快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，包括：(1)將水稻花藥包埋冷凍、切片，將含有水稻花藥組織的切片貼于載玻片上；(2)在切片上滴加Fluo?3AM熒光探針?lè)跤?，?～37℃培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1～120min后，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片；(3)用熒光顯微鏡觀察裝載有Fluo?3AM熒光探針的切片。該方法快速準(zhǔn)確，適用于需要大批量檢測(cè)和研究工作，并可被推廣應(yīng)用于其他植物組織中游離鈣離子分布的檢測(cè)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法?！颈尘凹夹g(shù)】
[0002]鈣離子是植物和動(dòng)物機(jī)體的重要元素，同時(shí)作為細(xì)胞內(nèi)第二信使通過(guò)與鈣調(diào)蛋白結(jié)合激活多種蛋白激酶，從而在許多生命活動(dòng)中擔(dān)當(dāng)重要的角色，是細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡、 細(xì)胞感受胞外刺激及環(huán)境生態(tài)適應(yīng)等各項(xiàng)生物活動(dòng)均不可缺少的元素。因此，農(nóng)作物器官中的鈣離子活性與分布檢測(cè)，對(duì)于揭示作物器官的生理活力與細(xì)胞凋亡變化具有重要意義。
[0003]花器官是農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育對(duì)干旱、高溫和冷害等逆境氣候響應(yīng)最敏感和最易受損傷的器官，尤其是對(duì)傳統(tǒng)的自花授粉農(nóng)作物(如，水稻、小麥等)而言，花器官發(fā)育過(guò)程的受到逆境損傷通常不容易被感官覺(jué)查，常規(guī)生理方法也難以檢測(cè)到花粉發(fā)育過(guò)程(包括小孢子母細(xì)胞的減數(shù)分裂、小孢子的發(fā)育、雄配子的形成)的復(fù)雜生理生化變化，因而探索水稻和小麥等農(nóng)作物花藥發(fā)育過(guò)程中Ca2+活性及其分布變化已成為研究其花器官逆境損傷和不育系形成生理過(guò)程及其鑒定的一種極重要手段。
[0004]目前，在小麥和水稻上廣泛使用的檢測(cè)其花器官Ca2+分布的方法是石蠟切片或半薄切片焦銻酸鉀沉淀法，這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)是切片進(jìn)行染色后，其生物組織結(jié)構(gòu)形態(tài)和結(jié)構(gòu)較為清晰，細(xì)胞界限分明，但是這兩種方法的缺點(diǎn)是:(1)制片需要經(jīng)過(guò)取材、固定、梯度脫水、滲透、包埋、切片、染色，特別是石蠟切片更要經(jīng)過(guò)脫蠟、復(fù)水、染色、脫水等步驟，制片過(guò)程繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，工作量大，難以進(jìn)行大批量的樣品檢測(cè)；(2)在石蠟切片和半薄切片制片過(guò)程中要經(jīng)過(guò)固定，殺死細(xì)胞，使切片組織喪失酶活，不能用來(lái)檢測(cè)活細(xì)胞。
[0005]F1UO-3AM是一種可以穿透細(xì)胞膜的熒光染料，進(jìn)入細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3,從而滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3可以和鈣離子結(jié)合，結(jié)合鈣離子后產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，可以檢測(cè)游離1丐離子分布。例如21^1^(參考文獻(xiàn):21^1^，￥.11.，1^1^61，2.311(11(11〇，]\ (1998)Determinat1n of intracellular Ca2+in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Flu〇-3under low temperature.PLANT JOURNAL, 15,147-151.)