一種桉樹組織的石蠟切片方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物顯微觀測技術領域，公開了一種桉樹組織的石蠟切片方法。該方法包括取材和固定、洗滌、脫水、透明、透蠟、包埋、切片、展片、貼片和烤片、脫蠟復水、染色、脫水和復染、封片。本發(fā)明采用新型固定液聚羥基丙烯酸，該固定液固定速度快，可以大大減少固定時間，并且可以使固定更加均勻；同時，我們使用完全無毒的TO透明劑代替二甲苯，TO透明劑25℃以上能與95％的乙醇互溶，能溶解石蠟和封固樹膠，揮發(fā)性好，對常用生物染料染色無不良影響，且透明和脫蠟效果較好，透明后，組織不易變脆，切片可保持完整；還使用封片劑CVmount替代中性樹膠。本發(fā)明通過優(yōu)化石蠟制片中的固定、脫水和封片步驟，在保證切片效果的前提下，使制片周期縮短了至少72h。
【專利說明】
一種桉樹組織的石蠟切片方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明屬于植物顯微觀測技術領域，特別涉及一種桉樹(Eucalyptus)組織的石錯 切片方法。
【背景技術】
[0002] 石錯切片(paraffin section)技術的應用已經有300多年的歷史，是植物組織結 構學常規(guī)制片技術中最為廣泛應用的方法之一。石蠟切片不僅可用于觀察植物正常細胞組 織的形態(tài)結構，也是病理學和法醫(yī)學等學科用以觀察、研究及判斷細胞組織的形態(tài)變化的 主要方法，而且也已相當廣泛地用于基礎生物學等多學科領域的研究中。近年來，隨著生物 科學技術的發(fā)展，植物生態(tài)解剖學和分子生物學的興起，石蠟切片技術更加活躍地應用于 植物科學研究領域，成為了不同生境植物或演替系列優(yōu)勢種生態(tài)適應性研究的重要手段。
[0003] 石蠟切片技術包括取材、固定、洗滌、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、貼片、脫蠟、染 色、脫水、透明、封片等步驟。取材應根據要求選取材料來源及部位，材料必須新鮮，擱置時 間過久則產生蛋白質分解和變性，導致細胞自溶及細菌的滋生，而不能反映組織活體時的 形態(tài)結構。固定是指用適當?shù)墓潭ㄒ航n切成小塊的新鮮材料，迅速凝固或沉淀細胞和組 織中的物質成分、終止細胞的一切代謝過程、防止細胞自溶或組織變化，盡可能保持其取材 時的結構。固定能使組織硬化，有利于切片的進行，而且有媒浸作用，有利于組織著色。洗滌 就是將留在組織內的固定液及其結晶沉淀洗凈，否則會影響后期的染色效果。脫水是使用 一定的試劑除去組織中多余的水分，有利于透明，浸蠟，包埋試劑的浸入。透明是指使用透 明劑來置換組織中的脫水劑，使材料透明干凈，增加折光系數(shù)，以便石蠟滲入組織。浸蠟是 用石蠟取代透明劑，使石蠟浸入組織而起支持作用，使材料可用于切片。染色的目的是使細 胞組織內的不同結構呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察，經染色可顯示細胞內不同的細胞器、內 含物以及不同類型的細胞組織。染色后的切片尚不能在顯微鏡下觀察，需經梯度酒精脫水， 二甲苯透明，滴加適量中性樹膠，蓋蓋玻片封片后即制成永久性玻片標本，在光鏡下可長期 反復觀察。一般的組織從取材、固定到封片制成玻片標本需要5~7天。
