一種檢測免疫t細胞和b細胞中常見氨基酸的方法
【專利摘要】一種檢測免疫T細胞和B細胞中常見氨基酸的方法，其屬于生物化學分析檢測領域。該方法采用各取細胞樣品至EP管中，加入內(nèi)標溶液后，進行脫蛋白處理，得到含有氨基酸的上清液Ⅰ。將上清液Ⅰ按照Waters AccQ?Tag方法衍生化反應，得到衍生化產(chǎn)物Ⅱ，再利用LC/ESI?Q?TOF?MS對衍生化產(chǎn)物Ⅱ進行分析和采集。該方法采用LC/ESI?Q?TOF?MS對免疫細胞內(nèi)常見氨基酸進行檢測，操作簡便、靈敏度和專屬性高、結果準確，彌補了該領域的空白。
【專利說明】
一種檢測免疫T細胞和B細胞中常見氨基酸的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學分析檢測領域，涉及一種檢測免疫T細胞和B細胞中常見氨基 酸的方法。
【背景技術】
[0002] 氨基酸是一類含有氨基和羧基的有機化合物，是構成機體組織細胞的基本組成成 分，也是構成蛋白質(zhì)的基本單位。人體缺乏氨基酸，將會導致生理功能異常，影響機體代謝 的正常進行，導致疾病。因此，檢測復雜樣本中氨基酸的含量對臨床和科研等都具有重要意 義，但目前的檢測方法的應用領域主要集中在血漿樣本，且檢測氨基酸數(shù)量相對較少。如專 利201410105963.8,公布了一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，采用高效液 相色譜法檢測人體血漿中可能出現(xiàn)的24種氨基酸;專利201510945747.9，公布了一種高通 量檢測人體血漿中多種氨基酸的質(zhì)譜方法，采用96孔板的樣品前處理方法，對17種氨基酸 進行定性定量分析。
[0003] T細胞和B細胞由淋巴器官產(chǎn)生，是機體免疫應答功能的重要細胞成分。T細胞來源 于骨髓，外周血中占總淋巴細胞的60-80%，介導細胞免疫。B細胞由哺乳動物骨髓或鳥類法 氏囊中淋巴樣前體細胞分化成熟而來，外周血中占總淋巴細胞的10-15%，介導體液免疫。氨 基酸是細胞正常代謝的重要物質(zhì)基礎，T細胞和B細胞內(nèi)的氨基酸直接與其生長、發(fā)育、凋亡 及能量代謝有關，對細胞內(nèi)氨基酸的檢測分析可間接反應T細胞和B細胞數(shù)量，提示機體的 免疫狀態(tài)。 同時，氨基酸是構成機體免疫系統(tǒng)的基本物質(zhì)，與免疫反應的組織發(fā)生和免疫系統(tǒng)的 器官發(fā)育密切相關。某些氨基酸在調(diào)控免疫反應中起著關鍵性作用。如精氨酸(Arg)[1]可通 過影響N0合成或直接刺激免疫細胞增殖來調(diào)控正常的免疫功能，在肝移植中，再灌注后lh 循環(huán)中精氨酸水平下降10倍，補充L_精氨酸可通過產(chǎn)生NO明顯減輕保存性損傷，而阻斷L-精氨酸/N0途徑明顯增加移植肝的細胞死亡和凋亡。甘氨酸(Gly) [2]具有免疫抑制效應，Gly 可下調(diào)庫普弗細胞(KC)吞噬活性，減輕微血管損傷，Gly預處理可明顯保護移植肝的細胞活 力、防止細胞死亡和肝衰竭，從而增加肝移植的存活率。色氨酸(Trp) [3]是T細胞增殖所必需 的氨基酸，在免疫應答中起重要作用。Trp的下游代謝產(chǎn)物喹啉酸對煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 的合成是必需的，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸可提供細胞核修復酶的底物、增強細胞活力。因 此，對免疫T細胞和B細胞中的氨基酸進行檢測分析，有助于評價機體的免疫狀態(tài)。
[0004] [1] Yagnik GP, Takahashi Y, Tsoulfas G, et al. Blockade of the L-arginine/N0 synthase pathway worsens hepatic apoptosis and liver transplant preservation injury. Hepatology, 2002，36: 573-581〇