使用完整的新鮮的小麥根組織通過(guò)低溫裝載Flu〇-3AM探針觀察小麥根細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的分布;劉諱(參考文獻(xiàn):劉諱，孫德蘭，王紅，簡(jiǎn)令成，尚忠林，王學(xué)臣and趙可夫(2001)低溫處理對(duì)冬、春小麥細(xì)胞Ca2+時(shí)空變化的影響.植物學(xué)報(bào)，1218-1223.)用Fluo-3AM染色，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)方法，對(duì)小麥葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體Ca2+的時(shí)空變化進(jìn)行了比較;郭光明(參考文獻(xiàn):郭光明，張福鎖，尚忠林and張錫梅(2002)硼對(duì)百合花粉萌發(fā)過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子的影響.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，7,32-37.)利用激光共聚焦顯微鏡觀察低溫裝載有鈣離子熒光探針Fluo-3的百合花粉的細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子;Zhu(參考文獻(xiàn):Zhu，K.，Guo，X.，Guo，X.，Peng，W.and Zhou，H.(2013)Protective effects of wheat germ protein isolate hydrolysates (WGPIH)against hydrogen peroxide-1nducedoxidative stress in PC12cells.Food Research Internat1nal，53，297-303?)用Fluo-3AM孵育小麥胚芽細(xì)胞檢測(cè)鈣離子濃度變化。
[0006]F1UO-3AM探針要求被裝載的組織能保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶活性，上述技術(shù)方案中，F(xiàn)lu〇-3AM探針的檢測(cè)對(duì)象為完整組織、原生質(zhì)體或者用于離體培養(yǎng)的花粉、細(xì)胞等。但是，水稻花藥發(fā)育是個(gè)連續(xù)不間斷的復(fù)雜過(guò)程，其花藥結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不同發(fā)育階段其花藥結(jié)構(gòu)也發(fā)生相應(yīng)的形態(tài)變化，例如:S8a時(shí)期即二分體時(shí)期，藥室從外到內(nèi)依次為外表皮層、內(nèi)層、中間層、絨氈層、二分體，及連接四個(gè)藥室的藥隔；而S10時(shí)期，即小孢子減數(shù)分裂中期，藥室從外到內(nèi)依次劃分為外表皮細(xì)胞，絨氈層，小孢子(參考文獻(xiàn):Zhang，D.and Wilson,Z.A.(2009)Stamen specificat1n and anther development in rice.Chinese Science 811116^11，54,2342-2353.)。其次，水稻花藥透明性差。因此，若對(duì)花藥組織直接進(jìn)行染色，則無(wú)法區(qū)分花器官發(fā)育過(guò)程各個(gè)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞中鈣離子分布。所以需要通過(guò)制作即能維持花藥結(jié)構(gòu)完整，又能保持花藥各組織細(xì)胞活性的冰凍切片，才能形象直觀的觀察并區(qū)分水稻花藥內(nèi)部各組織結(jié)構(gòu)鈣離子分布。
