一種辣椒醬中偶氮色素的非定向篩查方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及辣椒醬中偶氮色素的非定向篩查方法，屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明采用帶有電噴霧電離源的液相色譜?四極桿質(zhì)譜儀進行檢測，以m/z156為子離子，進行前體離子掃描檢測，通過質(zhì)量色譜圖中對應色譜峰的前體離子質(zhì)荷比進行偶氮色素的篩查。若獲得具有子離子156的總離子流圖，則說明試樣中含有偶氮色素；而且逐一查看總離子流圖中的色譜峰所對應的母離子質(zhì)量數(shù)，對照可能的偶氮色素列表，即可確認樣品中含有的禁用或限用色素。本發(fā)明在檢測時不需要標準物質(zhì)對照，也不需要通過標準物質(zhì)建立專業(yè)篩查數(shù)據(jù)庫，檢測成本大幅降低，不受缺少標準物質(zhì)、沒有專業(yè)數(shù)據(jù)庫等條件限制。樣品前處理僅需20min，儀器分析15min，單一樣品非定向篩查全過程僅需35min。
【專利說明】
一種辣椒醬中偶氮色素的非定向篩查方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及辣椒醬中偶氮色素的非定向篩查方法，屬于食品檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 1、偶氮色素簡介 偶氮色素是用化學合成方法制得的色素，其本身無任何營養(yǎng)價值。與天然色素相比較， 偶氮色素更能增加食品外觀美感且能提升人的購買欲和食欲，而且價格低廉，色彩亮麗，性 質(zhì)穩(wěn)定，配色方便易溶解，易調(diào)色，已廣泛應用于食品工業(yè)，特別是辣椒醬等食品，為了追求 色澤艷麗和持久，生產(chǎn)者通常會加入合成色素。目前允許使用的偶氮色素主要有胭脂紅、莧 菜紅、日落黃、檸檬黃等，GB2760《食品添加劑使用衛(wèi)生標準》中嚴格規(guī)定了這些色素的適用 范圍和用量。但是，同屬偶氮色素的酸性橙、酸性黃、蘇丹紅I、蘇丹紅Π、蘇丹紅m、蘇丹紅 IV等禁止在食品中添加。
[0003] 這些禁止添加的偶氮色素多以苯、甲苯、萘等芳烴類化工產(chǎn)品為原料，經(jīng)過磺化、 硝化、偶氮化等一系列有機反應化合而成。它們在人體內(nèi)經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化，可形成致癌物。當 前社會，有一些不法商販因抵擋不住利潤的誘惑，在生產(chǎn)的食品中違法添加一些廉價的工 業(yè)色素。2005年2月，英國食品局發(fā)現(xiàn)有350多種食品受"蘇丹紅I號"污染，就是濫用 工業(yè)偶氮色素的典型案例。在蘇丹紅之后，又有數(shù)種偶氮色素被發(fā)現(xiàn)用于辣椒醬等食品中， 如對位紅、羅丹明B等。之所以頻頻出現(xiàn)此類違法添加的現(xiàn)象，一方面是辣椒醬等辣椒制品 需要更為鮮艷的色澤，以博取賣點；另一方面是偶氮色素的檢測技術(shù)存在缺陷，難以發(fā)現(xiàn)添 加的未知色素。
[0004] 2、偶氮色素的檢測現(xiàn)狀 目前偶氮色素的檢測主要是采用液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜法。絕大多數(shù)液相色譜 方法是針對一種或幾種色素的定量檢測方法;液相色譜-質(zhì)譜方法包含兩種類型，一種是采 用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的針對一種或幾種色素的定性、定量檢測方法;另一種是采用 飛行時間或軌道阱高分辨質(zhì)譜和液相色譜聯(lián)用建立的篩查方法。這些檢測方法主要存在以 下缺點和問題： 1)定量檢測的液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法只能針對已知的色素進行檢 測。對于禁用色素而言，生產(chǎn)者不會在其產(chǎn)品包裝上明示使用的色素，因此此類檢測方法沒 有針對性，無法確定檢測對象，無法滿足辣椒醬中偶氮色素的檢測需求。比如GB/T 5009.35-2003《食品中合成著色劑的測定》、GB/T 19681-2005《食品中蘇丹紅染料的檢測方 法高效液相色譜法》等標準，都是針對特定色素的定量檢測方法，不能針對未知色素進行 檢測。