[0004] 石蠟切片常用的固定液主要有FAA固定液(主要成分為福爾馬林、醋酸和酒精，固 定8~24h)，F(xiàn)PA固定液(主要成分為福爾馬林、丙酸和酒精，固定8~24h)，卡諾氏（Carnoy' s)固定液(主要成分為酒精和乙酸;酒精、乙酸和氯仿；甲醇、乙酸和氯仿;根尖、花藥固定15 ~30min，其他材料固定時不超過24h)，絡酸-乙酸固定液(主要成分為絡酸、乙酸和麥芽糖， 固定12~24h)，納瓦申（Navashin's)固定液(主要成分為絡酸、乙酸和甲醛，固定12~24h)。 其中甲醛、甲醇、乙醇、乙酸和氯仿易揮發(fā)，而且甲醛、甲醇和氯仿對人體有毒害作用，并對 環(huán)境造成污染。常規(guī)固定液固定時間一般較長，一般在8h~24h之間。整個制片過程中，組織 的透明、切片的脫蠟和切片的透明等步驟都離不開二甲苯，該試劑是常規(guī)植物切片技術必 用試劑。但是，二甲苯為揮發(fā)性強的劇毒化學試劑，對人的呼吸、造血及神經系統(tǒng)具有很強 的毒害作用，也是致癌物質之一，嚴重危害長期從事組織切片實驗人員的健康；另外，二甲 苯用于切片制片時對組織穿透能力強，透明時間不好把握，易使切片組織收縮，發(fā)硬變脆， 增加了切片制作的難度，容易形成廢片，浪費材料。因此，尋找二甲苯的無毒性替代品對改 善石蠟切片工作環(huán)境，保護操作者健康和提高切片質量具有重要意義。

【發(fā)明內容】

[0005] 為了克服上述現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種桉樹組織 的石蠟切片方法。該方法在固定、脫水和封片環(huán)節(jié)進行了優(yōu)化，使用聚羥基丙烯酸作為固定 劑，并使用T0透明劑替代二甲苯，封片劑CVmount替代中性樹膠，在保證切片效果的前提下 大大縮短了制片所用時間。
[0006] 本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：
[0007] -種桉樹組織的石蠟切片方法，主要包括以下步驟：
[0008] (1)取材和固定:取〇. 3~0.7cm長的桉樹幼嫩莖段或初生根作為固定的材料，將材 料放入裝有聚羥基丙烯酸固定液的玻璃瓶中，密封并抽真空，然后靜置，室溫下固定lh。
[0009] (2)洗滌:將固定后的材料取出，依次移入到裝有50 %乙醇、70 %乙醇、70 %乙醇的 玻璃瓶中，塞緊瓶塞分別洗滌13~17min，其中玻璃瓶中的液體體積均為材料的30倍以上， 然后再將材料移入裝有70%乙醇的玻璃瓶中保存?zhèn)溆?，同時加入0.05~0.20mL 1 %的番紅 酒精溶液，以便包埋時識別材料。
[0010] (3)脫水:將步驟(2)中洗滌后的材料依次移入盛有體積為材料30倍以上的85 %乙 醇、95 %乙醇、無水乙醇、無水乙醇的玻璃瓶中分別脫水處理40~60min。
[0011] (4)透明：將經步驟(3)脫水后的材料依次移入裝有透明劑I、透明劑Π 、透明劑m 的玻璃瓶中分別透明處理lh。
[0012] (5)透蠟：向步驟(4)中透明處理后的玻璃瓶中加入與瓶中透明劑m等體積的碎 蠟，然后放入空氣恒溫箱，處理溫度為40°C，處理時間為8h;8h之后將空氣恒溫箱的溫度調 整為60°C，處理時間為2h;然后將材料移入預先加熱熔化的純石蠟，60°C透蠟處理4h后更換 熔化的純石蠟，繼續(xù)在空氣恒溫箱中60 °C透蠟處理2h。
[0013] (6)包埋:將熔好的石蠟倒入包埋紙盒，迅速取出步驟(5)中透蠟后的材料放入包 埋紙盒，根據切片的需要用解剖針調整材料的位置;待包埋紙盒中的石蠟表面結成一層蠟 膜之后將紙盒在2~6°C冷藏條件下冷卻2h，使石蠟由溶液凝固成石蠟塊。
[0014] (7)切片:將步驟(6)中包埋后的石蠟塊經過切割、修整和固著，然后經切片機將石 蠟塊切成蠟帶，切片厚度為8~15μπι，將蠟帶保存在30 %乙醇中。
[0015] (8)展片：將經步驟(7)切片后的蠟帶放入30°C~40 °C溫水展片90~120s，使蠟帶 完全展開，蠟帶光滑一面朝下，蠟帶展片后用刀片分割蠟帶。
