分離或者檢測稀有細胞的方法

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分離或者檢測稀有細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及分離或者檢測稀有細胞的方法。提供一種在血液試樣中含有稀有細胞的情況下，能夠提高小型的稀有細胞和可變形性高的稀有細胞兩者的捕獲率的血液試樣的處理方法。所述方法包括：使用過濾器對血液試樣進行過濾處理，并分離或者檢測血液試樣中的稀有細胞，所述過濾器以孔密度為40個/mm2以上2000個/mm2以下、且長軸徑w(μm)和短軸徑側的孔之間的空白z(μm)之間的比例(w/z)為7.0以上130以下的方式包括短軸徑為5μm以上8μm以下且長軸徑為40μm以上的孔。
【專利說明】
分離或者檢測稀有細胞的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及分離或者檢測血液試樣中的稀有細胞的方法、血液中循環(huán)腫瘤細胞的分析方法、W及用于它們的過濾器和稀有細胞捕獲裝置。
【背景技術】
[0002] 血液的細胞成分主要為紅細胞、白細胞、血小板，但在血液中雖然稀有但還存在除了運些之外的細胞。作為運樣的稀有細胞的一例，可W舉出血液中循環(huán)腫瘤細胞/CTC (Circulating Tumor Cell) dCTC是從原發(fā)性腫瘤組織或者轉移性腫瘤組織中游離，且浸潤在血液中的細胞?？紤]到癌細胞通過血管或者淋己管被運輸?shù)襟w內的其他部位并進行增殖導致癌的轉移，已報告血液中的CTC數(shù)量和癌的轉移的可能性W及預后有關系。因此，已知在癌(尤其是乳腺癌等的轉移性的癌）的診斷、預后診斷、或者治療效果的預測或者判斷的指標的研究中，測定血液中的CTC數(shù)量的計數(shù)、CTC的核酸。因此，關于血液中的CTC的分離和/或濃縮，提出和研究各種方法(專利文獻1~5、非專利文獻1~6等）。
[0003] 專利文獻1:日本專利特開2013-17429號公報；
[0004] 專利文獻2:日本專利特表2010-530234號公報；
[0005] 專利文獻3:日本專利第5141919號；
[0006] 專利文獻4:日本專利特開2013-42689號公報；
[0007] 專利文獻5:日本專利特開2011-163830號公報；
[000引非專利文獻 1 :Vona G，Sabile A，Louha !,Sitruk V，Romana S，Schutze K， Capron F,Franco D,Pazzagli M,Vekemans M,Lacour B,Brechot C,Paterlini-Brechot；
[0009] P.Isolation by Size of Epithelial Tumor Cells：A New Method for the Immunomorphological and Molecular Characterization of Circulating Tumor Cells，Am J Pathol.200(Uan;156(l):57-63;
[0010] 非專利文獻2:Coumans FA，van Dalum G，Beck M，Terstappen LW. (2013)Filter Characteristics Influencing Circulating Tumor Cell Enrichment from Whole Blood,Apri 11 Volume 8|Issue 4|e61770；
[0011] 非專利文獻3Jark S，Ang RR，Duffy SP，Bazov J，Chi KN，Black PC，Ma H(2014) Morphological differences between circulating tumor cells from prostate cancer patients and cultured prostate cancer cells,PLOSONE Janimry 2014 Volume 9 I Issue l|e85264；
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[0014] 非專利文獻6:R.化gishi et al.Development of the automated circulating tumor cell recovery system with microcavity array，Biosensors and Bioelectronics(2014)。

【發(fā)明內容】

[0015] 在IOml的血液中，通常含有數(shù)百億個紅細胞、數(shù)千萬個白細胞，但CTC等的稀有細胞為0~數(shù)個左右，多的時候數(shù)千個左右。另外，運些稀有細胞中含有考慮為與上述的癌的轉移之間的關聯(lián)性的細胞或者免疫細胞等醫(yī)學上重要的細胞，因此預測到今后更盛行血液中的稀有細胞的分析，要求更簡單且丟失少的方法。因此，直接分析CTC時存在很多技術問題，例如需要分離濃縮等的處理。因此，期待更有效地從血液中分離濃縮CTC的技術的開發(fā)。
[0016] 分離濃縮CTC的技術中存在幾個方法，其中已報告使用抗體的分離濃縮的技術或者利用過濾器的分離濃縮的技術(非專利文獻1)。非專利文獻1中公開了一種使用具有4祉 m的孔的過濾器、大部分的血細胞通過過濾器、使CTC殘留在過濾器上的分離濃縮技術。如非專利文獻1中公開的方法，利用過濾器的分離濃縮方法與使用抗體的分離濃縮方法不同，作為不依賴于CTC的表面抗原的方法而被期待。
[0017] CTC是對于醫(yī)療的發(fā)展非常有前途的細胞，如前述，在IOml的血液中只含有數(shù)個。在IOml中只含有2個CTC的情況下，根據(jù)泊松分布，在Iml的血液的處理時，即使能夠不遺漏地捕獲100%，也只能期待最高20%的檢測率，但在能夠大量處理血液的情況下，8ml中存在一個W上的CTC的概率接近90 %。如果增加血液處理量并增加過濾器的數(shù)量，則會變復雜，因此期望一種一次能夠適當處理更多的血液的過濾器。
[0018] 專利文獻2中公開了 CTC比血細胞尺寸大、且比血細胞可變形性低。另一方面，已報告CTC中存在比d)祉m的孔尺寸小的癌細胞(例如，非專利文獻1、2)或者可變形性高的癌細胞、且存在運些細胞的轉移性高的可能性(例如，非專利文獻4、5)。在使用CTCW高精度進行癌的診斷W及分析等時，對于運些細胞，也要求進行分離。
[0019] 因此，本公開在一個或者多個實施方式中提供一種在血液試樣中含有稀有細胞的情況下，能夠有效且簡單地捕獲小型的稀有細胞和可變形性高的稀有細胞兩者的過濾器W 及血液試樣的處理方法。
[0020] 本發(fā)明在一個或者多個實施方式中設及一種稀有細胞的分離或者檢測方法，其包括使用過濾器對血液試樣進行過濾處理，并分離或者檢測血液試樣中的稀有細胞，所述過濾器W孔密度為40個/mm2W上2000個Aim2W下、且長軸徑W(皿)和短軸徑側的孔之間的空白 Z(WH)之間的比例(w/z)為7. OW上130W下的方式包括短軸徑為扣mW上祉mW下且長軸徑為40皿W上的孔。
[0021] 本發(fā)明在一個或者多個實施方式中設及一種過濾器，該過濾器W孔密度為40個/ 1111112從上2000個/1111112從下、且長軸徑W(皿)和短軸徑側的孔之間的空白Z(皿)之間的比例(w/ Z)為7.0^上130^下的方式包括短軸徑為如111^上祉111^下且長軸徑為40^1^上的孔。
[0022] 本發(fā)明在其他一個或者多個實施方式中設及一種用于捕獲試樣中含有的稀有細胞的稀有細胞捕獲裝置，其包括供應口、排出口、用于連通所述供應口和所述排出口的流道、W及分離部，所述分離部被配置在相當于所述流道的一部分的位置上，并包括上述的過濾器W及過濾器保持部。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明，在一個或者多個實施方式中，在血液試樣中含有稀有細胞的情況下，能夠有效且簡單地捕獲小型的稀有細胞和可變形性高的稀有細胞兩者。
【附圖說明】
[0024] 圖1的AW及圖1的B示出過濾器的照片，圖1的A是本發(fā)明的過濾器(孔形狀為狹縫形狀)的一例，圖1的B是比較例的過濾器(孔形狀為楠圓）的一例；