[0005] 2)基于高分辨質(zhì)譜-液相色譜聯(lián)用的檢測方法，可以針對偶氮色素進行篩查，但是 一方面需要使用者購買價格昂貴的色素標準物質(zhì)，研究并建立偶氮色素的質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫，才 能實現(xiàn)數(shù)據(jù)庫范圍內(nèi)的篩查;另一方面高分辨質(zhì)譜價格昂貴，對操作人員技術(shù)要求很高，大 多數(shù)檢測單位難以實現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種不需要建立色素標準物質(zhì)數(shù)據(jù)庫，能夠?qū)崿F(xiàn)未知的同 類偶氮色素檢測的的非定向篩查方法。本發(fā)明基于價格較低、使用范圍較廣的液相色譜-串 聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀所建立的偶氮色素篩查方法，從而有效解決辣椒醬中偶氮色素的全面檢測 和系統(tǒng)篩查難題，大幅度提高檢測效率，降低成本和對檢測人員的技術(shù)要求。
[0007] 技術(shù)方案 一種辣椒醬中偶氮色素的非定向篩查方法，包括以下步驟： (1) 向辣椒醬中加入色譜純乙腈進行超聲提取，然后加入飽和氯化鈉溶液，分層(靜置 或離心后使之分層)后取上層液加入質(zhì)量濃度為0.1%的甲酸溶液，再用0.22μπι有機相微孔 濾膜過濾，得試樣； (2) 試樣用帶有電噴霧電離源的液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀進行檢測； (3) 若獲得的以m/zl56為子離子的前體離子掃描總離子流圖中出現(xiàn)色譜峰，則說明試 樣中含有偶氮色素；則進一步從總離子流圖中逐一提取各色譜峰的母離子掃描質(zhì)譜圖，以 獲得對應的母離子質(zhì)量數(shù);將獲得的母離子質(zhì)量數(shù)與已知偶氮色素的質(zhì)量數(shù)比對即可確認 試樣中所含偶氮色素的種類； 若獲得的以m/zl56為子離子的前體離子掃描總離子流圖中沒有明顯的色譜峰，則說明 試樣中不含有偶氮色素； 液相色譜參數(shù)： a) 色譜柱：100X2.1mm，ACQUITY UPLC? BEH C18，1.7ym(固定相C18); b) 流動相:A相：乙腈;B相：質(zhì)量濃度為0.1%甲酸水溶液;柱溫:40°C ;進樣量:5tiL;流動 相梯度見表1; 表1梯度洗脫條件
質(zhì)譜操作條件： a) 離子源：電噴霧離子源，正離子； b) 掃描方式:前體離子掃描監(jiān)測，前體離子掃描范圍160amu~600amu，子離子質(zhì)荷比為 156.0； c) 電離電壓:3.2kV;錐孔電壓:35v;碰撞能量40 ev ; d) 離子源溫度：110°C ;霧化溫度:400°C ;錐孔氣流速:50L/h;霧化氣流速:600L/h;碰撞 氣:氬氣;碰撞室壓力:3.6X103 mPa。
[0008] 上述非定向篩查方法，步驟（1)的提取方法為針對本篩查技術(shù)研制，若采用其他方 法會導致提取效率不理想、篩查效率大幅降低。
[0009] 上述非定向篩查方法，步驟1中， 辣椒醬與色譜純乙腈的用量比例為lg:5mL，超聲提取的條件為40°C水浴中震蕩； 所用飽和氯化鈉溶液體積等于色譜純乙腈的體積； 上層液的體積等于甲酸溶液的體積。