[0005] [2] Rentsch M， Puellmann K， Sirek S， et al· Benefit of Kupffer cell modulation with glycine versus Kupffer cell depletion after liver transplantation in the rat: effects on postischemic reperfusion injury, apoptotic cell death graft regeneration and survival. Transpl Int, 2005，18: 1079-1089。
[0006] [3] Fallarino F, Grohmann U, Vacca C, et al. T cell apoptosis by tryptophan catabolism. Cell Death Differ, 2002, 9: 1069-1077〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供了一種檢測免疫T細胞和B細胞中常見氨基酸的方法，該方法采用乙腈 沉淀蛋白的方法，對T細胞和B細胞中的氨基酸進行富集，操作簡便、富集氨基酸種類豐富； 采用LC/ESI-Q-T0F-MS可檢測細胞中的28種氨基酸，專屬性高、結果準確、檢測時間短，彌補 目前免疫T細胞和B細胞中氨基酸檢測方法的空白。
[0008] 本發(fā)明所采用的技術方案是:一種檢測免疫T細胞和B細胞中常見氨基酸的方法， 檢測方法步驟為： A.免疫T細胞和B細胞中氨基酸樣品的制備:各取細胞樣品至1.5mL EP管中，加入內(nèi)標 溶液后，進行沉淀蛋白處理，得到含有氨基酸的上清液I。
[0009] B.樣品衍生化反應:將上清液I按照Waters AccQ·Tag方法衍生化反應，得到衍生 化產(chǎn)物Π 。
[0010] C.利用LC/ESI-Q-T0F-MS對衍生化產(chǎn)物Π 進行分析和采集。
[0011] 步驟中A中沉淀蛋白的具體操作為加入500yL乙腈，渦旋20s，15000g/min離心 3min〇
[0012]步驟中A中內(nèi)標溶液為ImM L-正纈氨酸(N-Val)溶液。
[0013] 步驟中C中液相分析條件為:柱溫:50°C，進樣室溫度：10°C，流速:0.4 mL/min，進 樣體積:5yL，流動相A:水(含20 mM/L甲酸銨、0.5%甲酸和1%乙腈），流動相B:乙腈(含1.6% 甲酸），梯度洗脫。所述梯度洗脫條件為O.Olmin時流動相A/流動相B的體積比為95/5,逐漸 改變梯度到15min變成流動相A/流動相B的體積比為60/40,進一步改變梯度到17min變成流 動相A/流動相B的體積比為0/100,到20min變?yōu)榱鲃酉郃/流動相B的體積比為50/50,到 20.5min變?yōu)榱鲃酉郃/流動相B的體積比為90/10，到25min變回初始比例流動相A/流動相B 的體積比為95/5。
[0014] 步驟中C中質(zhì)譜條件分析條件為:離子源為ESI，檢測器為四級桿串聯(lián)飛行時間檢 測器。
[0015] 所述氨基酸為L-賴氨酸（Lys)、L-纈氨酸（Val)、L-蘇氨酸（Thr)、L-天冬氨酸 (Asp)、L-甲硫氨酸(Met)、L-脯氨酸(Pro)、γ -氨基丁酸（γ -GABA)、L-異亮氨酸（11 e)、L-酪 氨酸(Tyr)、L-組氨酸(His)、?；撬?Tau)、L-精氨酸(Arg)、L-谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、 L-高胱氨酸(Horn)、L-苯丙氨酸(Phe)、肌氨酸(Sar)、L-色氨酸(Trp)、L-瓜氨酸(Cit)、L-亮 氨酸（leu)、L_丙氨酸(Ala)、L_胱氨酸(Cys-Cys)、L_半胱氨酸(Cys)、L_絲氨酸(Ser)-丙 氨酸(6 -Ala)、L_胱硫醚(Cys-s)、L_正繳氨酸(N-Val)、亞磺酸(H-Tau)。