[0025] 圖2示出本發(fā)明的稀有細胞捕獲裝置的一例；
[0026] 圖3是示出實施例1的結果的圖，圖3是短軸徑中的小型的細胞的SW620的捕獲率的結果；
[0027] 圖4是示出實施例2的結果的圖；
[0028] 圖5是示出實施例3的結果的圖；
[0029] 圖6是示出實施例4的結果的圖；
[0030] 圖7的AW及圖7的B是示出實施例5的結果的圖，圖7的A是系統(tǒng)整體的過濾壓力（A Pl)為0.4kPa的結果，圖7的B是系統(tǒng)整體的過濾壓力（A Pl)為1.3kPa的結果；
[0031 ]圖8是示出實施例8的結果的圖；
[0032] 圖9是示出實施例9的結果的圖；
[0033] 圖10是示出實施例10的結果的圖；
[0034] 圖11是示出實施例11的結果的圖；
[0035] 圖12是示出實施例12的結果的圖。
【具體實施方式】
[0036] 本
【發(fā)明人】們從專利文獻1~4W及非專利文獻1~5的方法中發(fā)現(xiàn)W下的問題。
[0037] 非專利文獻1中公開的過濾器的孔密度不均勻，孔連結，可能變成比細胞大的孔，因此存在細胞容易逃離且不能獲得高的捕獲率的問題。
[0038] 在專利文獻IW及非專利文獻2中，為了捕獲小型的細胞，嘗試通過使孔徑變小來提高捕獲率，但在4 SwnW下時，容易發(fā)生堵塞，并存在高壓力引起的對細胞的破損、用于減少血細胞的溶血操作、過濾器的過濾尺寸變大等變復雜的問題。
[0039] 專利文獻2公開了利用血液和血液W外的細胞的粘彈性的不同而分離稀有細胞的內容。但是，在專利文獻2中記載的條件中，存在W下問題:分離時的過濾膜的兩側產生的壓力差為較高的20k化~190kPa，分離時可能給稀有細胞帶來破損，并且難W捕獲可變形性高的稀有細胞。
[0040] 專利文獻3公開使用具備錐形部、狹窄部W及倒錐形部的狹縫過濾器而捕獲CTC的內容。專利文獻4W及非專利文獻5中記載了具有狹縫形狀的孔的過濾器中的稀有細胞的分離濃縮。但是，在專利文獻4W及非專利文獻5中記載的過濾器中，存在處理大量的血液、且不能同時進行可變形性大的細胞和小型的癌細胞的捕獲兩者。尤其在專利文獻4的實施例中記載的過濾器中，在處理8~IOml的血液時，存在小型的癌細胞或者可變形性大的癌細胞的捕獲率降低、不能處理大量的血液量的問題。
[0041] 本發(fā)明基于W下而作出的:在減小過濾器的孔徑時難W進行可變形性高的細胞的捕獲，并在配合可變形性高的細胞的捕獲率而增大孔徑時小型的細胞容易脫離，進一步地，在圓形孔的過濾器中難W同時進行小型和可變形性高的癌細胞的捕獲。本發(fā)明基于W下而作出：在一個或者多個實施方式中，通過使用W孔密度為40個Aim2W上2000個/mm2W下、且長軸徑W(WH)和短軸徑側的孔之間的空白Z(WH)之間的比例(w/z)為7. OW上130 W下的方式包括短軸徑為扣mW上祉mW下且長軸徑為40wiiW上的孔的過濾器而進行血液試樣的過濾處理，由此能夠有效且簡單地捕獲血液試樣中可能含有的小型的稀有細胞和可變形性高的稀有細胞兩者。本發(fā)明基于W下而作出的:在一個或者多個實施方式中，通過使用上述過濾器而進行血液試樣的過濾處理，能夠降低過濾處理時的過濾壓力條件（系統(tǒng)整體中的過濾壓力或者過濾處理時的過濾器上表面和下表面之間的壓力差），其結果為，能夠進一步地提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率，優(yōu)選能夠降低細胞捕獲時給細胞帶來的破損，能夠進行活著的狀態(tài)下的稀有細胞的回收。本發(fā)明基于W下而作出：在一個或者多個實施方式中，通過使用上述過濾器進行血液試樣的過濾處理，例如尤其在針對過濾器的每個孔的過濾處理容量多的情況下，與楠圓孔或者圓孔的過濾器相比，能夠降低試樣間的差異引起的稀有細胞的捕獲率的偏差，優(yōu)選的是，即使是具有高濃度的血細胞比容或者白細胞的濃度的試樣，也可W W高捕獲率捕獲稀有細胞。本發(fā)明基于W下而作出：在一個或者多個實施方式中，在處理8~1 Oml左右的大量的血液的情況下，有時稀有細胞的捕獲率降低，但通過使用上述的本公開的過濾器、且過濾處理血液試樣使得在換算成與過濾器的每個孔面積對應的處理容量時針對過濾器的每個孔的過濾器處理容量為0.1 nlAim2 W上化1/皿2 W下，由此能夠進一步提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率。運里，"針對每個孔的過濾器處理容量"是指通過一個孔能夠處理的血液試樣的量。
[0042] 本發(fā)明的方法是使用過濾器的方法，因此在一個或者多個實施方式中，為了區(qū)別過濾器中捕獲的血細胞成分W及CTC等的細胞，例如能夠容易進行細胞的染色W及清洗，并能夠容易觀察過濾器中捕獲的細胞。在過濾器上進行細胞的染色W及清洗或者細胞的觀察的情況下，當過濾面積變大時，試劑量W及清洗量并且觀察范圍增大并變得復雜，因此期待抑制過濾面積的過濾器或者抑制體積的過濾器殼體。根據(jù)本發(fā)明的方法，在一個或者多個實施方式中，能夠發(fā)揮相對于血液處理量抑制過濾器的過濾面積的效果。
[0043] [稀有細胞]
[0044] 在本發(fā)明中，可能包含在血液中或者血液試樣中的"稀有細胞"是指可能包含在人或者人W外的動物的血液中的細胞成分(紅細胞、白細胞W及血小板）W外的細胞。在一個或者多個實施方式中，作為稀有細胞可W舉出腫瘤細胞和/或癌細胞。通常，在血液中循環(huán) 的腫瘤細胞或者癌細胞是指CTC。作為血液中的稀有細胞，根據(jù)試樣，血液IOml中有時含有數(shù)個~數(shù)十個、多時數(shù)百個~數(shù)千個。在一個或者多個實施方式中，"稀有細胞"是選自由癌細胞、循環(huán)腫瘤細胞、血管內皮細胞、血管內皮祖細胞、癌干細胞、上皮細胞、造血干細胞、間充質干細胞、胎兒細胞、干細胞及其組合組成的組中的細胞。
[0045] [小型的稀有細胞]
[0046] 本發(fā)明中的"稀有細胞"是指稀有細胞中的直徑小的細胞，在一個或者多個實施方式中，可W舉出能夠從直徑約為IOwii的圓孔中脫離的大小的稀有細胞。
[0047] [可變形性高的稀有細胞]
[004引本發(fā)明中的"可變形性高的稀有細胞"是指細胞大小為10皿W上、且可W通過直徑為扣mW上6. SwnW下的圓形的過濾孔的細胞。在一個或者多個實施方式中，作為可變形性高的稀有細胞，可W舉出在每個孔的血液試樣處理量為Hnl W上且每個孔為5nl/minW上 20nl/minW下、并向具備直徑為扣mW上6. SwnW下的圓孔的過濾器中輸送全血的情況下，相比相同程度的尺寸的稀有細胞更容易通過孔(通過孔的細胞的比率多）的稀有細胞。在一個或者多個實施方式中，作為可變形性高的癌細胞，可W舉出SNU-I等。
[0049] [血液試樣]
[0050] 本發(fā)明中的"血液試樣"是指能夠應用到本發(fā)明的處理方法中的、含有構成血液的成分的樣品，可W舉出含有血液、紅細胞成分的血液來源物、混合血液或者血液來源物的體液或者尿、W及由它們調制的樣品等。作為血液，可W舉出從活體中采集的血液，作為所述活體，可W舉出人或者人W外的動物(例如，哺乳類）。作為含有紅細胞成分的血液來源物，可W舉出從血液中分離或者調制的且含有紅細胞成分的或者其稀釋/濃縮物，例如包括去除血漿的血細胞成分、血細胞濃縮物、血液或者血細胞的凍干燥物、溶血處理全血且去除紅細胞的成分的樣品或者溶血樣品、離屯、分離血液、自發(fā)沉淀血液、清洗血細胞、或者特定的成分等。在運些之中，在沒有限制的一個或者多個實施方式中，從簡單且迅速處理的觀點W 及抑制對血液中的稀有細胞的破損觀點出發(fā)，作為含有所述血液的樣品，優(yōu)選含有血液或者血細胞成分的源自血液的血細胞。
[0051] 在本發(fā)明中，通過過濾器的每個孔的血液試樣的容量W從人體中采集的血液、即每化1含有1000~20000個白細胞的血液為基準。因此在使用稀釋的血液試樣的情況下，基于白細胞數(shù)量，能夠將該稀釋血液試樣換算成稀釋前的血液試樣容量。即，例如在處理10倍稀釋的血液試樣的情況下，處理「X山1/孔的容量的所述稀釋血液試樣相當于處理「X/10山 1/孔的容量的所述稀釋血液試樣。
[0052] [血液試樣的處理方法]
[0053] 在一個方式中，本發(fā)明設及包含過濾處理血液試樣的方法（W下，也稱為"本發(fā)明設及的處理方法"）。