[0010]上述操作能夠使辣椒醬在乙腈溶液中快速分散，實現(xiàn)偶氮色素的最佳提取效率， 等體積的飽和氯化鈉溶液能夠與乙腈提取液實現(xiàn)良好的分配，最大限度的去除干擾物。 [0011]辣椒醬中的偶氮色素使用乙腈提取后，用飽和氯化鈉溶液分配，上層乙腈溶液中 加入等體積的0.1%甲酸溶液稀釋、過濾后，經(jīng)反相液相色譜柱分離，再使用串聯(lián)四極桿質(zhì) 譜，以m/zl56為子離子，進行前體離子掃描檢測，通過質(zhì)量色譜圖中對應色譜峰的前體離子 質(zhì)荷比進行偶氮色素的篩查。若獲得具有子離子156的總離子流圖，則說明試樣中含有偶氮 色素;而且逐一查看總離子流圖中的色譜峰所對應的母離子質(zhì)量數(shù)，對照可能的偶氮色素 列表，即可確認樣品中含有的禁用或限用色素。若某一色譜峰對應的母離子質(zhì)量數(shù)不在已 知的偶氮色素范圍內(nèi)，則可能為某種目前尚未發(fā)現(xiàn)添加于食品中的非食用色素，可通過文 獻檢索和進一步測試確認其結(jié)構(gòu)。
[0012] 本發(fā)明的主要技術(shù)創(chuàng)新 (1)方法具有強大的禁用、限用色素發(fā)現(xiàn)能力 本發(fā)明所采用的方法不同于目前液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜常用的檢測方法：目前方 法均使用"多反應監(jiān)測"的模式，即在串聯(lián)四極桿質(zhì)譜的第一級四極桿選定母離子，經(jīng)碰撞 室裂解，再通過第三級四極桿監(jiān)測固定的子離子，通過監(jiān)測"母離子-子離子"這一離子對實 現(xiàn)定性定量檢測的目的，這種模式只能用于針對單一化合物的定向檢測。本發(fā)明經(jīng)研究發(fā) 現(xiàn)很多偶氮色素均能產(chǎn)生質(zhì)荷比為156的特征碎片離子，在此基礎上研發(fā)了母離子掃描的 篩查模式，即在第一級四極桿采用掃描的模式，監(jiān)測質(zhì)量數(shù)在160amu~600amu間的所有離 子，經(jīng)碰撞室裂解后，在第三級四極桿固定監(jiān)測質(zhì)荷比為156的子離子，并記錄能產(chǎn)生對應 子離子的"母離子"的質(zhì)量數(shù)，該母離子即為篩查的目標成分。因此本發(fā)明解決了一次發(fā)現(xiàn) 同類結(jié)構(gòu)的禁用和限用偶氮色素的問題。
[0013] (2)不需要禁用和限用色素的標準物質(zhì)和專業(yè)數(shù)據(jù)庫對照 本發(fā)明完全基于偶氮色素的結(jié)構(gòu)信息，經(jīng)由共同的碎片離子156反向篩查母離子，從而 定性禁用和限用的偶氮色素，在檢測時中不需要標準物質(zhì)對照，也不需要通過標準物質(zhì)建 立專業(yè)篩查數(shù)據(jù)庫，檢測成本大幅降低，方法在任何實驗室應用均不受缺少標準物質(zhì)、沒有 專業(yè)數(shù)據(jù)庫等條件限制。
[0014] (3)篩查速度快 本發(fā)明樣品前處理僅需20min(超聲提取10min+震蕩萃取2min+離心分層3min+轉(zhuǎn)移、稀 釋、過濾3min+操作步驟間耗時2min)，儀器分析15min，單一樣品非定向篩查全過程僅需 35min。若多個樣品同時篩查，因前處理同時進行，時間還可大幅縮短。由于本方法數(shù)據(jù)分析 過程簡單，所有的可疑成分在總離子流圖中均可直觀顯現(xiàn)，而其他高分辨質(zhì)譜的篩查方法 均需要采用復雜的軟件和數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)處理。綜合來看，本發(fā)明的方法篩查速度更為快 速、有效。
[0015] (4)所用儀器普及程度高，方法可操作性強 本發(fā)明使用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀進行非定向篩查，該儀器是所有質(zhì)譜儀器中 市場占有率最高的產(chǎn)品，目前在國內(nèi)食品安全檢測實驗室普及程度非常高，實驗人員基本 能夠熟練操作，本方法的應用具有較強的可操作性。而其他篩查技術(shù)均使用液相色譜-四極 桿/飛行時間質(zhì)譜或液相色譜-四極桿/軌道阱質(zhì)譜儀等高分辨質(zhì)譜儀，不但價格昂貴，在國 內(nèi)只有少數(shù)省級以上實驗室擁有該類儀器，而且對操作人員要求很高，對未知禁用色素的 篩查還需要配合完備的數(shù)據(jù)庫和較強的質(zhì)譜解析能力才能進行。綜合來看，本發(fā)明的可操 作性更強。