[0016] (9)貼片和烤片:在潔凈載玻片上，涂抹好蛋清甘油貼片劑，將分割好的蠟帶貼在 載玻片涂有貼片劑的位置上，蠟帶光滑一面朝下;然后在蠟帶上滴加蒸餾水，確保蠟帶被完 全浸過后傾斜載玻片倒掉多余的蒸餾水，將貼好切片的載玻片放入空氣恒溫箱，40 °C烤干。
[0017] (10)脫蠟復水:將步驟(9)中烤干的貼有切片的載玻片放入空氣恒溫箱中，處理溫 度為6〇 °c，使切片里的石蠟完全熔化，然后將貼有切片的載玻片依次轉入透明劑m、透明劑 Π 中分別脫蠟處理25min，再轉入到透明劑I中脫蠟處理lOmin，再依次轉入無水乙醇、95% 乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸餾水中分別復水處理5min，使石蠟完全褪去，載玻 片上只剩下留在原位的材料，即帶材料載玻片。
[0018] (11)染色:將步驟（10)中得到的帶材料載玻片轉入1 %番紅酒精溶液，常溫下染色 22~26h〇
[0019] (12)脫水和復染：
[0020] A、將經步驟（11)染色后的帶材料載玻片依次轉入70 %乙醇、80 %乙醇中分別脫水 處理2min;
[0021] B、將經A處理過的帶材料載玻片轉入0.63%的固綠酒精溶液中復染5s;
[0022] C、將經B復染后的帶材料載玻片依次轉入95%乙醇、無水乙醇中分別脫水處理 2min；
[0023] D、將經C處理過的帶材料載玻片轉入無水乙醇中脫水處理lmin，再依次轉入透明 劑I、透明劑Π 中分別透明處理5min，最后轉入透明劑ΙΠ 中透明處理2min。
[0024] (13)封片:將經步驟（12)處理后的帶材料載玻片從透明劑ΙΠ中取出，用濾紙擦去 材料以外多余的透明劑m，在透明劑m未揮發(fā)干時，在載玻片上有材料的區(qū)域滴加封片劑， 取潔凈的蓋玻片，緩慢蓋在載玻片上，使封片劑布滿整個有材料的區(qū)域，室溫下晾曬lh后即 可觀察。
[0025] 上述的步驟（1)~（12)中所用的液體的量均至少能浸沒材料;未注明溫度的操作 均在室溫下進行。
[0026]步驟(1)中所用的材料與聚羥基丙烯酸固定液的體積比為1:(10~30)。
[0027]步驟（1)中所述的密封是指用橡皮塞密封，并在橡皮塞與瓶口接觸的地方涂抹凡 士林;所述的抽真空是指用注射器抽氣3~5次。
[0028] 步驟(4)、（10)、（12)中，所述的透明劑I均為T0透明劑和無水乙醇的等體積混合 液，所述的透明劑π和透明劑m均為το透明劑。
[0029] 步驟(7)中所述的切割、修整和固著的具體操作如下：根據切片機選擇合適的臺 木，將包埋后的石蠟塊分割，按照臺木尺寸進一步將蠟塊修整成四棱臺狀，然后用酒精燈加 熱蠟塊底部使其稍熔后，迅速固著在臺木上，在蠟塊和臺木接觸處滴一圈蠟液，待其凝固后 加固蠟塊。
[0030] 步驟(9)所述的蛋清甘油貼片劑制作方法:將攪拌成泡沫狀的蛋清和甘油等體積 混合即得蛋清甘油貼片劑，加入防腐劑水楊酸鈉后，于4°C條件下可保存3個月以上。
[0031] 步驟(13)中所述的封片劑為CVmount封片劑。
[0032]本發(fā)明的機理為：
[0033] (1)本發(fā)明使用了新型固定液聚羥基丙烯酸，它滲透力強，可以大大加快固定速 度，并且可以固定均勻；它在25~30°C時不易揮發(fā)，可高溫下固定，也提高了其滲透速度，從 而加快了固定的速度，將固定時間從24h大幅縮短至lh。因卡諾氏固定液主要成分是冰醋酸 和乙醇，因此，高溫固定雖然也可提高速度，但是，因為會蒸發(fā)，且蒸發(fā)后其體積比會發(fā)生改 變，導致固定效果不佳。聚羥基丙烯酸尚未在植物中應用，因此，做植物切片的同行很難發(fā) 現(xiàn)其在植物中用作固定液的功效。