[0化4] <過濾器〉
[0055] 在一個或者多個實施方式中，用于本發(fā)明設及的處理方法中的過濾處理的過濾器是具有多個貫通孔的狹縫形狀的過濾器，各孔的短軸徑為扣mW上祉mW下、且長軸徑為40y mW上。在一個或者多個實施方式中，形成于過濾器中的多個貫通孔中優(yōu)選其尺寸實質上均勻，更優(yōu)選短軸徑W及長軸徑實質上相同。在一個或者多個實施方式中，作為短軸徑實質上相同，可W舉出過濾器中含有的貫通孔的短軸徑被包含在通過下述方法獲得的短軸徑的平均值±1皿W內、±0.5皿W內、±0.4皿W內、±0.3皿W內或者±0.2皿W內。另外，作為長軸徑實質上相同，可W舉出被包含在通過與上述同樣的方法獲得的長軸徑的平均值±3wii W內、±2皿W內、±1皿W內、±0.5皿W內、±0.3皿W內或者±0.2皿W內。
[0056] 在一個或者多個實施方式中，從提高小型的稀有細胞的捕獲率的觀點出發(fā)，短軸徑是5皿W上、大于5皿、5.5]im W上、6皿W上或者6.5皿W上，從相同的觀點出發(fā)，短軸徑是8 皿W下、小于8皿、7.5皿W下、7皿W下或者6.5皿W下。本發(fā)明中的"短軸徑"是指外切到孔的長方形的短邊(參照圖1的A)。例如使用金屬顯微鏡、激光顯微鏡等的市售的光學顯微鏡或者電子顯微鏡，通過附帶于所述顯微鏡的軟件或者市售的圖像分析軟件W公知的方法進行測定(50個W上），并求出其平均，由此獲得短軸徑。具體而言，通過實施例中記載的方法能夠求出。
[0057]在一個或者多個實施方式中，從提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率的觀點出發(fā)，長軸徑是40皿W上、50皿W上、60皿W上、70皿W上或者80皿W上，從抑制過濾器的偏轉或者污垢等的發(fā)生、并提高稀有細胞的捕獲率的觀點出發(fā)，長軸徑是SOOOwnW下、4000皿W 下、3000皿W下、2000皿W下、lOOOum W下、970皿W下、900皿W下、800皿W下、700皿W下、 eOOjimW下、SOOiimW 下、400]imW下、300]imW 下、200]imW下、ISOtimW下、120]imW下、lOOumW 下、gOwnW下或者SOwiiW下。本發(fā)明中的"長軸徑"是指外切到孔的長方形的長邊(參照圖1 的A)。長軸徑例如使用金屬顯微鏡、激光顯微鏡等的市售的光學顯微鏡或者電子顯微鏡，通過附帶于所述顯微鏡的軟件或者市售的圖像分析軟件W公知的方法進行測定(50個W上），并求出其平均，由此獲得長軸徑。具體而言，通過實施例中記載的方法，能夠求出。
[005引用于本發(fā)明設及的處理方法中的過濾處理的過濾器W40個Aim2W上2000個Aim 2W 下的孔密度包含具有上述的短軸徑W及長軸徑的孔。從進一步提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率的觀點、W及抑制過濾面積的觀點出發(fā)，孔密度(每Imm2的孔的數(shù)量)是45個Aim2W 上、60 個/mm2 W 上、70 個/mm2w 上、90 個/mm2w 上、200 個/mm2 W 上、300個/mm2 W 上、400個/mm2 W上、500個/mm2 W上、600個/mm2 W上或者700個/mm2 W上，從相同的觀點出發(fā)，孔密度是 1500個/mm2W下、1000個/mm2W下、900個/mm2W下或者800個/mm 2W下。通過公知的方法，能夠測定孔密度。例如W市售的光學顯微鏡中使用10倍~100倍的物鏡拍攝圖像，并使用所述顯微鏡中附帶的軟件或者市售的圖像分析軟件而能夠從圖像計算。
[0059] 過濾器的過濾面中包含的孔的總數(shù)能夠通過將過濾面積除W孔的中屯、之間的間隔的方法而能夠求出。另外，除此之外，用孔密度乘W過濾面積的方法能夠求出。具體而言，通過實施例中記載的方法能夠求出。
[0060] 在用于本發(fā)明設及的處理方法中的過濾處理的過濾器中，具有上述的短軸徑W及長軸徑的孔形成為使得長軸徑W(WH)和短軸徑側的孔之間的空白Z(WIi))之間的比例(w/z) 為7.OW上130W下。從提高小型的稀有細胞和可變形性高的稀有細胞兩者的捕獲率的觀點、W及能夠降低試樣之間差異的分散的觀點出發(fā)，w/z是7.3W上、超過7.3、7.5W上、8.0 W上、8.5W上或者9.OW上或者IOW上，從抑制過濾器的偏轉或者污垢等的發(fā)生、并提高稀有細胞的捕獲率的觀點出發(fā)，w/z是130W下、129W下、120W下、IOOW下、90W下、80W下或者70W下。
[0061] 本發(fā)明中的"短軸徑側的孔之間的空白（Z)"是指連結分別與鄰接短軸徑方向上的孔外切的長方形之間的直線之中最短的直線。從提高小型的稀有細胞和可變形性高的稀有細胞兩者的捕獲率的觀點、W及能夠降低試樣之間差異的偏差的觀點出發(fā)，短軸徑側的孔之間的空白（Z)是60皿W下、50]imW下、40皿W下、30皿W下、20皿W下、10皿W下，從抑制過濾器的偏轉或者污垢等的發(fā)生、并提高稀有細胞的捕獲率的觀點出發(fā)，短軸徑側的孔之間的空白（Z)是4miW上、5皿W上、6皿W上、7皿W上、7.5皿W上、祉mW上、9皿W上、10皿W 上。
[0062] 例如使用金屬顯微鏡、激光顯微鏡等的市售的光學顯微鏡或者電子顯微鏡，通過附帶于所述顯微鏡的軟件或者市售的圖像分析軟件W公知的方法進行測定(50個W上），并求出其平均，由此獲得短軸徑側的孔之間的空白（Z)。具體而言，通過實施例中記載的方法，能夠求出。
[0063] 在一個或者多個實施方式中，從進一步提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率W及抑制過濾面積的觀點出發(fā)，用于過濾處理中的過濾器的每個孔的面積是200wii2W上7000WI12W下。從相同觀點出發(fā)，每個孔的面積是250皿2從上、260皿2從上、300皿 2從上、350皿2從上、 390皿2 W上、400皿2 W上、500皿2 W上或者55化Hi2W上，從相同觀點出發(fā)，每個孔的面積是 6800)1111? 下、6500)1111? 下、6300)1111? 下或者6000)1111? 下。
[0064] 在一個或者多個實施方式中，從進一步提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率W及抑制過濾面積的觀點出發(fā)，過濾器的開口率是10% W上60% W下。運里，開口率是指形成孔的表面積相對于過濾器表面積的比例。從相同觀點出發(fā)，過濾器的開口率是15% W上、20% W上、25% W上、30% W上、31 % W上、35% W上或者40% W上，從相同觀點出發(fā)，過濾器的開口率是55% W下或者45% W下。通過公知的方法，能夠測定開口率。例如使用市售的光學顯微鏡中的10倍~100倍的物鏡拍攝圖像，并使用所述顯微鏡中附帶的軟件或者市售的圖像分析軟件而能夠從圖像中求出。
[0065] 在一個或者多個實施方式中，從提高小型的稀有細胞和可變形性高的稀有細胞兩者的捕獲率的觀點出發(fā)，過濾器的厚度是1皿W上100皿W下。從降低過濾器的堵塞、且提高稀有細胞的捕獲率的觀點出發(fā)，過濾器的厚度是60曲iW下、50曲iW下、40曲iW下、30皿W下、 20皿^下、15皿^下或者lOwnW下，從同樣的觀點出發(fā)，過濾器的厚度是2]imW上、3皿W上、 4)1111^上、511111^上。
[0066] 對于過濾器的材質，沒有特別的限制，但在一個或者多個實施方式中，可W舉出主要成分為聚碳酸醋（PC)、聚對二甲苯膜過濾器、楊氏模量IG化W上的塑料材料、或者儀 (Ni )、SUS、金、銀、銅、侶、鶴、銘等的金屬、或者玻璃材料。另外，在觀察過濾器上的細胞時，優(yōu)選選擇與觀察時使用的染料或者巧光染色等對應的塑料、金屬玻璃材料，可W由運些組合組成。
[0067] 通過用于制作過濾器的現(xiàn)有的公知的方法，能夠制作用于本發(fā)明設及的處理方法中的過濾器。作為制作過濾器的方法，例如可W舉出蝕刻、電鑄加工、激光加工、瓣射加工。過濾器可W根據(jù)目標從孔被整體或者部分圖案化的板材中切出適當?shù)某叽缍谱?，也可W 通過鑄造方法制造一張板材。
[006引 <過濾處理條件〉
