一種干酪乳桿菌發(fā)酵過程及終產(chǎn)物中抗菌肽快速檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速檢測微生物發(fā)酵產(chǎn)物抗菌肽的方法。該抗菌肽，來源于干酪乳桿菌，該抗菌肽提取物具有廣譜的抑菌活性且抑菌活性較高、分子量小、熱穩(wěn)定性強(qiáng)，可代替抗生素添加到飼料中，預(yù)防畜禽各類細(xì)菌性疾病的發(fā)生，從而達(dá)到保護(hù)人體健康的目的。本發(fā)明可用于干酪乳桿菌發(fā)酵過程和終產(chǎn)物中抗菌肽的生物量測定以及快速檢測。目前的檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力還需如HPLC這樣的大型設(shè)備，本發(fā)明方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、所需時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，對干酪乳桿菌發(fā)酵條件和產(chǎn)品質(zhì)量的控制、產(chǎn)品的使用以及衍生產(chǎn)品的開發(fā)有實(shí)際應(yīng)用意義。
【專利說明】
一種干酪乳桿菌發(fā)酵過程及終產(chǎn)物中抗菌肽快速檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明可用于干酪乳桿菌發(fā)酵過程以及終產(chǎn)物中抗菌肽的檢測技術(shù)，屬于免疫檢 測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著人們生活水平和健康水平的不斷提高，人們對綠色食品的需求越來越大，消 費(fèi)者更關(guān)心食品的安全性。目前世界各國，尤其是歐洲、日本等發(fā)達(dá)國家都在大力研究和開 發(fā)高效安全的天然生物防腐劑。隨著研究的深入，國內(nèi)外學(xué)者們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌素具有非常優(yōu)良 的特性。對細(xì)菌素產(chǎn)生菌的研究，目前主要集中于乳酸菌屬中，乳酸菌幾乎每個(gè)屬中的每個(gè) 種，甚至每一株菌都能產(chǎn)生一種甚至幾種細(xì)菌素。
[0003] 干酪乳桿菌是一種可以調(diào)節(jié)動(dòng)物腸內(nèi)菌群平衡、促進(jìn)消化吸收的益生菌，發(fā)酵產(chǎn) 生具有抑菌譜廣、無抗原性、對熱穩(wěn)定的抗菌肽(細(xì)菌素），其對革蘭氏陰性和陽性病原菌具 有良好的抑制和預(yù)防作用。它還是一種益生菌，具有維持腸道內(nèi)菌群平衡，提高機(jī)體免疫 力，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種功能，被廣泛地應(yīng)用于食品發(fā)酵和防腐方面、乳制品中、醫(yī)療 保健等領(lǐng)域。特別是可以利用農(nóng)副產(chǎn)品原料，發(fā)酵干酪乳桿菌，制備成干酪乳桿菌飼料添加 劑，替代抗生素，添加于畜禽飼料，制成綠色飼料，達(dá)到調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群平衡，抑制畜禽各 類病原菌的繁殖，預(yù)防各類細(xì)菌性疾病的發(fā)生，提高畜產(chǎn)品品質(zhì)，保護(hù)人們的身體健康的目 的，也是目前公認(rèn)的一類具有潛在開發(fā)能力的天然生物性食品防腐劑。
[0004] 但是在我國干酪乳桿菌的工業(yè)化程度還較低，菌種以及發(fā)酵劑等多來至國外廠 商，沒有形成大規(guī)模的產(chǎn)業(yè)鏈，因此干酪乳桿菌行業(yè)具有很大的發(fā)展空間。申請?zhí)枺?2015107183493,發(fā)明名稱為"一種干酪乳桿菌抗菌肽的合成和抗體制備"，公開了一種干酪 乳桿菌的發(fā)酵液所產(chǎn)抗菌肽的合成和多克隆單體的制備。但是對于具體的發(fā)酵液中抗菌肽 含量快速精確的檢測，未有進(jìn)一步的研究。目前對于抗菌肽的檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力還需要如 HPLC這樣的大型設(shè)備，因此為了適應(yīng)大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)中對抗菌肽含量檢測的迫切需要，建 立一種快速、靈敏、易行的檢測抗菌肽含量的方法至關(guān)重要。