一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的spe?hplc法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE?HPLC法，包括以下步驟：A、對照品溶液的制備；B、供試品溶液的制備：采用固相萃取方法制備供試品溶液；C、液相色譜檢測：D、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立；E、樣品測定。本發(fā)明選用固相萃取法制備供試液，可獲得近100%的萃取回收率，并有效除去供試品中的無機(jī)鹽及有機(jī)雜質(zhì)，有利于延長色譜柱使用壽命。固相萃取法可批量處理樣品，易于實(shí)現(xiàn)自動化，提高工作效率?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道的方法大多都采用C18色譜柱，而本方法選用氨基柱為分析柱，與之比較，本方法柱效高，峰型尖銳，干擾少。本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，分析過程中雜質(zhì)干擾少。
【專利說明】
_種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLG法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量方法，特別涉及一種測定樂舒洗液中 黃柏堿含量的SPE-HPLC法。
【背景技術(shù)】
[0002] 樂舒洗液是廣西柳州市婦幼保健院專家根據(jù)中醫(yī)理論，經(jīng)過多年的臨床實(shí)踐而制 成的中藥制劑(批準(zhǔn)文號：桂藥制字Z02060005)，由百部、黃柏、苦參、鶴虱、白鮮皮、蛇床子 等九味藥物組成，10余年的臨床應(yīng)用表明，樂舒洗液對婦科外陰炎、陰道炎等生殖道感染有 良好的療效，但該制劑一直缺乏切實(shí)有效的質(zhì)量控制方法。
[0003] 近年來，分析工作者對中藥質(zhì)控方法進(jìn)行了廣泛的研究，建立了多種薄層色譜法 (TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法等對中藥婦科洗劑中的某些成分進(jìn)行定性、 定量分析。目前公開有以下的相關(guān)文獻(xiàn)： 1、劉東順、陸文銓、樸淑娟等的"安舒液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究"。
[0004] 色譜條件：Z0RBAX 38-(：18柱（4.6 mmX250 mm，5 _)分離，柱溫40°C;以乙腈-0.1%磷酸（1000 mL加50 yL二乙胺）為流動相梯度洗脫(0~8 min，10%~18%乙腈;8~13 min，18%~30%乙腈；13~20 min，30%乙腈），流速1 ? OmL/min，檢測波長284nm，進(jìn)樣量為lOy L〇
[0005] 供試品溶液制備方法取本品10mL置于錐形瓶中，加 20mL純水，混勻，再加濃氨 水0.5mL，用二氯甲烷萃取3次(每次30mL)，合并下層萃取液，45°C蒸干，用5mL甲醇溶解并用 初始流動相定容至25mL，過濾，取續(xù)濾液，即得。
[0006] 結(jié)果：在0. 05~2.5yg范圍內(nèi)，黃柏堿的峰面積比與濃度呈良好的線性關(guān)系(r = 0.9999)，平均回收率分別為101.62%，精密度RSD為0.8%，重復(fù)性RSD為0.4%。
[0007] 不足:安舒液與本院的樂舒洗液的組方和生產(chǎn)工藝不盡相同，制劑中有效成分或 雜質(zhì)也不同，因此文獻(xiàn)報道的含量測定方法不能直接用于測定樂舒洗液的黃柏堿。文獻(xiàn)的 供試品溶液制備方法為液-液萃取法，該方法操作繁瑣，不能去除脂溶性雜質(zhì)。
[0008] 2、毛桂福、陸肖玉等的"高效液相色譜法同時測定樂舒洗液中黃柏堿和小檗堿含 里〇
[0009] 色譜條件:色譜柱為SPD-20AC18柱(4.6 mmX250 mm，5.0wii);柱溫30°C;流動相為 乙腈(A)-0.2%三乙胺（磷酸調(diào)PH 3.95)(B)，梯度洗脫，洗脫程序見下表;流速1.0 mL. min-S檢測波長為284 mn;進(jìn)樣量為20 yL〇
[0010] 表1梯度洗脫程序 供試品溶液的制備:將樂舒洗液樣品超聲30 min，0.45 mi微孔濾膜過濾，取其續(xù)濾液， 即得供試品溶液。
[0011]結(jié)果:在6.3~201.6yg ? ml/1范圍內(nèi)，黃柏堿的峰面積比與濃度呈良好的線性關(guān)系 (r=0.9996)，平均回收率分別為100.6%，精密度RSD為1.9%，重復(fù)性RSD為1.9%。
[0012] 不足:筆者先前建立樂舒洗液中黃柏堿的含量測定方法可用于測定樂舒洗液的黃 柏堿。但供試品溶液制備方法為過濾后直接測定，該方法操作簡單，但不能有效去除脂溶性 雜質(zhì)，從色譜圖可知雜質(zhì)較多，易干擾測定，分析少量樣品后柱效就容易使降低。