[0016] 本發(fā)明的有益效果是:該方法采用各取細胞樣品至EP管中，加入內(nèi)標溶液后，進行 脫蛋白處理，得到含有氨基酸的上清液I。采用乙腈進行脫蛋白處理，富集得到的氨基酸種 類更豐富。將上清液I按照Waters AccQ，Tag方法衍生化反應，得到衍生化產(chǎn)物Π ，再利用 LC/ESI-Q-T0F-MS對衍生化產(chǎn)物Π 進行分析和采集。以濃度為0.4mM的含28種氨基酸的標準 溶液，按照本發(fā)明所述處理方法進行衍生化等處理并分別測定，連續(xù)進樣6次，得到該方法 的重復性好。并以濃度為0.4mM的含28種氨基酸的標準溶液，按照本發(fā)明所述處理方法進行 衍生化等處理并分別測定，連續(xù)進樣6次，連續(xù)三天進樣分析，計算保留時間和峰面積的RSD 值，得到該方法日間精密度高。該方法采用LC/ESI-Q-TOF-MS對免疫細胞內(nèi)常見氨基酸進行 檢測分析，操作簡便、靈敏度和專屬性高、結果準確，彌補了該領域的空白。
【附圖說明】
[0017] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。
[0018] 圖1是本發(fā)明實施例所述的含28種氨基酸標準品溶液的TIC色譜圖。
[0019]圖2是本發(fā)明實施例所述的含28種氨基酸標準品溶液的XIC色譜圖。
[0020] 圖3是本發(fā)明實施例所述的檢測T細胞內(nèi)氨基酸的XIC色譜圖。
[0021] 圖4是本發(fā)明實施例所述的檢測B細胞內(nèi)氨基酸的XIC色譜圖。
【具體實施方式】
[0022] T細胞和B細胞中常見氨基酸的具體檢測方法如下： 1.氨基酸樣本的制備:分別采用以下兩種方法對T細胞和B細胞進行蛋白沉淀和氨基酸 富集 方法1:取1X107個細胞樣品至1.5mL EP管中，依次加入10yL ImM N-Val溶液，500yL乙 臆，禍旋 20s，15000g/min 離心 3min; 方法2:取1\107個細胞樣品至1.5!111^?管中，依次加入1(^1^1111]\11^^1溶液，50(^1^甲 醇，禍旋 20s，15000g/min 離心 3min; 實驗結果顯示(如下圖），方法1富集得到的氨基酸種類豐富，故選擇方法1作為細胞樣 本氨基酸富集的處理方法。
2 .氨基酸的衍生化：取離心后的上清液10yL，按照Waters AccQ· Tag方法衍生，所用 Waters AccQ·Tag衍生劑試劑盒可購買得到，衍生結果如下表。
[0024] Waters AccQ·Tag衍生劑試劑盒對28種氨基酸衍生后的質(zhì)荷比變化結果表

3.標準溶液和內(nèi)標液的配置： 標準溶液配制:精確稱取28種氨基酸的標準品，并用0. lmol/L鹽酸溶液稀釋，配制濃度 為10 mM的標準儲備液，用水將儲備液稀釋，配制成含2 8種氨基酸的標準溶液，其濃度均為 0.4mM〇
[0025]內(nèi)標溶液配制：將L-正纈氨酸(N-Val)儲備液，用水稀釋配成ImM的N-Val內(nèi)標溶 液，然后將配制好的氨基酸標準品混合溶液和N-Val內(nèi)標溶液置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?[0026] 4.優(yōu)化質(zhì)譜條件：
5. 優(yōu)化液相條件：
色譜柱：Waters XBridge Peptide BEH C18, 3·5μηι，2.1X100mm 預柱：Phenomenex C18, 4 X 20mm 柱溫：50°C 進樣室溫度：10 °C 流速:〇.4mL/min 進樣體積:5yL 流動相：A:水(含20 mM甲酸銨、0.5%甲酸和1%乙腈） B:乙腈(含1.6%甲酸）