不僅可用于抗菌肽發(fā)酵過程和 產(chǎn)品質(zhì)量的控制，而且對產(chǎn)品的使用以及衍生產(chǎn)品的開發(fā)也具有重要的指導(dǎo)意義。該技術(shù) 的關(guān)鍵在于能夠快速的檢測出抗菌肽在生產(chǎn)過程中和終產(chǎn)物中的量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速檢測干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌肽的檢測方法， 可用于生產(chǎn)中以及終產(chǎn)物中抗菌肽的快速檢測以及生物量的測定。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 1.抗原的制備:采用質(zhì)譜儀對得到的細(xì)菌素進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，采用固相化學(xué)合成法，用多 肽自動(dòng)合成儀合成人工干酪乳桿菌抗菌肽。在合成所述多肽序列時(shí)，在其C端增加一個(gè)半胱 氨酸，以方便與載體蛋白偶聯(lián)。多肽與KLH偶聯(lián)(偶聯(lián)劑為Sulfo-SMCC)作為免疫抗原，多肽 與BSA偶聯(lián)(偶聯(lián)劑為戊二醛)作為檢測抗原。
[0007] 2.多克隆抗體的制備:多肽與KLH偶聯(lián)(偶聯(lián)劑為Sulfo-SMCC)作為免疫抗原，免疫 新西蘭白兔，利用現(xiàn)有的多克隆抗體制備與純化技術(shù)獲得多克隆抗體，該抗體可與抗原特 異性結(jié)合。
[0008] 3. ELISA 操作方法： (1)包被過程:將抗原稀釋為0.25yg/mL，加入酶標(biāo)板中，每孔10yL，4°C過夜。（2)封閉酶 標(biāo)反應(yīng)孔:將包被液棄去，用TOST洗板3次后，每孔加入200yL封閉液(5%脫脂奶粉），37 °C封 閉1.5h，棄去封閉液，用TOST滿孔洗滌3遍，每遍3min。（3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以及抗菌肽含量測 定:將抗體稀釋5000倍，將抗原分別稀釋為0.25，0.5，1，1.5，2，4yg/mL?？贵w和不同濃度的 抗原各50yL加入酶標(biāo)孔，以及抗體和不同的樣品（培養(yǎng)基、干酪乳桿菌發(fā)酵的上清液以及 菌體抗菌肽提取液、其他菌種發(fā)酵的上清液)各50yL加入酶標(biāo)孔，37 °C孵育1.5h。（ 4)加入酶 標(biāo)抗體：用PBST洗板5次后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，每孔100yL，加入酶標(biāo) 板，37°C孵育此。（5)顯色反應(yīng)：用PBST洗板5次后，加入每孔100yL的TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，37 °C暗處放置15min。（ 6)終止反應(yīng):每孔加入50yL2M濃硫酸終止反應(yīng)。（7)結(jié)果判斷:終止反應(yīng) 后立即采用450nm波長檢測。
[0009] 4.所需試劑： (1) 0·01Μ PBS緩沖液(ρΗ=7·4) NaCl 8g KC1 0.2g Na2HP04 1.42g KH2PO4 0 · 27g 加超純水定容至lOOOmL (2) roST洗滌液 在上述roS緩沖液中加入0.5mL Tween-20 (3) 封閉液5%脫脂奶粉 脫脂奶粉 lg 超純水 20mL (4) 抗原稀釋液0.05M CBS(pH9.6) Na2C03 1.5g NaHC03 2.93g 超純水 lOOOmL (5) 抗體稀釋液 PBS緩沖液 (6) 顯色液TMB購于SIGMA (7) 終止液2M的H2S〇4 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于建立了一種快速、靈敏、易行的檢測干酪乳酸桿菌抗菌肽在生產(chǎn)過 程中以及終產(chǎn)物中量的方法，這對抗菌肽的大規(guī)模生產(chǎn)以及產(chǎn)品的使用和衍生產(chǎn)品的開發(fā) 具有重要的指導(dǎo)意義。
【附圖說明】