[0007]尹增芳通過(guò)制作鵝掌楸花藥冰凍切片，裝載F1UO-3AM探針，探索了鵝掌楸花粉發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞游離Ca2+的分布(參考文獻(xiàn):Yin，Z.，Ning，D.，Li，Y.，Xi，M.and Shi，J.(2007) Dynamic Change of Free Ca2+during Pollen Development of Lir1dendron tulipiferaXL.chinense.Scientia Silvae Sinicae?43，27-31，175-176?)〇
[0008]但是通過(guò)制作冰凍切片，裝載F1UO-3AM探針在觀察作物花藥，尤其是水稻花藥中鈣離子分布的應(yīng)用未見(jiàn)報(bào)道。其主要原因在于:首先，鵝掌楸為落葉大喬木，其花藥體積大， 制作冰凍切片時(shí)易于操作，水稻花藥的體積遠(yuǎn)小于鵝掌楸，較難操作;其次，鵝掌楸屬于耐寒植物，在-15°C低溫下生長(zhǎng)完全不受傷害，在制作冰凍切片時(shí)，低溫冷凍過(guò)程中不易形成冰晶，能較好地維持植物細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，保持植物組織的完整性，但是，水稻花藥水分含量高，極不耐寒，透明性差，其大量的水分使得植物樣品在低溫冷凍過(guò)程中易形成冰晶，損傷植物細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，難以保持植物組織的完整性;再次，F(xiàn)lu〇-3AM的裝載效果受到孵育對(duì)象，孵育溫度、時(shí)間及濃度等影響。
[0009]目前應(yīng)用于植物冰凍切片的包埋方法可總結(jié)為三種:①直接包埋法，該方法最為簡(jiǎn)便，但是包埋劑凝固過(guò)程緩慢，易形成冰晶損傷，造成切片破損，結(jié)構(gòu)不完整;②液氮速凍法，即將組織放入軟塑瓶蓋，加適量0CT包埋劑浸沒(méi)，然后將其放入液氮液面上方，使包埋組織迅速冰結(jié)成塊，此法會(huì)造成組織與包埋劑接觸面極易出現(xiàn)氣泡，且對(duì)于不規(guī)則的組織難以固定好方向，影響切片的角度，成片效果差;③冷凍保護(hù)劑法，即將組織浸入保護(hù)劑中進(jìn)行固定滲透，降低組織細(xì)胞內(nèi)溶液的冰點(diǎn)，但固定滲透過(guò)程中，會(huì)影響細(xì)胞滲透勢(shì)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子分布的變化。水稻花藥小，水分含量多，更是增加了冰凍切片難度，這三種方法都不能獲得最佳效果。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，該方法快速準(zhǔn)確，適用于需要大批量檢測(cè)和研究工作，并可被推廣應(yīng)用于其他植物組織中游離鈣離子分布的檢測(cè)。
[0011]—種快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，包括:
[0012](1)將水稻花藥包埋冷凍、切片，將含有水稻花藥組織的切片貼于載玻片上；
[0013](2)在切片上滴加F1UO-3AM熒光探針?lè)跤海??37°C培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1? 120min后，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片；[〇〇14](3)用熒光顯微鏡觀察裝載有Flu〇-3AM熒光探針的切片。[〇〇15]為保持水稻花藥組織細(xì)胞的活性，使用剛采摘的新鮮水稻花藥，并保證花藥完整。 [〇〇16] F1UO-3AM熒光探針進(jìn)入水稻花藥細(xì)胞后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3,從而滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3可以和游離鈣離子結(jié)合，并且結(jié)合鈣離子后產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，從而可以檢測(cè)水稻花藥中游離鈣離子分布。水稻花藥發(fā)育是個(gè)連續(xù)不間斷的復(fù)雜過(guò)程，其花藥結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且不同發(fā)育階段其花藥結(jié)構(gòu)也發(fā)生相應(yīng)的形態(tài)變化;其次，水稻花藥透明性差。