[0069] 在一個或者多個實施方式中，本發(fā)明設及的處理方法中的過濾處理能夠通過在流道內組裝上述的過濾器、并將血液試樣導入流道內，由此捕獲CTC等的稀有細胞。
[0070] 從進一步提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率的觀點出發(fā)，本發(fā)明設及的處理方法包括過濾處理血液試樣，使得在換算成與過濾器的每個孔面積對應的處理容量時，針對過濾器的每個孔的過濾器處理容量為0.1 nl/皿2W上3.OnlAim2W下。從抑制過濾面積的觀點出發(fā)，針對過濾器的每個孔的過濾器處理容量為0.1 nlAim2W上或者0.化IAim2W上，從捕獲可變形性高的癌細胞的觀點出發(fā)，過濾器處理容量為2. SnlAim2 W下、SnlAim2W下、 1.5]11/皿2^下或者1]11/皿2^下。
[0071 ]從進一步提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率的觀點、W及減少給過濾處理時捕獲的細胞帶來的破損的觀點出發(fā)，本發(fā)明設及的處理方法中的過濾處理的過濾壓力（APi) 為0.1 kPaW上2.化化W下。從相同觀點出發(fā)，過濾壓力為0.1 kPaW上或者0.化化W上，從相同觀點出發(fā)，過濾壓力為1.化化W下、1.3kPa W下、1. OkPa或者0.化化W下。本發(fā)明中的"過濾處理的過濾壓力"是指從系統(tǒng)的入口至出口為止的系統(tǒng)整體的壓力差，例如指含有包含從配置血液試樣的罐至廢液罐為止的流道的系統(tǒng)的壓力差。因此，根據(jù)流道構造，也可W是記載W上的壓力。過濾處理的過濾壓力（系統(tǒng)的壓力差)通過公知的方法并使用市售的壓力計能夠測定，或者從流道和流道結構的關系中計算出。
[0072] 從進一步提高可變形性高的稀有細胞的捕獲率的觀點、W及減少給過濾處理時捕獲的細胞帶來的破損的觀點出發(fā)，在一個或者多個實施方式中，本發(fā)明設及的處理方法中的過濾處理時的過濾器上表面和下表面之間的壓力差（A P2)為IOOPaW下。從相同觀點出發(fā)，在一個或者多個實施方式中，AP2為0.IPaW上或者IPaW上，從相同觀點出發(fā)，AP2為 70化W下、50PaW下、30PaW下、15PaW下或者10化W下。本發(fā)明中的"過濾器上表面和下表面之間的壓力差（AP2)"是指W過濾器為邊界上下上產生的壓力差(參照圖2)。通過公知的計算式，能夠計算出壓力差。作為狹縫過濾器的壓力差的計算方法，通過A P2 = Q/N0X 12化/ [(1-0.63)化/W)] X (IA3W)計算，其中，Q為總孔總計平均流量、h為短軸徑、W為長軸徑、L為孔的流道長度、n為輸送的液體的粘性、n為圓周率、No為孔的數(shù)量。血液是非牛頓液體，另夕h即使在系統(tǒng)處于相同壓力差，由于血細胞比容化Ct)不同引起的粘性，而改變平均流速。因此，平均流速具有一定的范圍。在使用全血時的壓力差的AP2設定中，為了方便，使用Il = 4.5mPa ? S，并且只要W計算時進入所述AP2內的方式設定輸送液體或者壓力即可。在因稀釋等引起血液試樣的血細胞比容值化Ct)小于20的情況下，只要設定為使用n = l~2mPa ? S 的值計算時進入所述A P2內即可?；蛘撸谙♂尩窖獫{或者Hct引起的粘性影響變小為止的情況(例如，將全血稀釋4~10倍的情況)下，根據(jù)該稀釋液的粘性計算并輸送液體即可。在使用注射累等進行定流量輸送液體的情況下，輸送液體使得進入所述A P2即可。關于運樣的輸送液體的條件，本領域技術人員使用公知的能W-定的壓力輸送液體的機構或者W - 定流量能夠輸送液體的機構而能夠實現(xiàn)。
[0073] 對于本發(fā)明設及的處理方法中的過濾處理中的過濾面積，沒有特別限制。在一個或者多個實施方式中，通過孔的數(shù)量(孔面積)和血液的處理量能夠設定過濾面積。從抑制過濾面積且減少過濾處理后的染色操作W及標記操作的試劑使用量的觀點、觀察操作的方面W及有效捕獲稀有細胞的觀點出發(fā)，一個或者多個實施方式中，過濾面積是5mm2 W上 200mm2 W下。從相同觀點出發(fā)，過濾面積為1 Omm2 W上，從相同觀點出發(fā)，過濾面積為150mm2 W下、IOOmm2W下或者SOmm2W下。另外，從抑制相對于血液處理量的過濾器的過濾面積的觀點出發(fā)，過濾面積為1 OOmm2 W下、SOmm2 W下、50mm2 W下、40mm2W下、30mm2W下或者25mm2 W 下。
[0074] 對于本發(fā)明的處理方法中的過濾處理中的向流道輸送血液試樣，沒有特別的規(guī) 定，只要有能夠輸送液體的驅動力即可。作為向流道的血液試樣的導入，在一個或者多個實施方式中，能夠例示使用從流道入口方向加壓的方法、使用從流道的出口方向減壓的方法、使用注射累或者蠕動累的方法等。由于向流道導入血液試樣，因此針對過濾器的每個孔（1 個似Imm/minW上600mm/minW下的平均流速輸送血液試樣，由此與現(xiàn)有例相比，能夠適當捕獲稀有細胞。在一個或者多個實施方式中，血液試樣的輸送條件為2mm/minW上300mm/ minW下的流速、3mm/minW上lOOmm/minW下的流速、4mm/minW上80mm/minW下的流速或者4mm/min W上40mm/min W下的流速。另外，可W從平均流量換算并設定輸送液體條件。作為計算方法，測定單位時間的過濾廢液出口的流量(總孔總計平均流量)或者單位流量的過濾時間并求出平均流量，并將其除W孔的數(shù)量，由此獲得各孔的平均流量。另外，通過平均流量除W孔面積，能夠求出平均流速。并且，只要W進入在前述各孔的平均流速或者平均流量的范圍內的方式輸送液體即可。在一個或者多個實施方式中，可W過濾廢液出口的流量 (總孔總計平均流量)除W總孔面積而計算。
[0075] [血液試樣中的稀有細胞的分離或者檢測方法]
[0076] 通過進行本發(fā)明設及的處理方法中的過濾處理，在過濾血液試樣之后的過濾器上殘留稀有細胞(如果存在），能夠進行稀有細胞的分離或者檢測。因此，本發(fā)明在其他方式中設及分離或者檢測血液試樣中的稀有細胞的方法，其包括通過本發(fā)明設及的處理方法處理血液試樣而進行稀有細胞的分離或者檢測。
[0077] [對血液中的稀有細胞的標記處理]
[0078] 在本發(fā)明設及的處理方法中，可W進行對血液中的稀有細胞的標記處理。在一個或者多個實施方式中，標記處理可W在通過過濾處理進行的細胞的分離之前進行，可W在分離時并行進行，也可W在分離之后進行。稀有細胞的標記在上述的本發(fā)明設及的分離或者檢測方法W及后述的CTC數(shù)量測定方法中有用，另外，可W在分離之后的稀有細胞的分析中有用。因此，在一個或者多個實施方式中，本發(fā)明設及的處理方法包括標記處理。另外，稀有細胞的標記在后述的CTC數(shù)量測定方法中有用，另外，可W在分離之后的稀有細胞的分析中有用。因此，在一個或者多個實施方式中，本發(fā)明設及的分離或者檢測方法包括標記處理。
[0079] 在一個或者多個實施方式中，標記處理能夠通過使公知的標記試劑接觸稀有細胞而進行，典型地，能夠通過使所述標記試劑混合到血液試樣而進行。對于標記，沒有特別的限制，在一個或者多個實施方式中，可W舉出放射性標記、巧光染料標記、染料染色或者標記、磁性標記、電荷標記及其組合，能夠通過適合它們的標記試劑而進行。
[0080] 目P，標記處理能夠使用標記方法對稀有細胞進行標記，其中，該標記方法是能夠用于選自利用發(fā)射性物質的檢測方法、利用發(fā)光現(xiàn)象的檢測方法、使用染料的檢測方法、利用磁性的檢測方法、電檢測方法、光檢測方法及其組合的組中的檢測方法。
[0081] 在本發(fā)明中的處理方法中，稀有細胞的分離或者檢測還能夠通過電、重量、光學的方法檢測所述過濾器的變化來實現(xiàn)。
[0082] [血液試樣中的稀有細胞的分析方法]