[0010]圖1抗菌肽檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立、培養(yǎng)基背景測定、發(fā)酵液和菌體中抗菌肽含量測定、特異性實(shí) 驗(yàn) 按照配方配制MRS、玉米(pH6.0)、玉米(pH6.5)、豆柏（pH6.0)、豆柏（pH6.5)培養(yǎng)基，分 裝后滅菌待用。將干酪乳桿菌按照百分之二的接種量接種于上述培養(yǎng)基中，放于28°C培養(yǎng) 48h后各取2mL離心取上清，放于4°C待測。取40mL離心棄上清，加入40mL PBS混勻，使用超聲 破碎儀破碎至菌體裂解，離心后取上清，放于4° C待測。在玉米(pH6.0)培養(yǎng)基中分別按百分 之二的接種量，接種副干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌BT-14、 大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌。放入28° C培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后離心取上清，放入4° C待 測。
[0012] 1)包被過程：將抗原稀釋為0.25yg/mL，每孔10yL加入酶標(biāo)板中，置于4°C冰箱過 夜。
[0013] 2)封閉酶標(biāo)反應(yīng)孔:次日取出酶標(biāo)板，將包被液棄去，用PBST每孔300yL洗板3次每 次3min，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，每孔加入200yL封閉液(5 %脫脂奶粉），37 °C封閉1.5h， 棄去封閉液用PBST每孔300yL洗板3次每次3min。
[0014] 3)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線以及樣品測定:將抗體稀釋5000倍，將抗原分別稀釋為0.25,0.5， 1，1.5，2,4yg/mL。將抗體和不同濃度的抗原各50yL，以及抗體和不同的樣品（培養(yǎng)基、干酪 乳桿菌發(fā)酵的上清液、干酪乳桿菌菌體抗菌肽提取液、其他菌種發(fā)酵的上清液)各50yL加 入酶標(biāo)孔37°C孵育1.5h。
[0015] 4)加入酶標(biāo)抗體：用TOST洗板5次后，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，每 孔l〇〇yL，加入酶標(biāo)板，37°C孵育lh。
[0016] 5)顯色反應(yīng)：用TOST洗板5次后，加入每孔100yL的TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，37°C暗處放 置15min〇
[0017] 6)終止反應(yīng):每孔加入50yL2M濃硫酸終止反應(yīng)。
[0018] 7)結(jié)果判斷：終止反應(yīng)后立即采用450nm波長檢測，標(biāo)準(zhǔn)曲線測定結(jié)果見表一，標(biāo) 準(zhǔn)曲線見圖1。培養(yǎng)基、干酪乳桿菌發(fā)酵的上清液以及菌體抗菌肽提取液測定結(jié)果見表二。 其他菌種發(fā)酵的上清液見表三。
[0019] 2.結(jié)果分析 1) 由圖1可知，在0.25~4yg/mL的抗原濃度之間，所得數(shù)據(jù)線性關(guān)系良好，該方法準(zhǔn)確性 尚。
2) 培養(yǎng)基的0D45Q值相當(dāng)于空白對照，各培養(yǎng)基的0D45Q值差異不大，對于比較各培養(yǎng)基 抗菌肽的含量時(shí)沒有較大影響，要使所測樣品結(jié)果更準(zhǔn)確則應(yīng)減去空白對照對應(yīng)的抗菌肽 含量。
[0021] 3)由表二干酪乳桿菌發(fā)酵的上清液測定結(jié)果，可知玉米培養(yǎng)基中抗菌肽含量較 多，特別是玉米(PH6.0)培養(yǎng)基中最多，豆柏培養(yǎng)基中抗菌肽含量比玉米少比MRS多。出現(xiàn)這 個(gè)結(jié)果可能是由于培養(yǎng)基對干酪乳桿菌產(chǎn)抗菌肽有一定影響，也可能是干酪乳桿菌在MRS 中生長量遠(yuǎn)低于玉米和豆柏培養(yǎng)基。
[0022] 4)干酪乳桿菌菌體內(nèi)抗菌肽含量測定所得結(jié)果見表二?？梢娍咕暮亢苌伲?測得0D值太大，超過了標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，所以計(jì)算出的抗菌肽含量僅作參考，不能作為真正的 準(zhǔn)確值。