因此，若對(duì)花藥組織直接進(jìn)行染色，則無(wú)法區(qū)分花器官發(fā)育過(guò)程各個(gè)組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞中鈣離子分布。所以，需要制作即能維持花藥結(jié)構(gòu)完整，又能保持花藥各組織細(xì)胞活性的冰凍切片，用Flu〇-3AM熒光探針?lè)跤衅?，更能形象直觀的觀察并區(qū)分水稻花藥內(nèi)部各組織結(jié)構(gòu)鈣離子分布。
[0017]作為優(yōu)選，步驟(1)中，水稻花藥包埋冷凍的方法為:
[0018]將包埋劑冷凍至邊緣凝固而中心區(qū)域仍呈液態(tài)，再將水稻花藥置于中心區(qū)域內(nèi)， 再另加液態(tài)的包埋劑將水稻花藥充分包埋，然后迅速冷凍至包埋劑完全凝固。[〇〇19]水稻花藥中水分含量高，極不耐寒，其中大量的水分使得水稻花藥在低溫冷凍過(guò)程中容易形成冰晶，損傷水稻花藥細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，難以保持組織的完整性。上述的包埋冷凍方法中，先行部分冷凍的包埋劑隔開(kāi)了水稻花藥組織和液氮的直接接觸，能防止組織凍裂，最大程度的減少包埋過(guò)程中氣泡的產(chǎn)生，再次速凍的過(guò)程中能維持細(xì)胞內(nèi)各種酶的活性，使水分結(jié)晶過(guò)程非常迅速，細(xì)胞內(nèi)外的介質(zhì)變得更加粘稠，從而不能形成較大的冰晶， 能使樣品保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保持組織的完整性。
[0020]作為優(yōu)選，對(duì)水稻花藥在中心區(qū)域內(nèi)的放置角度進(jìn)行標(biāo)記。
[0021]水稻花藥體積較小，若采用普通的包埋冷凍方法，在切片時(shí)需要尋找切片角度，而采用上述包埋冷凍方法時(shí)，對(duì)水稻花藥的放置角度做下標(biāo)記，切片時(shí)就省去了尋找切片角度的步驟，可以保證切片的完整性并使制片過(guò)程簡(jiǎn)單便捷。
[0022]作為優(yōu)選，所述的包埋劑為0CT包埋劑。
[0023]包埋劑完全凝固后，在冰凍切片機(jī)的恒冷箱內(nèi)進(jìn)行切片。[0〇24]作為優(yōu)選，步驟(1)中，切片的厚度為8?15ym。
[0025]切片厚度過(guò)薄容易損傷花藥結(jié)構(gòu)，很難得到完整切片;若切片太厚，如60wii時(shí)，則會(huì)造成花藥內(nèi)組織結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞高度重疊，無(wú)法觀察并并區(qū)分水稻花藥內(nèi)部各組織結(jié)構(gòu)，影響對(duì)鈣離子分布的觀察。
[0026]作為優(yōu)選，步驟(1)中，載玻片的溫度為室溫。
[0027]在恒冷箱內(nèi)切出的切片與室溫的載玻片之間存在溫差，當(dāng)二者貼于一起時(shí)，彼此分子間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生吸附力，使切片與載玻片牢固的貼附于一起，因此，切片與載玻片之間可以不再使用粘貼劑。[〇〇28]作為優(yōu)選，步驟(2)中，F(xiàn)1UO-3AM熒光探針?lè)跤旱呐渲品椒?用二甲基亞砜將 Flu〇-3AM熒光探針配制成儲(chǔ)存液，再用緩沖溶液將儲(chǔ)存液稀釋至10?30yM，配置成Fluo-3AM熒光探針?lè)跤骸?br>[0029]所述的緩沖溶液為無(wú)酚紅的D-Hank ’ s溶液。[〇〇30]作為優(yōu)選，步驟(2)包括:[0031 ](a)將粘貼有切片的載玻片用緩沖溶液浸洗；