[0034] (2)使用T0透明劑替代二甲苯。T0透明劑是以松節(jié)油為主要成分的生物制片透明 劑，具有和二甲苯一致的溶解特性，也是既可以溶解酒精，又可溶解石蠟，可完全替代二甲 苯在組織透明、切片染色后透明及石蠟切片脫蠟時使用。而且，該試劑對人無毒性，可使整 個石蠟切片操作過程變?yōu)闊o毒操作。另外，T0透明劑在制片過程中作用柔和，制片材料不易 被硬化，制片易于成功，切片時也不易碎掉，制作出的石蠟切片與傳統(tǒng)方法在質量上無明顯 區(qū)別。
[0035] (3)使用封片劑CVmoun t替代中性樹膠封片，使晾片時間從48h縮短至1 h。傳統(tǒng)方法 所使用的中性樹膠中含有二甲苯，所以在封片時需要長時間晾干以使二甲苯揮發(fā)。CVmount 是一種新型的固封材料，具有較好的固封效果，且不含有二甲苯，不需要留有揮發(fā)二甲苯所 需時間，所以可大大縮短封片時間。
[0036] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及有益效果：
[0037] 1)本發(fā)明使用了新型固定液聚羥基丙烯酸，該固定液固定速度快，可以大大減少 固定時間，并且可以使固定更加均勻；它在25~30°C時不易揮發(fā)，可在高溫下固定，進一步 提高了固定的效率。
[0038] 2)同時，使用完全無毒的T0透明劑代替二甲苯，T0透明劑能溶解乙醇、石蠟和封固 樹膠，揮發(fā)性好，對常用生物染料染色無不良影響，能廣泛應用于植物、動物和人體組織的 切片制片，完全避免了使用二甲苯對操作者產生的毒害。
[0039] 3)使用封片劑CVmount替代中性樹膠，使得封片時間從48h縮短至1 h。
【附圖說明】
[0040] 圖1為傳統(tǒng)方法制備的切片(A、B)以及本發(fā)明的方法制備的切片(C、D)的顯微觀察 對比圖。
【具體實施方式】
[0041] 下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。
[0042] 本實施例中所用試劑如無特殊說明均可從市場常規(guī)購得;本實施例中所用的液體 的量均至少能浸沒材料;本實施例中未注明溫度的均可在室溫下進行。
[0043] 實施例1:
[0044] (1)取材和固定
[0045] 采用桉樹組培苗，除去莖段以外的多余組織如葉，愈傷組織等，取其基部莖段 0.5cm長。在莖段體積60倍大小的廣口玻璃小瓶中加入體積為材料20倍的聚羥基丙烯酸固 定液（由廣州市艾發(fā)生物醫(yī)學技術工程有限公司生產，固定速度是lmm/h，第一類醫(yī)療器械 生產企業(yè)登記證號：20090363，10~30 °C溫度下保存），放入莖段，塞上瓶塞。為防止空氣進 入小瓶，在橡皮塞上部和橡皮塞與小瓶瓶口接觸位置涂抹凡士林。小瓶正放于桌面，用帶針 頭(活塞推至底部)的注射器插入橡皮塞，但不深入固定液液面，進行抽氣，抽至最大程度后 拔出注射器，排出注射器中的空氣，此為一次抽真空。重復該操作4次后靜置材料，固定lh。
[0046] (2)洗滌
[0047]材料在小瓶中固定lh后打開瓶塞，取出材料放入盛有50 %乙醇的小瓶中，體積至 少為材料的30倍，塞緊瓶塞。15min后洗滌液更換為70%乙醇，間隔15min后再更換1次70% 乙醇洗滌15分鐘，然后移入70%乙醇中，同時加入0. lmL 1 %的番紅酒精溶液。
[0048] (3)脫水
[0049] 將小瓶中的材料依次移入85%乙醇脫水處理lh，95%乙醇脫水處理lh，無水乙醇 (2次)分別脫水處理40min。
[0050] (4)透明
[0051] 將脫水后的材料依次移入到裝有TO透明劑和無水乙醇的等體積混合液、TO透明劑 (T0型生物制片透明劑，廣西岑溪縣松香廠生產;T0透明劑處理2次）的玻璃瓶分別浸泡處理 lh〇
[0052] (5)透蠟