[0013] 綜上所述，由于中藥制劑成分復(fù)雜、同類制劑組方不同或生產(chǎn)工藝不同等原因，各 中藥婦科洗劑的有效成分或雜質(zhì)不一，因此文獻(xiàn)報道的鑒別和含量測定方法不能直接用作 樂舒洗液的質(zhì)控方法，或者是方法有一定的缺陷，需要進(jìn)一步改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：提供一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLC 法，該方法選用固相萃取法制備供試品溶液，可獲得近100%的萃取回收率，并有效除去供試 品溶液中的無機(jī)鹽及有機(jī)雜質(zhì)，有利于延長色譜柱使用壽命，固相萃取法可批量處理樣品、 易于自動化、提高工作效率。本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，分析過程中雜質(zhì)干擾 少。
[0015]解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是：一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLC 法，包括以下步驟： A、 對照品溶液的制備:稱取黃柏堿對照品，用甲醇定容，制成對照品儲備液，將黃柏堿 對照品儲備液逐級稀釋，制備成系列濃度對照品工作液； B、 供試品溶液的制備： B1、取樂舒洗液超聲處理，搖勻，濾過，取濾液備用； B2、取濾液過已活化的Bond Elut plexa PCX混合型強(qiáng)陽離子交換小柱，依次用 0.5mol ? I/1鹽酸、甲醇和體積濃度50%甲醇溶液洗滌，棄去洗液，抽干，最后用氨水-甲醇溶 液洗脫，氨水_甲醇溶液中氨水與甲醇的體積比為2:8,控制流速在1~1.5 mL ? mirT1，取洗 脫液置于88~92°C水浴中空氣吹干，精密加入流動相，渦旋震蕩使溶解殘渣，即得供試品溶 液； C、 液相色譜檢測:待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，用步驟A制備的對照品工作液進(jìn)樣，液相色譜檢 測，在此基礎(chǔ)上，對步驟B制備的供試品溶液進(jìn)行液相色譜檢測； 液相色譜柱選用Platisil-Mfc柱，5.0讓，250 mmX4.6 mm;檢測條件： 柱溫：30°C; 測定波長：286 nm; 進(jìn)樣量：15yL或20 yL; 流動相:0.3%三乙胺-四氫呋喃-乙腈溶液，其中0.3%三乙胺、四氫呋喃、乙腈的體積 比為18:12:70，所述的0.3%三乙胺用磷酸調(diào)pH值為3.82; 流速：1 ? 〇 mL ? min-1; D、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:以對照品工作液的進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線； E、 樣品測定:將測定的供試品溶液的黃柏堿的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得到供 試品溶液中的黃柏堿含量。
[0016]本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案是:步驟B1中，超聲處理的條件為功率400W，頻率40kHz， 超聲處理的時間為25~35min。
[0017] 步驟B2中，Bond Elut plexa PCX混合型強(qiáng)陽離子交換小柱規(guī)格為500mg/6mL，其 活化是先后用5 mL甲醇、0.5mol ?ml/1鹽酸溶液5mL沖洗。
[0018] 步驟B2中，0.5mol ? L-1鹽酸和甲醇用量分別為10~15mL;50%甲醇的用量為5~ 7mL;氨水-甲醇溶液的用量為18~25 mL。
[0019] 步驟D中，對照品工作液的濃度分別為61.0yg ? mL-\30.50yg ? mL-\l5.25yg ? mL -1 o
[0020] 由于樂舒洗液中含明礬較多，直接對其濾液進(jìn)行色譜分析，無機(jī)鹽容易析出，使柱 效迅速降低，柱壓快速升高，造成堵塞流路系統(tǒng)。選用固相萃取法制備供試液，可獲得近 100%的萃取回收率，并有效除去供試品中的無機(jī)鹽及有機(jī)雜質(zhì)，有利于延長色譜柱使用壽 命。固相萃取法可批量處理樣品，易于實(shí)現(xiàn)自動化，提高工作效率?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報道的方法大 多都采用C 18色譜柱，而本方法選用氨基柱為分析柱，與之比較，本方法柱效高，峰型尖銳，干 擾少。本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，分析過程中雜質(zhì)干擾少。
[0021] 本發(fā)明采用固相萃取法、高效液相色譜法等現(xiàn)代分析手段，建立樂舒洗液制劑中 黃柏堿的定量分析方法，為提高該制劑質(zhì)量提供科學(xué)的技術(shù)方法，為建立同類中藥制劑質(zhì) 控方法提供參考依據(jù)。
[0022]下面，結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明之一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLC 法的技術(shù)特征作進(jìn)一步的說明。
【附圖說明】
[0023]圖1:黃柏堿對照品工作液的色譜圖。
[0024] 圖2:固相萃取方法制備的黃柏堿供試品溶液的色譜圖（樂舒洗液批號： 2015121501)。
