對活細胞中超氧陰離子 (化?-)的電化學(xué)檢測 a. 鼠腎上腺嗜銘細胞(PCl2)在濕度為95%的37°C恒溫的DMEM培養(yǎng)基中培育24小時，該 培養(yǎng)基的主要成分包括：10%熱滅活的胎牛血清，lOOU/mL的青霉素，lOOmg/mL的鏈霉素，5% 的C〇2。將培養(yǎng)好的PC12細胞的培養(yǎng)基移除，用憐酸鹽緩沖溶液洗涂S次，后加入3mL憐酸鹽 緩沖溶液于待測細胞中。PC12細胞數(shù)目約為1 X IO5個/孔板； b. W本發(fā)明實施例1制備的修飾電極為工作電極、銷柱為對電極、飽和甘隸電極為參 比電極，組成S電極體系，將此S電極體系共同浸入含有鼠腎上腺嗜銘細胞(PC12)的0.2M PBS(PH=7.4)中，連續(xù)滴加化M心抗壞血酸(AA)刺激PC12釋放化?-，并用計時電流法進行檢 ，得到修飾電極對化的計時電流曲線； C.采用origin軟件作圖，繪制步驟a、b所得循環(huán)伏安曲線、計時電流曲線W及化? 電流與其濃度對數(shù)、濃度之間的線性關(guān)系圖。
[0037] 圖4顯示了 Ag化s/Cys-MWCNTs/GCE在含有1X105個鼠腎上腺嗜銘細胞(PC12)的 0.2M PBS(PH=7.4)中，通過連續(xù)滴力日IiiM抗壞血酸(AA)刺激，檢測PC12釋放出的化?-的計時 電流曲線圖。作為對照實驗，圖曰，b，d分別對應(yīng)著在空白0.2M PBS(pH=7.0)中滴加 IiiM AA, PC12W及在含有300U/mL SOD的PC12中滴力日化M AA的計時電流檢測圖。
[003引由圖可知，當(dāng)在空白PBS中滴加 IiiM AA(圖a)或未刺激的PCm圖b)時，均無明顯電 流變化產(chǎn)生，且圖b的穩(wěn)態(tài)電流明顯高于圖曰，運可能是因為超靈敏的修飾電極可W檢測到 PC12自身所產(chǎn)生的R0S。當(dāng)連續(xù)加入化M AA刺激PC12時，電流響應(yīng)明顯增加（圖C)。運說明 PC12在刺激下能夠短時間內(nèi)釋放大量化?-。為了證實增加的電流響應(yīng)是由刺激的PC12所釋 放的化?-引起的，將300U/血超氧陰離子的特異性酶(SOD)與PC12混合，并加入化M AA刺激。 由圖d可知，此時響應(yīng)電流變?yōu)槠骄彛f明本修飾電極能夠成功檢測到PC12所釋放的化?-， 且圖d的穩(wěn)態(tài)電流依舊高于空白PBS(圖曰），運說明SOD酶特異性消除了細胞溶液中的化?-， 其他ROS仍然存在。運為進一步研究與化?-相關(guān)的生理學(xué)及病理學(xué)奠定了基礎(chǔ)。
[0039]最后應(yīng)說明的是：W上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明， 盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可 W對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換。 凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的 保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器的制備方法，其特征在于:是先用L-半胱氨酸對 多壁碳納米管進行功能化，得到Cys-MWCNTs，然后采用電化學(xué)法將銀納米粒子沉積到Cys-MffCNTs修飾電極的表面得到的。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述用L-半胱氨酸對多壁碳納米管進 行功能化的具體方法為:將純化后的多壁碳納米管與L-半胱氨酸分散于超純水中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺，室溫攪拌20-28h，離心 后水洗，配成分散液;作為優(yōu)選，所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺的加入量均為多壁碳納米管質(zhì)量的20倍。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于:所述多壁碳納米管與L-半胱氨酸的質(zhì) 量比為1: 1。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于:所述采用電化學(xué)法將銀納米粒 子沉積到Cys-MffCNTs修飾電極的表面的具體方法為:將L-半胱氨酸功能化的多壁碳納米管 分散液滴涂于預(yù)處理的裸玻碳電極，烤干后，得到L-半胱氨酸功能化多壁碳納米管修飾的 玻碳電極;再將此修飾電極插入含有硝酸銀的硝酸鉀電解質(zhì)溶液中，進行電化學(xué)沉積，制得 沉積有銀納米粒子的無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述電化學(xué)沉積是在OV下用計時電流法電 化學(xué)沉積l-300s;作為優(yōu)選，電化學(xué)沉積200s。6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于:所述硝酸銀的濃度為0.01-3mmol/L;作為 優(yōu)選，濃度為lmmol/Lo7. 應(yīng)用權(quán)利要求1-6任一所述的方法制備得到的無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器。8. 權(quán)利要求7所述的無酶超氧陰離子電化學(xué)傳感器在檢測超氧陰離子中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述超氧陰離子為被AA刺激的PC12細胞釋 放的。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述超氧陰離子為細胞PC12直接釋放的。
【文檔編號】G01N27/333GK105954336SQ201610291747
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年5月5日
【發(fā)明人】劉秀輝, 劉岳麟, 郭志盼, 劉丹, 劉一丹, 盧小泉
【申請人】西北師范大學(xué)