[0016] 本發(fā)明的有益效果 1、測定了不同品牌的辣椒醬52批，在其中三批中檢出蘇丹紅1號，其中1批檢出對位紅。 在一批蒜蓉辣醬中發(fā)現(xiàn)了 一種未知的偶氮色素，其母離子為308，經(jīng)進一步檢索、鑒定，該物 質(zhì)為工業(yè)色素甲苯胺紅。應用結(jié)果充分表明，本發(fā)明用于禁用和限用偶氮色素的篩查具有 高效、準確等特點。
[0017] 2、上述全部52批辣椒醬的篩查，在20小時內(nèi)全部完成，充分體現(xiàn)了本發(fā)明快速簡 便的優(yōu)勢。
[0018] 3、完成一個樣品的篩查僅需用到14mL乙腈(其中1 OmL用于樣品提取，4mL為流動 相）、4g氯化鈉及及其微量的甲酸，試劑成本不足2元。若使用其他方法，僅標準物質(zhì)的消耗 至少在50元以上。本發(fā)明具有顯著的成本優(yōu)勢。
[0019] 4、本發(fā)明所用液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，國內(nèi)大多數(shù)食品檢測實驗室均有配 備，一般熟悉色譜質(zhì)譜的檢驗人員均可操作。本方法在不同品牌的儀器上可以通用，儀器不 需要經(jīng)過復雜的校準、調(diào)諧等特殊操作，比起高分辨質(zhì)譜篩查具有更強的可操作性。
[0020] 5、本發(fā)明方法數(shù)據(jù)處理簡潔明了，在總離子流圖上即可直觀發(fā)現(xiàn)可以成分，對照 偶氮色素的化學式和分子量即可快速確定篩查對象。
[0021] 6、由于本發(fā)明具有簡便、快速、經(jīng)濟、儀器硬件要求低、基本不受操作者技術(shù)水平 限制等特點，在禁用和限用偶氮色素的非定向篩查技術(shù)中優(yōu)勢明顯，具有很好的推廣應用 前景。
【附圖說明】
[0022]圖1為實施例1獲得的總離子流圖； 圖2為從實施例1的總離子流圖提取出的、確定為蘇丹I的前體離子掃描質(zhì)譜圖； 圖3為從實施例1的總離子流圖提取出的、確定為蘇丹II的前體離子掃描質(zhì)譜圖； 圖4為從實施例1的總離子流圖提取出的、確定為蘇丹III的前體離子掃描質(zhì)譜圖； 圖5為從實施例1的總離子流圖提取出的、確定為蘇丹IV的前體離子掃描質(zhì)譜圖。
【具體實施方式】
[0023] 實施例1 1、樣品前處理 稱取2.0g經(jīng)粉碎、混勻后的辣椒醬試樣，置于50mL具塞離心管中，加入10mL色譜純乙 腈，40°C水浴中震蕩、超聲提取lOmin。取出后加入10mL飽和氯化鈉溶液，用力震蕩2min，靜 置或離心分層。取上層乙腈溶液0.5mL，置于2.5mL離心管中，加入0.5mL0.1%甲酸溶液，混 勻。經(jīng)0.22μπι有機相微孔濾膜過濾，所得濾液即為試樣。
[0024] 2、儀器與操作條件 2.1儀器:液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，帶有電噴霧電離源。
[0025] 2.2液相色譜參數(shù)： a) 色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18(100X2.1mm，1.7ym); b) 流動相:A相：乙腈;B相:0.1%甲酸水溶液;柱溫:40°C ;進樣量:5tiL;流動相梯度見表 1： 表1梯度洗脫條件
2.3質(zhì)譜操作條件 a) 離子源：電噴霧離子源，正離子； b) 掃描方式：前體離子掃描監(jiān)測，前體離子掃描范圍160amu-600amu;子離子質(zhì)荷比 156.0amu； c) 電離電壓:3.2kV;錐孔電壓:35v;碰撞能量40 ev ; d) 離子源溫度：120 °C ;霧化溫度:500 °C ;錐孔氣流速：150L/h;霧化氣流速:800L/h;碰 撞氣:氬氣，碰撞室壓力:3.6X103 mPa。