[0032](b)用吸水紙從載玻片的一端吸去多余的緩沖溶液，在切片所在的位置滴加Fluo-3AM熒光探針?lè)跤?，?0?35°C培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1?20min;[〇〇33](c)取出載玻片，用吸水紙從載玻片一端吸去多余的Flu〇-3AM熒光探針?lè)跤汉?，在緩沖溶液內(nèi)浸洗，用吸水紙吸去緩沖溶液后，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片。[〇〇34]熒光探針?lè)跤郎囟取r(shí)間及濃度都會(huì)影響Flu〇-3AM熒光探針的裝載效果:水稻花藥細(xì)胞壁中存在著非特異性酯酶，會(huì)迅速將Flu〇-3AM剪切形成Fluo-3，滯留在細(xì)胞壁，若熒光探針濃度過(guò)低，則Flu〇-3AM不能完全裝載各細(xì)胞;若熒光探針濃度過(guò)高，會(huì)發(fā)生非輻射躍迀，降低發(fā)光效率，導(dǎo)致熒光猝滅;若孵育溫度低，酯酶活性較低，孵育時(shí)間變長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致不同程度的熒光猝滅;若孵育溫度高，可以縮短時(shí)間，但是由于高溫會(huì)加劇晶格振動(dòng)，增強(qiáng)發(fā)光中心的晶格弛豫，使得無(wú)輻射躍迀幾率增大，也會(huì)造成發(fā)光中心或周?chē)奈h(huán)境發(fā)生某種本質(zhì)性變化，從而降低發(fā)光效率。[〇〇35] 作為優(yōu)選，孵育溫度為25?30°C，孵育時(shí)間為3?10min，F(xiàn)lu〇-3AM熒光探針?lè)跤旱臐舛葹?0yM。[〇〇36]在此條件下，F(xiàn)lu〇-3AM熒光探針的裝載效果良好，并且水稻花藥組織中Flu〇-3AM 熒光探針的發(fā)光效率較高。
[0037]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0038](1)與石蠟切片或半薄切片焦銻酸鉀沉淀法測(cè)定植物組織中鈣離子分布的方法相比，本發(fā)明的方法快速簡(jiǎn)便，在2?3小時(shí)內(nèi)即可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，有效縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，可被進(jìn)一步應(yīng)用于其他植物組織中游離鈣離子的分布，對(duì)于觀察水稻花藥發(fā)育階段、基礎(chǔ)研究切片等需要大批量檢測(cè)和研究工作特別適用；
[0039](2)本發(fā)明中的包埋冷凍方法具有以下優(yōu)點(diǎn)，首先，先行部分冷凍的包埋劑隔開(kāi)了植物組織和液氮的直接接觸，能防止組織凍裂，最大程度的減少包埋過(guò)程中氣泡的產(chǎn)生，再次速凍的過(guò)程中能維持細(xì)胞內(nèi)各種酶的活性，使水分結(jié)晶過(guò)程非常迅速，細(xì)胞內(nèi)外的介質(zhì)變得更加粘稠，從而不能形成較大的冰晶，能使樣品保持良好的形態(tài)結(jié)構(gòu)，保持組織的完整性;再次，采用本發(fā)明的包埋冷凍方法時(shí)可用調(diào)整植物組織的放置角度并做下標(biāo)記，切片時(shí)就省去了尋找切片角度的步驟，可以保證切片的完整性并使制片過(guò)程簡(jiǎn)單便捷。本發(fā)明中的包埋冷凍方法適用于其他植物組織，包括不規(guī)則組織?！靖綀D說(shuō)明】
[0040]圖1為可見(jiàn)光模式下實(shí)施例1中水稻花藥的冰凍切片；
[0041]圖2為實(shí)施例1中水稻花藥冰凍切片游離鈣離子的分布圖；
[0042]圖3為可見(jiàn)光模式下對(duì)比例1中水稻花藥的冰凍切片；
[0043]圖4為對(duì)比例1水稻花藥冰凍切片游離鈣離子的分布圖；
[0044]圖5為可見(jiàn)光模式下對(duì)比例2中水稻花藥的冰凍切片；
[0045]圖6為對(duì)比例2水稻花藥冰凍切片游離鈣離子的分布圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0046]以下實(shí)施例以小孢子時(shí)期的水稻花藥作為材料，采用OCT包埋劑包埋制作冰凍切片，F(xiàn)1UO-3AM染色，獲得了水稻花藥游離鈣離子的分布圖像。實(shí)驗(yàn)過(guò)程如下:[〇〇47] 實(shí)施例1