[0083] 本發(fā)明在其他方式中可W設及血液試樣中的稀有細胞的分析方法，其包括在通過本發(fā)明設及的分離或者檢測方法進行稀有細胞的分離或者檢測之后、通過包含該細胞的動態(tài)的觀察或者活性測定的方法進行分析或該細胞的基因分析。即，根據(jù)本發(fā)明，能夠捕獲活細胞，因此在通過本發(fā)明設及的分離或者檢測方法分離或者檢測了稀有細胞之后，能夠通過包含該細胞的動態(tài)的觀察或者活性測定的方法進行分析或者該細胞的基因分析。另外，可W在分離之后回收，并進行培養(yǎng)。除此之外，可W對目標細胞在過濾器上分析基因，或者從過濾器中回收目標細胞并分析基因。例如，存在染色體的分析或者單堿基的分析等，通過公知的技術而能夠分析基因。
[0084] [ CTC數(shù)量測定方法]
[0085] 已報告血液中的CTC數(shù)量和癌的轉移或者預后相關的內容，已知為了作為癌的診斷、預后診斷W及治療效果的預測或者判斷的指標而進行研究、且測定血液中CTC數(shù)量的內容。根據(jù)本公開設及的處理方法和/或本發(fā)明設及的分離或者檢測方法，能夠抑制對作為稀有細胞的CTC的破損并能夠分離。因此，本公開在其他方式中設及所述血液試樣中的CTC數(shù) 量的測定方法，其包括通過本公開設及的處理方法處理血液試樣而進行稀有細胞的分離或者檢測和/或通過本公開設及的分離或者檢測方法而從所述血液試樣中分離CTC。此外，CTC 數(shù)量的計測或者CTC的核酸的測定例如可W與基于癌細胞的形態(tài)觀點的測定、或者進行適當?shù)臉擞浱幚碇蟮耐ㄟ^流式細胞儀的分離同時進行，也可W在顯微鏡下觀察并測定已分離的細胞。
[0086] [過濾器]
[0087] 本發(fā)明在另一個方式中設及一種過濾器，其用于本公開設及的處理方法、本公開設及的分離或者檢測方法和/或本公開設及的CTC數(shù)量測定方法，該過濾器W孔密度為40 個/mm2 W上2000個/mm2 W下、且長軸徑W (WH)和短軸徑側的孔之間的空白Z (WH)之間的比例 (w/z)為7.0^上130^下的方式包括短軸徑為扣111^上祉111^下且長軸徑為40^1^上的孔。本發(fā)明設及的過濾器的孔的形狀等與用于上述的本發(fā)明設及的處理方法的過濾器相同。
[0088] [稀有細胞捕獲裝置]
[0089] 本公開在另一個方式中設及一種用于捕獲試樣中含有的稀有細胞的稀有細胞捕獲裝置。在一個或者多個實施方式中，本發(fā)明設及的稀有細胞捕獲裝置具有供應口、排出口、用于連通所述供應口和所述排出口的流道、W及分離部，所述分離部配置于相當于所述流道的一部分的位置上，并包括本公開的過濾器和過濾器保持部。根據(jù)本公開設及的稀有細胞捕獲裝置，使用本發(fā)明設及的過濾器能夠進行本發(fā)明設及的血液試樣的處理方法。
[0090] 圖2示出本發(fā)明設及的稀有細胞捕獲裝置的一例。圖2所示的稀有細胞捕獲裝置具有用于向過濾器供應試樣、清洗液或者染色液等的供應口 1、排出口 2、用于連通供應口 1和排出口 2的流道3、W及配置于相當于流道3的一部分的位置上的分離部。分離部包括過濾器 4W及用于保持過濾器4的過濾器保持器5。過濾器保持器5由能夠設置過濾器4的支承部(底座)6、用于固定過濾器4的0環(huán)7W及罩8構成。通過在支承部(底座)6上設置過濾器4、過濾器 4的上表面上載置0環(huán)7W及罩8、固定過濾器4,由此形成具備具有孔的過濾器的分離部(過濾裝置）。用于連接供應口 1和分離部W及分離部和排出口 2的流道3通過在分離部的兩端上連接軸管(Safeed tubes)(泰爾茂制造)而被形成。用于連接供應口 1和分離部的流道3可W 在分離部的上部配置連接部（未圖示）W及能夠進行液體的切換的=路活塞（未圖示）。另夕h可W在連接供應口 1和分離部的流道3(作為由一定壓力能夠輸送液體的機構或者由一定流量能夠輸送液體的機構）中通過配置加壓裝置9并使得施加到過濾中的壓力變成一定，或者由注射累抽出使得施加到過濾中的壓力變成一定W上，由此輸送液體。
[0091] 本公開設及的稀少細胞的分離盒或分離設備包括本公開的過濾器和保持所述過濾器的保持部，構成為能夠相對于流路裝卸。在一個或多個實施方式中，本公開設及的稀少細胞的分離盒或分離設備是用于稀少細胞捕獲裝置的稀少細胞的分離盒或分離設備，包括本公開的過濾器、保持所述過濾器的保持部和連接部，所述連接部能夠連接所述保持部和所述稀少細胞捕獲裝置的流路，來自所述稀少細胞捕獲裝置的血液試樣能夠在所述保持部和所述過濾器中流通，所述分離盒或分離設備構成為能夠相對于所述稀少細胞捕獲裝置裝卸。由此，在本公開設及的稀少細胞捕獲裝置的一個或多個實施方式中，流路也可W包括能夠裝卸本公開設及的稀少細胞的分離盒或分離設備的連接部。W圖2的稀少細胞捕獲裝置為例進行說明，本方式的稀少細胞捕獲裝置在流路3的、加壓裝置9和分離部之間、W及分離部和排出口 2之間的各個中包括連接部，通過連接部分離部能夠從流路3裝卸。此外，如此，相對于流路3能夠裝卸地形成的分離部是本公開設及的稀少細胞的分離盒或分離設備的一例。但是，本公開的稀少細胞的分離盒或分離設備不限于運樣的構成。
[0092] 本發(fā)明能夠設及W下的一個或者多個實施方式。
[0093] (1)-種稀有細胞的分離或者檢測方法，其包括使用過濾器對血液試樣進行過濾處理，并分離或者檢測血液試樣中的稀有細胞，
[0094] 所述過濾器W孔密度為40個Aim2W上2000個Aim2W下、且長軸徑W (皿)和短軸徑側的孔之間的空白Z (皿)之間的比例(w/z)為7.0 W上130 W下的方式包括短軸徑為扣m W上祉 mW下且長軸徑為40皿W上的孔。
[00M] (2)如（1)所述的方法，其中，
[0096] 過濾處理血液試樣，使得在換算成與過濾器的每個孔面積對應的處理容量時針對過濾器的每個孔的過濾器處理容量為0.1 nlAim2W上化IAim2W下。
[0097] (3)如（1)或(2)所述的方法，其中，
[009引所述過濾器的開口率為10% W上60% W下。
[0099] (4)如（1)至(3)中任一項所述的方法，其中，
[0100] 所述過濾處理中的過濾壓力為0.化化W上2.化化W下。
[0101] (5)如（1)至(4)中任一項所述的方法，其中，
[0102] 所述過濾處理時的過濾器上表面和下表面之間的壓力差為IOOPaW下。
[0103] (6)如（1)至(5)中任一項所述的方法，其中，
[0104] 所述血液試樣W所述過濾器的每個孔Imm/minW上600mm/minW下的平均流速向所述過濾器輸送液體。
[0105] (7)如（1)至(6)中任一項所述的方法，其中，
[0106] 所述稀有細胞是選自由癌細胞、循環(huán)腫瘤細胞、血管內皮細胞、血管內皮祖細胞、癌干細胞、上皮細胞、造血干細胞、間充質干細胞、胎兒細胞、干細胞及其組合組成的組中的細胞。
[0107] (8)-種血液試樣中的稀有細胞的分析方法，其包括：
[0108] 通過（1)至(7)中任一項所述的方法分離或者法檢測稀有細胞之后，通過包含該細胞的動態(tài)的觀察或者活性測定的方法進行分析或者該細胞的基因分析。
[0109] (9)-種過濾器，其用于（1)至(7)中任一項所述的方法，W孔密度為40個Aim2W上 2000個Aim2W下、且長軸徑W(WH)和短軸徑側的孔之間的空白Z(皿)之間的比例(w/z)為7.0 W上130W下的方式包括短軸徑為如mW上祉mW下且長軸徑為40wiiW上的孔。
[0110] (10)-種用于捕獲試樣中含有的稀有細胞的稀有細胞捕獲裝置，其具有供應口、排出口、用于連通所述供應口和所述排出口的流道、W及分離部，所述分離部被配置在相當于所述流道的一部分的位置上，并包括上述的過濾器W及過濾器保持部。
[0111] (11)-種稀少細胞的分離盒或分離設備，包括(9)所述的過濾器、保持所述過濾器的保持部，所述分離盒或分離設備能夠相對于流路裝卸。
[0112] (12)-種分離盒或分離設備，是用于稀少細胞捕獲裝置的稀少細胞的分離盒或分離設備，包括(9)的過濾器、保持所述過濾器的保持部和連接部，所述連接部能夠連接所述保持部和所述稀少細胞捕獲裝置的流路，來自所述稀少細胞捕獲裝置的血液試樣能夠在所述保持部和所述過濾器中流通，所述分離盒或分離設備構成為能夠相對于所述稀少細胞捕獲裝置裝卸。
[0113] (13)(12)所述的分離盒或分離設備，所述稀少細胞捕獲裝置是（10)所述的稀少細胞捕獲裝置。
[0114] 實施例
[0115] W下，使用實施例W及比較例對本發(fā)明進行進一步的說明，但運些是示例性的，對于本發(fā)明的解釋不局限于W下的實施例。
[0116] (過濾器的制作）