[0026] 3、篩查結(jié)果的分析 判斷標準:若獲得的以m/z 156為子離子的前體離子掃描總離子流圖中存在明顯可辨別 色譜峰，則說明試樣中含有偶氮色素；則進一步從總離子流圖中逐一提取各色譜峰的母離 子掃描質(zhì)譜圖，以獲得對應的母離子質(zhì)量數(shù);將獲得的母離子質(zhì)量數(shù)與已知偶氮色素的質(zhì) 量數(shù)比對即可確認試樣中所含偶氮色素的種類;若某一色譜峰對應的母離子質(zhì)量數(shù)不在已 知的偶氮色素范圍內(nèi)，則可能為某種目前尚未發(fā)現(xiàn)添加于食品中的非食用色素，可通過文 獻檢索和進一步測試確認其結(jié)構(gòu)。若獲得的以m/zl56為子離子的前體離子掃描總離子流圖 中沒有明顯的色譜峰，則說明試樣中不含有偶氮色素。
[0027]如圖1為篩查獲得了具有明顯色譜峰的總離子流圖，說明待測樣品中含有偶氮色 素。然后逐一提取各色譜峰的前體離子掃描質(zhì)譜圖（圖2-圖4)，查看所對應的母離子質(zhì)量 數(shù)，對照可能的偶氮色素化學結(jié)構(gòu)，確認試樣中含有蘇丹I、蘇丹II、蘇丹III和蘇丹IV。 [0028] 實施例2 以不同品牌的辣椒醬52批作為待測試樣，采用實施例1的操作，在其中三批中檢出蘇丹 紅1號，其中1批檢出對位紅。在一批蒜蓉辣醬中發(fā)現(xiàn)了一種未知的偶氮色素，其母離子為 308，經(jīng)進一步檢索、鑒定，該物質(zhì)為工業(yè)色素甲苯胺。
【主權(quán)項】
1. 一種辣椒醬中偶氮色素的非定向篩查方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 向辣椒醬中加入色譜純乙腈進行超聲提取，然后加入飽和氯化鈉溶液，分層后取上 層液加入質(zhì)量濃度為0.1%的甲酸溶液，再用0.22μπι有機相微孔濾膜過濾，得試樣； (2) 試樣用帶有電噴霧電離源的液相色譜-四極桿質(zhì)譜儀進行檢測； (3) 若獲得的以m/zl56為子離子的前體離子掃描總離子流圖中出現(xiàn)色譜峰，則說明試 樣中含有偶氮色素；則進一步從總離子流圖重逐一提取各色譜峰的母離子掃描質(zhì)譜圖，以 獲得對應的母離子質(zhì)量數(shù);將獲得的母離子質(zhì)量數(shù)與已知偶氮色素的質(zhì)量數(shù)比對即可確認 試樣中所含偶氮色素的種類； 若獲得的以m/zl56為子離子的前體離子掃描總離子流圖中沒有明顯的色譜峰，則說明 試樣中不含有偶氮色素； 液相色譜參數(shù)： 色譜柱：l〇〇X2.1mm，固定相 C18，1.7ym; 流動相:A相：乙腈;B相：質(zhì)量濃度為O . 1%甲酸水溶液;柱溫:40°C ;進樣量:5汕;流動相 梯度見表1; 表1質(zhì)譜操作條件： a) 離子源：電噴霧離子源，正離子； b) 掃描方式：前體離子掃描監(jiān)測，前體離子掃描范圍160amu-600amu，子離子質(zhì)荷比為 156.0； c) 電離電壓:3.2kV;錐孔電壓:35v;碰撞能量40 ev ; d) 離子源溫度：110°C ;霧化溫度:400°C ;錐孔氣流速:50L/h;霧化氣流速:600L/h;碰撞 氣:氬氣;碰撞室壓力:3·6Χ10_3 mPa。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述非定向篩查方法，其特征在于，步驟1中， 辣椒醬與色譜純乙腈的用量比例為lg:5mL，超聲提取的條件為40°C水浴中震蕩； 所用飽和氯化鈉溶液體積等于色譜純乙腈的體積； 上層液的體積等于甲酸溶液的體積。
【文檔編號】G01N30/06GK106018646SQ201610530511
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月7日
【發(fā)明人】王駿, 祝建華, 胡梅, 宿書芳, 薛霞, 劉艷明, 徐大瑋
【申請人】山東省食品藥品檢驗研究院