[0048]1 ?準(zhǔn)備工作:[〇〇49]1)制備無(wú)蓋的正方體錫紙盒:[〇〇5〇] 先將錫箱紙裁剪成30mm X 30mm的正方形，利用10mmX 10mmX 45mm的比色皿，制備邊長(zhǎng)為10mm的無(wú)蓋錫紙盒，要求各個(gè)面平整，用于裝0CT包埋劑。在錫紙盒的一面用馬克筆做標(biāo)記，用于辨別花藥組織的方向或?qū)M織樣品進(jìn)行標(biāo)號(hào)。[0051 ] 2)Flu〇-3AM孵育液的制備:[〇〇52] 用二甲基亞砜(DMS0)將Flu〇-3AM配制成ImM的儲(chǔ)存液，-20°C儲(chǔ)存。使用時(shí)，用D-Hank ’ s (無(wú)酚紅)溶液將儲(chǔ)存液稀釋至20yM，-4 °C待用。[〇〇53]2.花藥取材及包埋:
[0054]1)錫箱紙盒內(nèi)加入約1/3體積的冷凍包埋劑0CT，置于-20 °C的冷凍切片機(jī)恒冷箱內(nèi)。
[0055]2)立即取一新鮮完整的水稻的小花，快速用鑷子撥開(kāi)小花的外稃和內(nèi)稃，用鑷子捏住花絲取下花藥。于此同時(shí)，錫箱紙盒內(nèi)的冷凍包埋劑邊緣凝固變白，中心區(qū)域仍呈現(xiàn)液態(tài)，迅速將花藥橫置于尚未凝固住的包埋劑內(nèi)，將花絲朝向做標(biāo)記的一面，盡量避免氣泡。
[0056]3)使用0CT包埋劑將花藥充分包埋，填滿(mǎn)錫箱紙盒。
[0057]4)用鑷子夾住錫箱紙盒的一個(gè)面，迅速將其轉(zhuǎn)移至液氮液面上方0.5cm處，切勿浸入液氮，冷凍至包埋劑變白取出，放入-20 °C的冷凍切片機(jī)恒冷箱。
[0058]3 ?切片:
[0059]1)采用Thermo Scientific Shandon Cryotome FE冰凍切片機(jī)，恒冷箱內(nèi)保持溫度-20 °C左右。
[0060]2)在樣品托上添一層0CT包埋劑，去掉錫箱紙盒，將做標(biāo)記的一面置于樣品托上， 使0CT包埋劑填滿(mǎn)組織和樣品托之間的縫隙，待固定完成，3-5min后即可進(jìn)行切片。
[0061]3)片厚lOwii，切到目標(biāo)位置后將切片貼于室溫存放的載玻片。因?yàn)槭覝卮娣诺妮d玻片與冷凍箱中的切片有溫差，當(dāng)它們碰撞在一起時(shí)，分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力，使切片與載玻片牢固地附貼在一起。因此，載玻片可以不再使用粘貼劑。
[0062]4.裝載熒光探針Flu〇-3AM:[〇〇63]1)準(zhǔn)備三個(gè)盛滿(mǎn)D-Hank’ s(無(wú)酚紅)溶液的燒杯，將粘有切片的載玻片一端依次在三個(gè)燒杯中緩緩浸洗l〇s去除0CT包埋劑。此步驟的浸洗方法可以避免常規(guī)沖洗方法造成的切片脫片的現(xiàn)象。
[0064]2)用吸水紙?jiān)谳d玻片一端吸去多余的D-Hank’s(無(wú)酚紅)溶液，在切片所在位置滴加3-5滴Flu〇-3AM孵育液，轉(zhuǎn)移到28°C培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育10min。
[0065]3)取出載玻片，用吸水紙吸去孵育液，用D-Hank ’ s (無(wú)酚紅)溶液浸洗3次，每次5s。 再次用吸水紙吸干用D-Hank’s(無(wú)酚紅)溶液。在切片上滴加幾滴抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片。置于焚光顯微鏡下觀察。
[0066] 5 ?熒光顯微鏡觀察:[〇〇67]1)采用連接電腦的Nikon ECLIPSE Ni熒光顯微鏡對(duì)切片進(jìn)行觀察，關(guān)閉房間內(nèi)的電燈，打開(kāi)電腦，開(kāi)啟顯微鏡萊燈。
[0068] 2)將載玻片放在熒光顯微鏡的載物臺(tái)上，用壓片夾壓住，迅速地選取視野內(nèi)一個(gè)完整的花藥，微調(diào)至圖像清晰，采集圖片，如圖1所示，其中圖中的標(biāo)尺等于100M1。
[0069] 3)為了比較清晰的觀察到鈣離子分布，選擇藍(lán)光激發(fā)濾板，采集圖片，如圖2所示， 其中圖中標(biāo)尺等于100M1。
[0070]對(duì)比例1
[0071]與實(shí)施例1相比，不同之處在于花藥用0CT包埋劑包埋冷凍。用熒光顯微鏡觀察，采集圖片，如圖3、圖4所不。
[0072]采用直接包埋法制作冰凍切片，由于包埋劑凝固過(guò)程緩慢，形成冰晶損傷，造成切片破損，結(jié)構(gòu)不完整，如圖3箭頭所示。