[0025] 圖3:固相萃取方法制備的缺黃柏的陰性樣品溶液的色譜圖。
[0026] 圖4:固相萃取方法制備的黃柏堿供試品溶液的色譜圖（樂舒洗液批號： 2016042001)。
[0027] 圖5:微孔濾膜過濾后的黃柏堿供試品溶液的色譜圖。
[0028] 圖中1為黃柏堿。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 1、儀器與試劑 島津LC-20AT四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)(LC-20AT栗，Rheodyne 7725i型進(jìn)樣閥，SH)-20A紫外檢測器，CT0-20A柱溫箱，DGU-20A在線脫氣機(jī)，日本島津），PHS-3C型PH計(上海精密 科學(xué)儀器有限公司），KQ-300DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超生儀器有限公司）， HANGPINGFA1004型電子天平(上海天平儀器廠）；Agilent公司Bond Elut Plexa PCX混合型 強(qiáng)陽離子交換小柱(500mg/6mL)。
[0030] 黃柏堿對照品（批號：110721，含量彡98%，四川省維克奇生物科技有限公司）。甲 醇、乙腈為高效液相色譜級試劑，水為重蒸餾水，其他試劑均為分析純。樂舒洗液樣品（柳州 市婦幼保健院制劑室，批號：2015121501、2015121502、2015121503、2016042001、 2016042002)〇
[0031] 2、對照品溶液的制備 精密稱取黃柏堿對照品6.10 mg置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得黃柏堿對照品 儲備液0.61 mg ?ml/1。臨用前分別取該對照品儲備液適量置于10 mL容量瓶中，加甲醇定 容，得到濃度分別為61.0yg ? mL-\30.50yg ? mL-\15.25 yg ? mL-1的黃柏堿對照品工作液。 [0032] 3、供試品溶液的制備 取密封的500mL樂舒洗液超聲處理(功率400 W，頻率40kHz)30min，搖勻，濾過，精密量 取續(xù)濾液2 mL，加于Bond Elut plexa PCX混合型強(qiáng)陽離子交換小柱（預(yù)先依次用甲醇5 mL、0.5mol .mL-1鹽酸溶液5mL活化）上，流速約每分鐘1~1.5 mL，依次用0.5mol .mL-1鹽 酸溶液12mL、甲醇12 mL、50%甲醇水溶液6mL洗滌，棄去洗液，抽干1 min，再用20mL氨水-甲 醇溶液洗脫(2:8，體積比），收集洗脫液，取20mL洗脫液置于90 °C水浴中吹干，殘渣精密加入 流動相2 mL渦旋震蕩使溶解，即得供試品溶液。
[0033] 4、陰性樣品溶液的制備 另按樂舒洗液處方比例稱取缺黃柏的藥材，按照樂舒洗液制備工藝制備缺黃柏的陰性 樣品，再按"3、供試品溶液的制備"項(xiàng)下方法操作制備缺黃柏的陰性樣品溶液。
[0034] 5、色譜條件 色譜柱:Platisil-NH2 柱（250 mmX4.6 mm，5.0_);柱溫30°C;流動相為0.3%三乙胺 (磷酸調(diào)?!13.82)-四氫呋喃-乙腈（18:12:70^/^/「）；流速1.〇1111^111111- 1;檢測波長為 286 mn;進(jìn)樣量為15或20yL (標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)樣量有15或20此，其余為20此）。理論塔板數(shù)按黃 柏堿峰計算應(yīng)不低于12 000。
[0035] 6、干擾試驗(yàn) 分別量取陰性樣品溶液、苦參堿對照品溶液及2個批號（2015121501、2016042001)的供 試品溶液各20此進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1~圖4。再取超聲處理后樂舒洗液(批號2016042001) 適量，以〇.45_微孔濾膜過濾，量取續(xù)濾液20此進(jìn)樣檢測，結(jié)果見圖5。從色譜圖可見，陰性 樣品溶液在與供試品溶液的色譜圖中的苦參堿吸收峰位置上無色譜峰出現(xiàn)，表明陰性樣品 中其他雜質(zhì)對測定無干擾。而微孔濾膜過濾制備的供試液，雜質(zhì)峰特別多，嚴(yán)重干擾檢測。 [0036] 7、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 量取61.0、30.50、15.25辟11/1的對照液，分別進(jìn)樣15或20此，記錄峰面積，以對照 品工作液的進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃柏堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方 程為4=32964 乂+202514=0.9997。結(jié)果表明，黃柏堿在11.44~61.0邱.1111/1范圍內(nèi)線性 關(guān)系良好。
[0037] 8、精密度試驗(yàn) 精密量取含30.50 yg ?ml/1黃柏堿對照液進(jìn)樣，重復(fù)6次。黃柏堿的RSD為0.94%(n= 6)，表明儀器精密度良好。