[0117] 制作了表1所示的各種過濾器。#3~14的過濾器的孔的形狀是圖1的A所示的狹縫形狀，#2的過濾器的孔的形狀是圖1的B所示的形狀。表1中的W是孔的長軸徑(皿），z是短軸徑側的孔之間的空白（皿)（參照圖1的A)。
[011引表1
[0119]
[0120] 通過使用市售的激光顯微鏡VK-8510(基恩±)中的10倍~100倍的物鏡，使用顯微鏡用的攝像機拍攝過濾器中央部W及端部(上、下、左、右）的孔，并使用顯微鏡中附帶的軟件或者市售的圖像分析軟件計測其拍攝的圖像中的、與各孔外切的長方形的長邊W及短邊 (孔為50個W上），并求出其平均，由此獲得過濾器的長軸徑(W) W及短軸徑。另外，除了激光顯微鏡W外，在金屬顯微鏡、倒置顯微鏡或者顯微鏡中同樣也可W測定，優(yōu)選用在IwnW下也能夠測定的倍率進行拍攝。
[0121] 通過W市售的光學顯微鏡中用10倍~100倍的物鏡拍攝過濾器，使用顯微鏡中附帶的軟件，從其拍攝的圖像中測量連結短軸徑方向上相鄰的孔的外切長方形之間的直線之中最短的長度(50處），由此獲得孔之間的空白（Z)?；蛘?，孔之間的空白是實質上均勻，因此通過測量長軸徑的長度的中間點的短軸徑的長度(50處)并求出其平均而能夠求出。
[0122] 總孔數(shù)是W市售的光學顯微鏡使用10倍~100倍的物鏡拍攝過濾器，并直接計數(shù) 過濾器中含有的孔的數(shù)量而獲得。或者，每單位面積的孔密度中乘W過濾面積而求出總孔數(shù)。
[0123] 孔密度通過測量各孔之間的中屯、之間的間隔的長度、并從平均值中計算Imm2的孔數(shù)而被求出。
[0124] (小型的癌細胞樣品的調制）
[0125] [SW620樣品]
[0126] 按照常用的方法，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)作為粘附細胞的人結腸癌（細胞株名SW620)之后，去除培養(yǎng)基，接著添加 PBS(-)清洗并去除培養(yǎng)基成分之后，進行膜蛋白酶(英杰公司)處理(37°C、3分鐘）。向其中添加含血清培養(yǎng)基，并回收到15ml離屯、管。通過離屯、機(CR20F:日立)對其進行離屯、，并去除上清。再次懸浮在含血清培養(yǎng)基中，并進行回收。從培養(yǎng)液中回收了調制的癌細胞懸浮液之后，通過離屯、機(CR20F/日立制）在1500巧m、室溫（24°C)下進行3 分鐘的離屯、。去除上清，添加 PBS(-)而懸浮細胞。通過使用染色試劑Cell化acker(英杰公司）對該PBS(-)中懸浮的細胞進行巧光染色。CellTracker溶解于DMSO中W使得達到IOmM之后，添加到細胞懸浮液使得反應時的濃度變成最終濃度0.5~0.25iiM。并且，反應之后，對細胞懸浮液進行離屯、并去除上清，再次懸浮在PBS中。通過反復進行該操作，進行未反應液的去除和細胞的清洗。此后，使用培養(yǎng)基或者PBS(-)進行懸浮使得細胞的懸浮液的濃度變成任意的濃度（10個/mL~5 X IO4個/mL左右）。
[0127] 接著，將采集到采血管卿TA-2K)中的血液(含白細胞數(shù)3000M0000個AU)的一部分添加到與過濾裝置連通的血液過濾用試樣容器之后，將IOy的染色的癌細胞懸浮液添加到相同的血液過濾用試樣容器內的血液中，添加剩余的血液并混合，由此調制血液試樣。由于SW620的直徑為13皿左右，因此將SW620作為模型。
[0128] (可變形性高的癌細胞樣品的調制）
[0129] [ SNU-I 樣品]
[0130] 作為浮游系統(tǒng)的人胃癌細胞株（細胞株名SNU-I)不進行膜蛋白酶處理，回收在 15ml離屯、管。除了使用回收的癌細胞懸浮液W外，與SW620樣品的調制同樣地，進行巧光染色W及添加到血液，并調制血液試樣。SNU-I的細胞直徑為16.8皿，但與SW620相比，容易通過直徑為6.5皿的孔。
[0131] [C010320DM 樣品]
[0132] 由于人大腸癌（細胞株名C〇1〇320DM)中存在一部分與浮游細胞粘附的細胞，因此浮游的細胞回收到15ml離屯、管，粘附的細胞與SW620同樣進行膜蛋白酶處理之后，回收到相同離屯、管。除了使用回收的癌細胞懸浮液W外，與SW620樣品的調制相同，進行向巧光染色 W及血液的添加，并調制血液試樣。C〇1〇320DM的細胞直徑是14皿，但與SW620相比，容易通過直徑為6.5皿的孔。
[0133] 在W下的實施例W及比較例中，將SNU-IW及C〇1〇320DM作為容易變形和通過的細胞(可變形性高的細胞)的模型使用。
[0134] (比較例1)
[0135] 在圖2所示的稀有細胞捕獲裝置中配置過濾器#1(長軸徑:6.5皿、短軸徑:6.扣m、 w/z:0.9)，使用SW620樣品、SNU-I樣品W及C〇1〇320DM樣品，在下述過濾條件下進行過濾，并進行細胞的分離回收。過濾結束之后，W A P1 = 0.4k化輸送PBS(-)等的緩沖液并進行過濾器的清洗，緩慢拆除被連接在分離部之上的連接部，在過濾器上部上緩慢載置載玻片，并制作觀察面。將其設置在巧光顯微鏡上，并對過濾器上殘留的、被巧光染色的癌細胞進行計數(shù)。另外，另行將與添加到血液中的量等量的所述癌細胞懸浮液添加到微孔板，通過巧光顯微鏡對細胞數(shù)量進行計數(shù)。W微孔板內的細胞數(shù)量為分母，W過濾器上殘留的作為分子而進行計算，計算出捕獲率。下述表2示出其結果。
[0136] <過濾條件〉
[0137] 總血液試樣處理量：lml、4ml、8ml
[0138] 系統(tǒng)整體的過濾壓力（A Pl)試樣過濾時：1.3kPa
[0139] 表2
[0140]
[0141] 專利文獻5(日本專利特開2011-163830號公報）中公開了在使用10皿直徑的尺寸選擇微陣列的情況下，SW620的平均回收率為38%。與此相對，可知根據(jù)具備直徑為6.5皿的圓孔的過濾器#1，能夠W超過90%的高的捕獲率捕獲SW620。另一方面，作為細胞直徑比 SW620大且可變形性高的癌細胞的5^-1^及(：〇1〇32001與5胖620相比捕獲率低。并且，可知當血液量處理量增加時，尤其可變形性高的細胞的捕獲率進一步降低?？芍诰邆渲睆綖?6.5WI1的圓孔的過濾器中，不能充分捕獲可變形性高的癌細胞。
[0142] 在過濾器#1中，為了維持兩者的高捕獲率，考慮到進一步降低血液處理量，或者增大過濾面積。除此之外，也存在增大孔密度的方法，但由于對過濾器的耐久性帶來影響，因此不優(yōu)選。
[0143] (實施例1)
[0144] 為了確認小型的癌細胞的捕獲性能，將開口率和長軸徑(W)相同且短軸徑不同的過濾器#3、4或者5配置在如圖2所示的稀有細胞捕獲裝置，使用SW620樣品在下述的過濾條件1或2下進行過濾并進行細胞的分離回收，并求出SW620的捕獲率。分離回收W及捕獲率的計算與比較例1相同。圖3示出其結果。此外，過濾器上下的壓力差（AP2)通過AP2 = Q/N0X 12化/[ (1-0.63Kh/w) ] X (l/Vw)如前所述作為前述ri = 4.5m化計算。
[0145] <過濾器〉
[0146] 過濾器#3(短軸徑：5.0皿、長軸徑:8祉m、w/z: 9.8)
[0147] 過濾器#4(短軸徑:6.5皿、長軸徑:8祉m、w/z: 7.3)
[0148] 過濾器#5(短軸徑:8.0皿、長軸徑:8祉m、w/z:6.1)
[0149] <過濾條件〉
[0150]
[0151] 圖3是示出孔的短軸徑和小型的細胞(SW620)的捕獲率之間的關系的圖。如圖3所示，作為直徑比較小的細胞的SW620在處理量為2ml的情況下，在任何過濾器中也能W超過 80%的捕獲率回收，其中，短軸徑為6.化m的過濾器#4的捕獲率最高。另一方面，在處理為 8ml的情況下，短軸徑為6.5WI1的過濾器#4的捕獲率最高，但在短軸徑為祉m的過濾器#5中確認到捕獲率低于80 %。
[0152] 使用作為易變形的細胞的SNU-I而進行相同的測定的結果為，短軸徑化m的過濾器#3的捕獲率最低(未示出數(shù)據(jù)）。
[0153] (實施例2)
[0154] 除了使用具有相同的短軸徑W及開口率的過濾器#6、4、7或8(開口率：31%)并設為下述的過濾條件W外，與實施例1同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。樣品使用了 SNU-I樣品。圖4示出其結果。
[0155] <過濾器〉
[0156] 過濾器#6(短軸徑:6.5皿、長軸徑:0皿、w/z: 5.3)