[0073]對(duì)比例2[〇〇74]與實(shí)施例1相比，不同之處在于切片時(shí)切片厚度為60M1，用熒光顯微鏡觀察，采集圖片，如圖5、圖6所不。
[0075]切片過(guò)厚時(shí)，造成花藥內(nèi)組織結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞高度重疊，無(wú)法觀察并區(qū)分水稻花藥內(nèi)部各組織結(jié)構(gòu)，影響對(duì)鈣離子分布的觀察。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，其特征在于，包括:(1)將水稻花藥包埋冷凍、切片，將含有水稻花藥組織的切片貼于載玻片上；(2)在切片上滴加Flu〇-3AM熒光探針?lè)跤?，??37°C培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1?120min 后，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片；(3)用熒光顯微鏡觀察裝載有Flu〇-3AM熒光探針的切片。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，其特征 在于，步驟(1)中，水稻花藥包埋冷凍的方法為:將包埋劑冷凍至邊緣凝固而中心區(qū)域仍呈 液態(tài)，再將水稻花藥置于中心區(qū)域內(nèi)，再另加液態(tài)的包埋劑將水稻花藥充分包埋，然后迅速 冷凍至包埋劑完全凝固。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，其特征 在于，對(duì)水稻花藥在中心區(qū)域內(nèi)的放置角度進(jìn)行標(biāo)記。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，其特征 在于，步驟(1)中，切片的厚度為8?15ym。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，其特征 在于，步驟(1)中，載玻片的溫度為室溫。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，其特征 在于，步驟(2)中，F(xiàn)lu〇-3AM熒光探針?lè)跤旱呐渲品椒?用二甲基亞砜將Flu〇-3AM熒光 探針配制成儲(chǔ)存液，再用緩沖溶液將儲(chǔ)存液稀釋至10?30yM，配置成Flu〇-3AM熒光探針?lè)跤骸?.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，其特征 在于，步驟(2)包括:(a)將粘貼有切片的載玻片用緩沖溶液浸洗；(b)用吸水紙從載玻片的一端吸去多余的緩沖溶液，在切片所在的位置滴加Flu〇-3AM 熒光探針?lè)跤?，?0?35°C培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1?20min;(c)取出載玻片，用吸水紙從載玻片一端吸去多余的Flu〇-3AM熒光探針?lè)跤汉?，在?沖溶液內(nèi)浸洗，用吸水紙吸去緩沖溶液后，滴加抗熒光猝滅封片液，蓋上蓋玻片。8.根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的快速檢測(cè)水稻花藥游離鈣離子分布的熒光標(biāo)記方法，其特 征在于，孵育溫度為25?30°C，孵育時(shí)間為3?10min，F(xiàn)lu〇-3AM熒光探針?lè)跤旱臐舛葹?0 yM〇
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106092682SQ201610395026
【公開(kāi)日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日 公開(kāi)號(hào)201610395026.X, CN 106092682 A, CN 106092682A, CN 201610395026, CN-A-106092682, CN106092682 A, CN106092682A, CN201610395026, CN201610395026.X
【發(fā)明人】趙倩, 程方民, 劉建超, 潘剛
【申請(qǐng)人】浙江大學(xué)