[0053]把一張濾紙疊成筒狀，底部封閉，伸入含有T0透明劑的小瓶，將與T0透明劑等體積 的碎蠟灌入濾紙筒，蓋緊。然后，放入空氣恒溫箱，處理溫度為40°C，處理時間為Shdh之后 將空氣恒溫箱的溫度調整為60°C，處理時間為2h。然后將材料移入預先加熱熔化的純石蠟 中60 °C透蠟處理4h后，更換熔化的純石蠟，繼續(xù)在空氣恒溫箱中60 °C透蠟處理2h。
[0054] (6)包埋
[0055] 將熔好的石蠟倒入包埋紙盒，迅速取出透蠟后的材料放入包埋紙盒，根據切片的 需要用解剖針調整材料的位置。待包埋紙盒中的石蠟表面結成一層蠟膜之后，將紙盒在4°C 冷藏條件下冷卻2h，使石蠟凝固成石蠟塊。
[0056] (7)修蠟
[0057] 根據切片機選擇合適的臺木，將包埋后含有材料的蠟塊分割，按照臺木尺寸，修整 蠟塊成四棱臺狀，然后用酒精燈加熱蠟塊底部使其稍熔后，迅速固著在臺木上，在蠟塊和臺 木接觸處滴一圈蠟液，待其凝固后加固蠟塊。
[0058] (8)切片
[0059]將帶有蠟塊的臺木置于切片機(KD202A輪轉式切片機，產自浙江金華科迪儀器設 備有限公司）的蠟塊嵌內，使蠟塊切面與切片平行，將石蠟塊切成蠟帶，蠟帶可暫時保存在 30%乙醇中，切片厚度為8μm。
[0060] (9)展片
[0061] 切片結束后將蠟帶轉入35°C溫水中展片100s，蠟帶光滑一面朝下。蠟帶展片后用 刀片分割蠟帶。
[0062] (10)貼片和烤片
[0063] 在潔凈的載玻片上，涂抹好甘油蛋白貼片劑(攪拌成泡沫狀的蛋清和甘油以等體 積混合制備得到），將分割后的蠟帶貼在載玻片涂好貼片劑的位置上，蠟帶光滑一面朝下； 然后，在蠟帶上滴加蒸餾水，確保蠟帶被完全浸過后，傾斜載玻片，倒掉多余的蒸餾水，將貼 好切片的載玻片放入空氣恒溫箱，40°C烤干。
[0064] (11)脫蠟復水
[0065]將烤干的貼有切片的載玻片放入空氣恒溫箱，處理溫度為60°C，使石蠟完全熔化， 然后將貼有切片的載玻片依次轉入T0透明劑(2次)分別脫蠟處理25min;再轉入到T0透明劑 和無水乙醇等比例混合液脫蠟處理1 〇min;再依次轉入到無水乙醇、95 %乙醇、90 %乙醇、 80%乙醇、70%乙醇和蒸餾水中分別復水處理5min。使石蠟完全褪去，載玻片上只剩下留在 原位的材料，即帶材料載玻片。
[0066] (12)染色
[0067]將復水后的帶材料載玻片放入1 %的番紅酒精溶液中常溫染色24h。
[0068] (13)脫水和復染
[0069]將染色后的帶材料載玻片依次轉入70%乙醇、80%乙醇分別脫水處理2min;脫水 后的帶材料載玻片轉入到ο. 63 %的固綠(cas編碼:2353-45-9，購自生工生物工程(上海)股 份有限公司）酒精溶液中復染5s;再將復染后的帶材料載玻片依次轉入到95%乙醇、無水乙 醇中分別脫水處理為2min;再轉入無水乙醇中脫水處理lmin;然后轉入TO透明劑和無水乙 醇等體積混合液、TO透明劑中分別脫水處理5min;最后轉入TO透明劑脫水處理2min。
[0070] (14)封片
[0071]將帶材料載玻片從T0透明劑中取出，用濾紙擦去材料以外多余的T0透明劑，在T0 透明劑未揮發(fā)干時，在載玻片上有材料區(qū)域滴1滴封片劑CVmount (購自徠卡顯微系統(tǒng)（上 海)貿易有限公司），取潔凈的蓋玻片，緩慢蓋在載玻片上，使CVmount布滿整個有材料區(qū)域， 室溫下晾曬lh即可進行觀察。
[0072]對比實施例1
[0073]其余操作均與實施例1相同，僅在（1)固定、（3)脫水和（14)封片環(huán)節(jié)進行了改變， 具體改變如下：
[0074]步驟(1)中固定液采用卡諾氏固定液，固定時間為24h，其余操作均與實施例1中的 步驟(1)相同。
[0075] 步驟(3)修改為:將小瓶中的材料依次移入75 %乙醇脫水處理lh，85 %乙醇脫水處 理lh，95%乙醇中脫水處理30min，95%乙醇中脫水處理30min，無水乙醇（2次)分別脫水處 理lh。