[0157] 過濾器#4(短軸徑:6.5皿、長軸徑:8祉m、w/z: 7.3)
[0158] 過濾器#7 (短軸徑:6.5皿、長軸徑:200皿、w/z: 15.4)
[0159] 過濾器#8(短軸徑:6.5皿、長軸徑:500皿、w/z: 35.7)
[0160] <過濾條件〉
[0161]
[0162] 圖4是示出w/z和捕獲率之間的關系的圖。如圖4所示，任何w/z為7. OW上的過濾器均能W超過80%的高的捕獲率回收SNU-1。另外，能夠確認到即使具有相同的開口率，w/z的值越大越能W高的捕獲率回收。另外，考慮由于能夠W過濾處理時的系統(tǒng)整體的過濾壓力 (APl)〇.4kPa(過濾器上下的壓力差（AP2)的計算值:2化~3Pa)的低的壓力回收，因此也能降低對回收的稀有細胞的破損。
[0163] (實施例3)
[0164] 除了使用短軸徑和Z(短軸徑側的孔之間的空白）相同的過濾器#9或者10(短軸徑： 6.5皿、Z : 7.5WI1)、且將過濾條件設為下述3或4 W外，與實施例2同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。圖5示出其結果。此外，作為參考例，除了使用孔的形狀為圓的過濾器#1(短軸徑側的孔之間的空白（z) = 7.5wii)W及孔的形狀為楠圓形的過濾器#2(短軸徑側的孔之間的空白（z)=7.5wii)，并設為下述的參考過濾條件1或2W外，同樣地進行。
[01化] <過濾器〉
[0166] 過濾器#1 (短軸徑:6.5皿、長軸徑:6.5皿、w/z: 0.9)
[0167] 過濾器#2(短軸徑:6.5皿、長軸徑:9.祉m、w/z: 1.3)
[0168] 過濾器#9(短軸徑:6.5皿、長軸徑:8祉m、w/z: 11.7)
[0169] 過濾器#10(短軸徑:6.5皿、長軸徑:96祉m、w/z: 129.1)
[0170] <過濾條件〉
[0171]
[0172] 圖5是示出w/z和捕獲率之間的關系的圖。如圖5所示，過濾器#9W及10(w/z為7W 上)均能W超過90%的高的捕獲率回收SNU-1。尤其過濾器#9(長軸徑:8祉m、w/z:11.7)與過濾器#10(長軸徑:96祉口、巧八：129.1)相比，偏轉或者污垢的發(fā)生降低，并能^接近100%的捕獲率回收。
[0173] (實施例4)
[0174] 除了使用具有相同的短軸徑W及長軸徑(W)的過濾器#4或9、且將過濾條件設為下述5~8中的任何一個W外，與實施例2同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。圖6示出其結果。
[0175] <過濾器〉
[0176] 過濾器#4 (短軸徑:6.5皿、長軸徑:8祉m、長軸徑:7.3)
[0177] 過濾器#9(短軸徑:6.5皿、長軸徑:8祉m、w/z: 11.7)
[0178] <過濾條件〉
[0179]
[0 …"」凹 U/J、ULt W / 么 /|'H ] W j人氣^X_ I 叫 M 'J yv刀^ M 'J
凹 O 凹 U 下 M 'J I_I D M 'J 凹 /J、ULf '田、mi Y1X kAT干乂L 理量2ml(過濾條件5或7)的結果的圖，黑色的圖是示出總血液試樣處理量8ml(過濾條件6或 8)的結果的圖。如圖6所示，w/z為7.3的過濾器#4在總的血液試樣處理量為8ml時能夠看到捕獲率的降低，但在2ml時獲得高的捕獲率。令人驚訝的是，w/z為11.7的過濾器#9與總的血液試樣處理量無關，能W接近100 %的高的捕獲率捕獲SNU-I。
[0181] 從固定開口率、短軸徑、長軸徑W及Z中的一個或者兩個、且使wA變化的實施例1 ~4的結果中確認到，通過將wA設為7W上，能夠提高可變形性高的細胞的捕獲率，進一步地，在增加總血液處理量的情況下，也能夠提高捕獲率。
[0182] (實施例5)
[0183] 除了使用過濾器#9(短軸徑:6.5皿、長軸徑:88皿、w/z : 11.7)、并改變總的血液試樣處理量W外，與實施例2同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。過濾時的壓力如W下所示。表7示出其結果。
[0184] <過濾條件〉
[01化]系統(tǒng)整體的過濾壓力（A Pi) :0.4k化 [0186]表7
[0187]
[018引如表7所示，均能W超過70%的捕獲率回收SNU-1。另外，確認到通過將每孔面積的處理量設為超過0.1 nlAxm2且3. InlAim2W下的范圍，能W更高的捕獲率回收SNU-I。
[0189] (實施例6)
[0190] 除了使用過濾器#9或10、將總血液試樣處理量設為8ml、過濾條件設為下述9~12 的任一個W外，與實施例2同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。圖7的AW及圖7的B示出其結果。此外，作為參考例，使用孔形狀為楠圓形的過濾器#2,通過下述的參考過濾條件3 或4同樣地進行。
[0191] <過濾器〉
[0192] 過濾器#2(短軸徑:6.5皿、長軸徑:9.祉m、長軸徑：1.5)
[0193] 過濾器#9(短軸徑:6.5皿、長軸徑:8祉m、長軸徑：11.7)
[0194] 過濾器#10(短軸徑:6.5皿、長軸徑:96祉m、長軸徑：129.1)
[01巧] < 過濾條件〉
[01961
[0197]替代SNU-I樣品使用SW620樣品，與實施例2~6同樣地進行實驗時，在任何過濾器和條件下均能W接近90%或90% W上的高的捕獲率捕獲SW620(數(shù)據(jù)未示出）。
[019引圖7的AW及圖7的B是示出各過濾器的捕獲率的分散的圖，圖7的A示出系統(tǒng)整體的過濾壓力（API)為0.4kPa(過濾條件9及10并且參考過濾條件3)的結果，圖7的B示出系統(tǒng)整體的過濾壓力（A PI)為1.3k化(過濾條件11及12并且參考過濾條件4)的結果。能夠確認到如圖7的AW及7的B所示，在任何壓力條件下，過濾器#9及10與過濾器#2相比，分散小且試樣之間差異小。尤其能夠確認到在任何壓力條件下，過濾器#9均示出高的捕獲率，分散非常小。
[0199] (實施例7)
[0200] 作為癌細胞樣品，使用SNU-1、SW620、C〇1〇320DM、人肺癌(細胞株名NCI-化703)、人肺癌(細胞株名A549)、人肺癌(細胞株名NCI-H1975)、人肺癌(細胞株名NCI-H69)W及人肺癌(細胞株名HCI-H1603)，由此進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。血液樣品的調制與上述的小型的癌細胞樣品的調制同樣地進行。另外，關于凝集塊多的細胞(例如，NCI-H69)，由于細胞的計數(shù)中產生分散，因此按照分散試劑FACSmax(Genlantis)和協(xié)議使細胞分散之后，使用20WI1孔的尼龍網格過濾器(密理博）、過濾面積(I)Umm的過濾器，去除沒有分散而殘留的凝集塊，使用過濾液中的細胞懸浮液。作為過濾器，使用了除了過濾面積不同W外，短軸徑、長軸徑W及w/z相同的過濾器#9及#11 (w/z = 11.7、長軸徑=88皿、短軸徑=6.5皿）。過濾條件如下。下述表1OW及11示出其結果。
[0201] <過濾條件〉
[02021
[0203]表 10
[0204]
[0
[0
[0207] 表10示出過濾器#9(過濾面積：20mm2)的捕獲率，表11示出過濾器#11(過濾面積： 79mm2)的捕獲率。如上述表1OW及11所示，不論浮游細胞或粘附細胞，均能有效捕獲多種細胞。另外，不論過濾面積如何，均能夠有效捕獲多種細胞。
[020引（實施例8)
[0209] 使用高化t化Ct值高)試樣而進行癌細胞的捕獲。
[0210]首先，進行高Hct試樣的調制。將采集的血液分別分到2支15ml的離屯、管中，使用離屯、機W1500 Xg進行10分鐘左右的離屯、處理。進行離屯、之后，另行將分離的血漿的層分到 15ml的離屯、管中。將只有血細胞層的兩支離屯、管中的一支離屯、管的紅細胞層添加到另一個離屯、管中，接著，添加取出的血漿使得化t值變成60 W上，由此調制高化t血液試樣。接著，除了替代血液使用調制的高化t血液試樣W外，與上述的SNU-I試樣同樣地，調制了高化t試樣。此外，調制的高化t血液試樣的化t值使用血細胞計數(shù)測定裝置SB-1440(愛科來)而求出。