6. 方法的重復性 取濃度為〇. 4mM的含28種氨基酸的標準溶液，按照本發(fā)明所述處理方法進行衍生化等 處理并分別測定，連續(xù)進樣6次，計算保留時間和峰面積的RSD值，結果見下表。
[0027]氨基酸標準品混合溶液峰面積和保留時間重復性試驗結果

7.日間精密度 取濃度為〇. 4mM的含28種氨基酸的標準溶液，按照本發(fā)明所述處理方法進行衍生化等 處理并分別測定，連續(xù)進樣6次，連續(xù)三天進樣分析，計算保留時間和峰面積的RSD值，結果 見下表。
[0028]氨基酸標準品混合溶液峰面積和保留時間的日間精密度試驗結果
實施例1 T細胞中氨基酸的測定 根據(jù)前述的細胞前處理方法，取IX 1〇7個Τ細胞樣品進行蛋白沉淀和氨基酸富集，按照 優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件對Τ細胞中的氨基酸進行分析，計算保留時間和峰面積如下表所示， XIC色譜圖如附圖3。
[0029] 實施例2 B細胞中氨基酸的測定 根據(jù)前述的細胞前處理方法，取IX 1〇7個B細胞樣品進行蛋白沉淀和氨基酸富集，按照 優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件對B細胞中的氨基酸進行分析，計算保留時間和峰面積如下表所示， XIC色譜圖如附圖4。
【主權項】
1. 一種檢測免疫T細胞和B細胞中常見氨基酸的方法，其特征在于步驟如下： (1) 免疫T細胞和B細胞中氨基酸樣品的制備 取細胞樣品至EP管中，加入內(nèi)標溶液后，再加入乙腈、禍旋、離心進行沉淀蛋白處理，得 到含有氨基酸的上清液I;所述內(nèi)標溶液為ImM L-正纈氨酸溶液； (2) 樣品衍生化反應 將上清液I按照Waters AccQ'Tag方法衍生化反應，得到衍生化產(chǎn)物Π ; (3) 利用^：/^31-〇-1'0?-1^對衍生化產(chǎn)物11進行分析和采集 液相分析條件為:柱溫:50°C，進樣室溫度：10°C，流速:0.4mL/min，進樣體積:5yL，流動 相A:含20 mM/L甲酸銨、體積分數(shù)0.5%甲酸和體積分數(shù)1%乙腈的水，流動相B:含體積分數(shù) 1.6%甲酸的乙腈，梯度洗脫；質(zhì)譜條件分析條件為:離子源為ESI，檢測器為四級桿串聯(lián)飛行 時間檢測器。2. 根據(jù)權利要求1所述的一種檢測免疫T細胞和B細胞中常見氨基酸的方法，其特征在 于:所述氨基酸為L-賴氨酸、L-纈氨酸、L-蘇氨酸、L-天冬氨酸、L-甲硫氨酸、L-脯氨酸、γ-氨基丁酸、L-異亮氨酸、L-酪氨酸、L-組氨酸、?；撬帷-精氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-高胱 氨酸、L-苯丙氨酸、肌氨酸、L-色氨酸、L-瓜氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-半胱氨 酸、L-絲氨酸、β-丙氨酸、L-胱硫醚、L-正纈氨酸、亞磺酸中的一種或多種。3. 根據(jù)權利要求1所述的一種檢測免疫Τ細胞和Β細胞中常見氨基酸的方法，其特征在 于：所述梯度洗脫條件為O.Olmin時流動相Α/流動相Β的體積比為95/5,逐漸改變梯度到 15min變成流動相A/流動相B的體積比為60/40，進一步改變梯度到17min變成流動相A/流動 相B的體積比為0/100,到20min變?yōu)榱鲃酉郃/流動相B的體積比為50/50,到20.5min變?yōu)榱?動相A/流動相B的體積比為90/10,到25min變回初始比例流動相A/流動相B的體積比為95/ 5〇
【文檔編號】G01N30/02GK106093226SQ201610380843
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】曹云峰, 趙福榮, 房中則, 高鵬, 葛廣波, 孫曉宇, 洪沫, 董軍, 劉明莉
【申請人】遼寧潤生康泰生物醫(yī)藥科技有限公司