[0076] 步驟(14)中將封片劑換為中性樹膠，室溫下晾曬的時間為48h，其余操作均與實施 例1中步驟(14)中相同。
[0077] 將本發(fā)明與傳統(tǒng)方法相比，本發(fā)明所用方法在固定、脫水、透明和封片等環(huán)節(jié)進行 了優(yōu)化，大大縮短了切片制片所用時間，兩種方法在制片時間上的比較見表1，從表1可以看 出，本發(fā)明所用方法比傳統(tǒng)切片方法用時至少縮短了 72h。
[0078] 本發(fā)明采用了新的固定液、透明劑和封片劑，不僅改善了實驗環(huán)境，徹底消除了切 片制片過程中所用試劑對人的毒害，明顯縮短了時間，而且保證了制片效果，所制切片的材 料不易硬化，也不易碎掉，制作出的石蠟切片與傳統(tǒng)方法獲得的切片在質量上無明顯區(qū)別， 如圖1所示，其中A、B為傳統(tǒng)方法制備的切片的顯微觀察圖，C、D為本發(fā)明的方法制備的切片 的顯微觀察圖。
[0079] 表1傳統(tǒng)方法和本發(fā)明的方法制片耗時比較
[0080]
[OUW」上還買施例為本友明較佳的買施萬式，
但本友明的買施萬式開小受上還買施例的 限制，其他的未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的任何改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 取材和固定:取0.3~0.7cm長的桉樹幼嫩莖段或初生根作為固定的材料，將材料放 入裝有聚羥基丙烯酸固定液的玻璃瓶中，密封并抽真空，然后靜置，室溫下固定lh; (2) 洗滌:將固定后的材料取出，依次移入到裝有50 %乙醇、70 %乙醇、70 %乙醇的玻璃 瓶中，塞緊瓶塞分別洗滌13~17min，其中玻璃瓶中的液體體積均為材料的30倍以上，然后 再將材料移入裝有70%乙醇的玻璃瓶中保存?zhèn)溆?，同時加入0.05~0.20mL 1 %的番紅酒精 溶液，以便包埋時識別材料； (3) 脫水:將步驟（2)中洗滌后的材料依次移入盛有體積為材料30倍以上的85 %乙醇、 95 %乙醇、無水乙醇、無水乙醇的玻璃瓶中分別脫水處理40~60min; (4) 透明：將經步驟(3)脫水后的材料依次移入裝有透明劑I、透明劑Π 、透明劑m的玻 璃瓶中分別透明處理lh; (5) 透蠟：向步驟(4)中透明處理后的玻璃瓶中加入與瓶中透明劑m等體積的碎蠟，然 后放入空氣恒溫箱，處理溫度為40°C，處理時間為8h;8h之后將空氣恒溫箱的溫度調整為60 °C，處理時間為2h;然后將材料移入預先加熱熔化的純石蠟，60°C透蠟處理4h后更換熔化的 純石蠟，繼續(xù)在空氣恒溫箱中60°C透蠟處理2h; (6) 包埋:將熔好的石蠟倒入包埋紙盒，迅速取出步驟(5)中透蠟后的材料放入包埋紙 盒，根據切片的需要用解剖針調整材料的位置;待包埋紙盒中的石蠟表面結成一層蠟膜之 后將紙盒在2~6 °C冷藏條件下冷卻2h，使石蠟由溶液凝固成石蠟塊； (7) 切片:將步驟(6)中包埋后的石蠟塊經過切割、修整和固著，然后經切片機將石蠟塊 切成蠟帶，切片厚度為8~15μπι，將蠟帶保存在30 %乙醇中； (8) 展片：將經步驟(7)切片后的蠟帶放入30°C~40°C溫水展片90~120s，使蠟帶完全 展開，蠟帶光滑一面朝下，蠟帶展片后用刀片分割蠟帶； (9) 貼片和烤片:在潔凈載玻片上，涂抹好蛋清甘油貼片劑，將分割好的蠟帶貼在載玻 片涂有貼片劑的位置上，蠟帶光滑一面朝下;然后在蠟帶上滴加蒸餾水，確保蠟帶被完全浸 過后傾斜載玻片倒掉多余的蒸餾水，將貼好切片的載玻片放入空氣恒溫箱，40 °C烤干； (10) 脫蠟復水:將步驟(9)中烤干的貼有切片的載玻片放入空氣恒溫箱中，處理溫度為 60°C，使切片里的石蠟完全熔化，然后將貼有切片的載玻片依次轉入透明劑ΙΠ 、透明劑Π 中 分別脫蠟處理25min，再轉入到透明劑I中脫蠟處理lOmin，再依次轉入無水乙醇、95%乙醇、 