[0211]除了使用調制的高化t試樣(S種）W及過濾器#9或者11、且使過濾條件作為下述 13~15中的任一個W外，與實施例1同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。圖8示出其結果。
[0212]
[0213] 如圖8所示，即使是Hct超過60 %的高Hct試樣，也能W超過90 %或者接近90 %的高的捕獲率捕獲SNU-I細胞。
[0214] (實施例9)
[0215] 使用高白細胞數(shù)（白細胞數(shù)多)試樣，進行了癌細胞的捕獲。
[0216] 首先，進行了高白細胞數(shù)試樣的調制。將使用化taS邱（STEMCE化Technologies) 而分離回收的白細胞與血液混合，調制了高白細胞數(shù)的血液試樣，接著，除了替代血液使用調制的高白細胞數(shù)的血液試樣W外，與上述的SNU-I試樣同樣地，調制高Hct試樣。此外，調制的高白細胞數(shù)試樣的白細胞數(shù)使用血細胞計數(shù)測定裝置SB-1440(愛科來)而求出。
[0217] 除了使用調制的高白細胞數(shù)試樣W及過濾器11、且使過濾條件作為下述W外，與實施例1同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。圖9示出其結果。腳引 <過濾條件〉
[0219]
[0220] 如圖9所示，即使是白細胞數(shù)量超過10,000個AiL的高白細胞數(shù)試樣，也能W超過 80%的高的捕獲率捕獲SNU-I細胞。
[0221] (比較例2)
[0222] 使用與非專利文獻6中記載的過濾器相同的孔配置的過濾器(短直徑祉mX長直徑 100皿、W/Z = 6.7)，并使用SW620試樣、SNU-I試樣W及NCI-H69試樣而進行捕獲率的評價。過濾條件WO. 4k化輸送各血液試樣8ml，與實施例1同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。下述表14示出獲得的捕獲率。另外，在相同過濾條件下使用過濾器#9進行了捕獲實驗。將其結果一并在下述表14中示出。
[0223] 表14
[0224]
[02巧]如上述表14所示，過濾器#9(短軸徑:6.5皿、長軸徑:88皿、w/z : 11.7)獲得90 % W 上的捕獲率，與非專利文獻6中公開的過濾器相比，針對大腸癌細胞、胃癌細胞W及肺癌細胞的任何一個細胞，都示出高的捕獲率。因此，可W說通過使用過濾器#9運樣的本發(fā)明的過濾器，與非專利文獻6的過濾器相比，能夠實現(xiàn)小型的癌細胞W及易變形的細胞的捕獲率的提局。
[0226] (實施例10)
[0227] 除了使用開口率、短軸徑W及長軸徑(W)相同的過濾器#4或12、并使用SW620試樣 W及SNU-I試樣并設為下述過濾條件16W外，與實施例1同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。圖10示出其結果。
[022引 <過濾器〉
[0229] 過濾器#4(短軸徑:6.5皿、長軸徑:8祉m、w/z: 7.3)
[0230] 過濾器#12(短軸徑:6.5皿、長軸徑:8祉m、w/z: 11.7)
[0231] <過濾條件〉
[0232]
[0233] 圖10是示出w/z和捕獲率的關系的圖。圖10中的白色的圖是示出SW620試樣的結果的圖，黑色的圖是示出SNU-I試樣的結果的圖。如圖10所示，只要w/z為7W上，就能W80% W 上的捕獲率捕獲SW6 20 W及SNU-1，尤其只要w/z為11W上時，就能W超過90 %的高的捕獲率捕獲 SW620W 及 SNU-1。
[0234] (實施例11)
[0235] 除了使用過濾器的厚度不同的過濾器#11、13或者14、并使用SW620W及SNU-I并設為下述過濾條件17W外，與實施例1同樣地進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。圖11示出其結果。
[0236] <過濾器〉
[0237] 過濾器#11(長軸徑:8祉m、w/z: 11.7、厚度:5皿）
[023引過濾器#13(長軸徑:8祉m、w/z: 11.7、厚度:3皿）
[0239] 過濾器#14(長軸徑:8祉111、"八：11.7、厚度：15皿）
[0240] <過濾條件〉
[0241]
[0242] 圖11是示出過濾器的厚度和捕獲率的關系的圖。圖11中的涂白的圖是示出SW620 試樣的結果的圖，涂黑的圖是示出SNU-I試樣的結果的圖。如圖11所示，在任何厚度的情況下，都能W9〇%W上的高的捕獲率捕獲SW620W及SNU-1。
[0243] (實施例12)
[0244] 除了使用#9、并使用含有的細胞的數(shù)量不同的多個SNU-I試樣并設為下述過濾條件18W外，與實施例1同樣地，進行細胞的捕獲W及捕獲率的計算。圖12示出其結果。
[0245] <過濾條件〉
[0246]
[0247] 圖12是示出試樣中含有的細胞數(shù)量和捕獲的細胞數(shù)量的關系的圖。如圖12所示，不論試樣中含有的細胞的數(shù)量如何，均能W高的捕獲率捕獲SNU-I細胞。
【主權項】
1. 一種稀有細胞的分離或者檢測方法，所述方法包括：使用過濾器對血液試樣進行過濾處理，并分離或者檢測血液試樣中的稀有細胞，所述過濾器以孔密度為40個/mm2以上2000個/mm2以下、且長軸徑w(ym)和短軸徑側的孔之間的空白ζ (μπι)之間的比例(w/z)為7.0以上130以下的方式，包括短軸徑為5μπι以上8μπι以下且長軸徑為40μπι以上的孔。2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中，以在換算成與過濾器的每個孔面積對應的處理容量時、針對過濾器的每個孔的過濾器處理容量為O.lnl/wn2以上3η1/μπι2以下的方式過濾處理血液試樣。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其中，所述過濾器的開口率為10 %以上60 %以下。4. 根據(jù)權利要求1至3任一項所述的方法，其中，所述過濾處理中的過濾壓力為O.lkPa以上2.6kPa以下。5. 根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的方法，其中，所述過濾處理時的過濾器上表面和下表面之間的壓力差為l〇〇Pa以下。6. 根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的方法，其中，以所述過濾器的每個孔lmm/min以上600mm/min以下的平均流速向所述過濾器輸送所述血液試樣。7. 根據(jù)權利要求1至6中任一項所述的方法，其中，所述稀有細胞是選自由癌細胞、循環(huán)腫瘤細胞、血管內皮細胞、血管內皮祖細胞、癌干細胞、上皮細胞、造血干細胞、間充質干細胞、胎兒細胞、干細胞及其組合組成的組中的細胞。8. -種血液試樣中的稀有細胞的分析方法，其包括：通過1至7中任一項所述的方法分離或者檢測稀有細胞之后，通過包含該細胞的動態(tài)的觀察或者活性測定的方法進行分析或該細胞的基因分析。9. 一種過濾器，其用于1至7中任一項所述的方法，所述過濾器以孔密度為40個/mm2以上 2000個/mm 2以下、且長軸徑w (μπι)和短軸徑側的孔之間的空白ζ (μπι)之間的比例(w/z)為7.0 以上130以下的方式包括短軸徑為5μπι以上8μπι以下且長軸徑為40μπι以上的孔。10. -種稀有細胞捕獲裝置，用于捕獲試樣中含有的稀有細胞，所述稀有細胞捕獲裝置包括：供應口、排出口、用于連通所述供應口和所述排出口的流道、以及分離部，所述分離部被配置在相當于所述流道的一部分的位置上，并包括權利要求9所述的過濾器以及所述過濾器的保持部。11. 一種稀有細胞的分離盒或分離設備，包括權利要求9所述的過濾器和保持所述過濾器的保持部，能夠相對于流路裝卸。
【文檔編號】G01N15/10GK105987843SQ201610169565
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2016年3月23日
【發(fā)明人】高木英紀
【申請人】愛科來株式會社

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