[0023] 5)由表三可知，在玉米(pH6.0)培養(yǎng)基中副干酪乳桿菌、枯草芽孢桿菌、側(cè)孢芽孢 桿菌、蘇云金芽孢桿菌BT-14、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌的發(fā)酵上清液0D45Q值都 很大，并且已超過標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，可認(rèn)為幾乎檢測不出該抗菌肽，而在同樣的培養(yǎng)基中干酪 乳桿菌的發(fā)酵上清液中可檢測出1.013yg/mL (若減去培養(yǎng)基的背景值則為0.755yg/mL)的 抗菌肽。由此結(jié)果可知，該檢測方法的特異性強(qiáng)。
注:上清液中抗菌肽含量為微克每毫升發(fā)酵的上清液，菌體中抗菌肽含量為微克每毫 升 PBS。
[0025]
3.發(fā)酵前后菌體計(jì)數(shù) 1)菌種活化:將干酪乳桿菌按百分之二的接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，放于28° C培養(yǎng) 36h后對干酪乳桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。
[0026] 2)菌體接種;將干酪乳桿菌按照百分之二的接種量接種于MRS、玉米(pH6.0)、玉米 (口冊.5)、豆柏(？冊.0)、豆柏(？冊.5)培養(yǎng)基中，放于28°(：培養(yǎng)。
[0027] 3)發(fā)酵后菌體計(jì)數(shù):將上述接種后的培養(yǎng)基放于28° C培養(yǎng)48h后對干酪乳桿菌進(jìn) 行計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)結(jié)果見表二。
[0028] 4)結(jié)果分析：由表二可知，干酪乳桿菌在各培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，除了MRS中的菌體數(shù) 量較少，其他培養(yǎng)基菌體數(shù)量差異不大。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 本發(fā)明的目的是提供一種抗菌肽的快速檢測方法，可用于發(fā)酵過程和終產(chǎn)物中抗菌 肽的測定，該抗菌肽，來源于干酪乳桿菌，抑菌譜廣，抑菌效果明顯，熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性 強(qiáng)。2. 權(quán)利要求書1所述快速檢測法的特征在于，其中包括該抗菌肽標(biāo)準(zhǔn)溶液和特異性抗 體，可用于干酪乳桿菌發(fā)酵過程和終產(chǎn)物中抗菌肽的生物量測定以及快速檢測，并且具有 靈敏度高、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。3. 權(quán)利要求書2所述抗菌肽的特異性抗體為本人申請?zhí)枺?015107183493,發(fā)明名稱為 "一種干酪乳桿菌抗菌肽的合成和抗體制備"所制備的多克隆抗體。4. 本發(fā)明提供的一種抗菌肽快速檢測方法的步驟為:將抗原稀釋為0.25yg/mL，加入酶 標(biāo)板中，每孔1〇μL，4°(：過夜，將包被液棄去，用PBST洗板3次后，每孔加入20(^封閉液(5%脫 脂奶粉），37°C封閉1.5h，棄去封閉液，用TOST滿孔洗滌3遍，每遍3min，將抗體稀釋5000倍， 將抗原分別稀釋為0.25，0.5，1，1.5，2，4yg/mL，抗體和不同濃度的抗原各50yL加入酶標(biāo) 孔，以及抗體和不同的樣品（培養(yǎng)基、干酪乳桿菌發(fā)酵的上清液以及菌體抗菌肽提取液、其 他菌種發(fā)酵的上清液)各50此加入酶標(biāo)孔，37 °C孵育1.5h，結(jié)束后用PBST洗板5次，加入辣根 過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔的二抗，每孔l〇〇yL，加入酶標(biāo)板，37 °C孵育lh，結(jié)束后用TOST洗板5 次后，加入每孔l〇〇yL的TMB進(jìn)行顯色反應(yīng)，37°C暗處放置15min，結(jié)束后每孔加入50yL 2M濃 硫酸終止反應(yīng)，終止反應(yīng)后立即采用450nm波長檢測。
【文檔編號】G01N33/68GK106018823SQ201610332233
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】趙建, 彭靜珊, 李寧浙, 吳道艷, 易思君, 曹玫
【申請人】四川大學(xué)