90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇和蒸餾水中分別復水處理5min，使石蠟完全褪去，載玻片上 只剩下留在原位的材料，即帶材料載玻片； (11) 染色:將步驟(10)中得到的帶材料載玻片轉入1%番紅酒精溶液，常溫下染色22~ 26h； (12) 脫水和復染： A、 將經步驟（11)染色后的帶材料載玻片依次轉入70 %乙醇、80 %乙醇中分別脫水處理 2min； B、 將經A處理過的帶材料載玻片轉入0.63 %的固綠酒精溶液中復染5s; C、 將經B復染后的帶材料載玻片依次轉入95%乙醇、無水乙醇中分別脫水處理2min; D、 將經C處理過的帶材料載玻片轉入無水乙醇中脫水處理lmin，再依次轉入透明劑I、 透明劑Π 中分別透明處理5min，最后轉入透明劑ΙΠ 中透明處理2min; (13)封片:將經步驟（12)處理后的帶材料載玻片從透明劑m中取出，用濾紙擦去材料 以外多余的透明劑m，在透明劑m未揮發(fā)干時，在載玻片上有材料的區(qū)域滴加封片劑，取潔 凈的蓋玻片，緩慢蓋在載玻片上，使封片劑布滿整個有材料的區(qū)域，室溫下晾曬ih后即可觀 察。2. 根據權利要求1所述的桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于： 步驟(1)~（12)中未注明溫度的操作均在室溫下進行。3. 根據權利要求1所述的桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于： 步驟(1)~（12)中所用液體的量均至少能夠浸沒材料。4. 根據權利要求1所述的桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于： 步驟(1)中所用的材料與聚羥基丙烯酸固定液的體積比為1:(10~30)。5. 根據權利要求1所述的桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于： 步驟（1)中所述的密封是指用橡皮塞密封，并在橡皮塞與瓶口接觸的地方涂抹凡士林； 所述的抽真空是指用注射器抽氣3~5次。6. 根據權利要求1所述的桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于： 步驟(4 )、（10 )、（12)中，所述的透明劑I為TO透明劑和無水乙醇的等體積混合液，所述 的透明劑Π 和透明劑m均為TO透明劑。7. 根據權利要求1所述的桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于： 步驟(7)中所述的切割、修整和固著的具體操作如下：根據切片機選擇合適的臺木，將 包埋后的石蠟塊分割，按照臺木尺寸進一步將蠟塊修整成四棱臺狀，然后用酒精燈加熱蠟 塊底部使其稍熔后，迅速固著在臺木上，在蠟塊和臺木接觸處滴一圈蠟液，待其凝固后加固 錯塊。8. 根據權利要求1所述的桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于： 步驟(9)所述的蛋清甘油貼片劑由以下步驟制備得到：將攪拌成泡沫狀的蛋清和甘油 等體積混合即得蛋清甘油貼片劑。9. 根據權利要求1所述的桉樹組織的石蠟切片方法，其特征在于： 步驟(13)中所述的封片劑為CVmount封片劑。
【文檔編號】G01N1/28GK105973673SQ201610511965
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】韓超, 徐建民
【申請人】中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所