[0038] 9、重復(fù)性試驗(yàn) 精密量取同一批號樣品6份，按"3、供試品溶液的制備"項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣 測定含量。結(jié)果，黃柏堿的RSD分別為1.63%(n=6)，表明該方法重復(fù)性良好。
[0039] 10、穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于〇,2,4,6,8 1!進(jìn)樣，測定黃柏堿的峰面 積，計算黃柏堿的RSD為1. 93%，結(jié)果表明供試品溶液室溫放置8 h內(nèi)穩(wěn)定。
[0040] 11、固相萃取回收率試驗(yàn) 精密量取一定量的已知濃度黃柏堿對照品溶液，按"3、供試品溶液的制備"項(xiàng)下方法制 備供試品溶液，分別測定黃柏堿的含量，與加入量比較計算回收率。結(jié)果見下表。
[0041] 表2黃柏堿的固相萃取回收率試驗(yàn)結(jié)果(Z3 = 10)
12、加樣回收率 將已知黃柏堿含量的樣品超聲30 min，濾紙濾過，精密吸取2 mL樣品共9份分別上樣于 活化的PCX混合型強(qiáng)陽離子交換小柱中，分別加入一定量的黃柏堿對照液，依照"3、供試品 溶液的制備"項(xiàng)下方法處理，測定黃柏堿的含量并計算回收率。結(jié)果見下表。
[0042] 表3黃柏堿的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)
13、樣品測定 取5批樂舒洗液樣品，按"3、供試品溶液的制備"項(xiàng)下方法制備各供試品溶液，分別進(jìn)樣 測定峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算其含量。結(jié)果見下表。
[0043] 表4樂舒洗液中黃柏堿含量的測定結(jié)果(n = 2)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLC法，其特征在于:包括以下步驟： A、 對照品溶液的制備:稱取黃柏堿對照品，用甲醇定容，制成對照品儲備液，將黃柏堿 對照品儲備液逐級稀釋，制備成系列濃度對照品工作液； B、 供試品溶液的制備： B1、取樂舒洗液超聲處理，搖勻，濾過，取濾液備用； B2、取濾液過已活化的Bond Elut plexa PCX混合型強(qiáng)陽離子交換小柱，依次用 0.5mol · I/1鹽酸、甲醇和體積濃度50%甲醇溶液洗滌，棄去洗液，抽干，最后用氨水-甲醇溶 液洗脫，氨水-甲醇溶液中氨水與甲醇的體積比為2:8,控制流速在1~1.5 mL · mirT1，取洗 脫液置于88~92°C水浴中空氣吹干，精密加入流動相，渦旋震蕩使溶解殘渣，即得供試品溶 液； C、 液相色譜檢測：待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，用步驟A制備的對照品工作液進(jìn)樣，液相色譜檢 測，在此基礎(chǔ)上，對步驟B制備的供試品溶液進(jìn)行液相色譜檢測； 液相色譜柱選用Platisil-Mfc柱，5.0 μηι，250 mmX4.6 mm;檢測條件： 柱溫：30°C; 測定波長：286 nm; 進(jìn)樣量：15yL或20 yL; 流動相:0.3 %三乙胺-四氫呋喃-乙腈溶液，其中0.3%三乙胺、四氫呋喃、乙腈的體積 比為18:12:70，所述的0.3%三乙胺用磷酸調(diào)pH值為3.82; 流速：1 · 〇 mL · min-1; D、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：以對照品工作液的進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲線； E、 樣品測定:將測定的供試品溶液的黃柏堿的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得到供 試品溶液中的黃柏堿含量。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLC法，其特征在于： 步驟B1中，超聲處理的條件為功率400W，頻率40kHz，超聲處理的時間為25~35min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLC法，其特征在于： 步驟B2中，Bond Elut plexa PCX混合型強(qiáng)陽離子交換小柱規(guī)格為500mg/6mL，其活化是先 后用5 mL甲醇、0.5mol .mL-1鹽酸溶液5mL沖洗。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLC法，其特征在于： 步驟B2中，0.5mol · I/1鹽酸和甲醇用量分別為10~15mL;50%甲醇的用量為5~7mL;氨水-甲 醇溶液的用量為18~25 mL。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測定樂舒洗液中黃柏堿含量的SPE-HPLC法，其特征在于： 步驟D中，對照品工作液的濃度分別為61 .Oyg · 110^30.5(^ · mL-1、15.25yg · mL-1。
【文檔編號】G01N30/02GK106053685SQ201610503208
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月27日
【發(fā)明人】毛桂福, 曾定元, 王麟, 楊妮
【申請人】柳州市婦幼保健院