白術(shù)多糖在提高kuffer細(xì)胞免疫功能的藥物或保健品中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及“白術(shù)多糖在提高kuffer細(xì)胞免疫功能的藥物或保健品中的應(yīng)用”，屬于中藥【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明采用采用自制的白術(shù)多糖(PAM)測試對小鼠Kupffer細(xì)胞免疫功能的影響。PAM體外作用于正常Kupffer細(xì)胞，以吞噬中性紅A540、分泌NO和TNF-α的量以及LDH漏出量評價其免疫功能及細(xì)胞受損害情況。體內(nèi)小鼠注入PAM后，檢測Kupffer細(xì)胞的上述指標(biāo)及胞內(nèi)酸性磷酸酶(ACP)活性及血清ALT和GST。結(jié)果表明PAM增強Kupffer細(xì)胞對中性紅吞噬作用、增加ACP活性及NO和TNF-α的產(chǎn)生。PAM在體外不增加肝實質(zhì)細(xì)胞LDH漏出，對sALT和sGST的活性沒有影響。因此可知PAM可激活Kupffer細(xì)胞免疫功能，提高機體抗病能力，在免疫缺陷病和腫瘤等疾病的治療方面，具有實際應(yīng)用價值。
【專利說明】白術(shù)多糖在提高kuffer細(xì)胞免疫功能的藥物或保健品中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及中藥【技術(shù)領(lǐng)域】,特別是涉及一種中藥提取物白術(shù)多糖在提高kuffer細(xì)胞免疫功能的藥物或保健品中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]藥用植物中存在著廣泛的免疫活性多糖，它具有抑制腫瘤生長，激活免疫細(xì)胞，改善機體免疫功能等多種功能。白術(shù)為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrophala Koedz的干燥根莖，是著名的“浙八味”之一。白術(shù)為最常用的補益中藥，有“南術(shù)北參”美稱，具有健脾益氣、益胃，燥濕利水，和中、止汗，安胎之功效。白術(shù)多糖(PAM)系白術(shù)植物原料中提取的水溶性多糖，其主要成分為甘露聚糖和果聚糖，是白術(shù)發(fā)揮其免疫促進(jìn)作用的重要活性成分?！鞍仔g(shù)多糖免疫調(diào)控作用的研究進(jìn)展”(畜牧與獸醫(yī)，2010，42卷，98-100頁)概述了 PAM對體液免疫的調(diào)節(jié)作用，對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用，對細(xì)胞因子的調(diào)控，主要集中在PAM能明顯提高B、T淋巴細(xì)胞增殖。Kuffer細(xì)胞是體內(nèi)重要的免疫活性細(xì)胞，占機體組織巨噬細(xì)胞吞噬能力的90%且分泌多種細(xì)胞因為，并對肝實質(zhì)細(xì)胞的功能有一定的調(diào)節(jié)作用。PAM對Kuffer細(xì)胞功能影響如何，尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]針對上述領(lǐng)域的空白，本發(fā)明采用體外及體內(nèi)實驗方法，觀察PAM對正常大鼠Kuffer細(xì)胞功能的影響，表明PAM可激活KupfTer細(xì)胞免疫功能，提高機體抗病能力，在免疫缺陷病和腫瘤等疾病的治療方面，具有實際應(yīng)用價值。
[0004]同時本發(fā)明還提供該PAM的制備方法。
[0005]白術(shù)多糖在提高kuffer細(xì)胞免疫功能的藥物或保健品中的應(yīng)用。
[0006]所述藥物為治療免疫缺陷病或腫瘤的疾病的藥物。
[0007]所述白術(shù)多糖采用下列方法制得:采用水提取后得到的提取物用丙酮或/和乙醇多次沉淀后，冷凍干燥，再經(jīng)DEAE-纖維素柱進(jìn)行分離，水洗脫后，濃縮物用乙醇沉淀，干燥即得。
[0008]所述白術(shù)多糖的制備方法詳細(xì)步驟如下:(1)水回流提取三次，合并，濃縮；(2)濃縮液用乙醇、丙酮反復(fù)洗三次，沉淀冷凍干燥，即得白術(shù)粗多糖；(3)將白術(shù)粗多糖溶于少量蒸餾水中，DEAE-纖維素柱進(jìn)行分離，分別用蒸餾水、0.lmol/L NaCl溶液洗脫，收集蒸餾水洗脫液，(4)將洗脫液透析，透析液濃縮，加乙醇沉淀，放置過夜，過濾，干燥即得白術(shù)多糖(PAM)0
[0009]所述步驟(4)中還包括乙醇復(fù)沉淀步驟，過濾物加乙醇洗滌后用水溶解，過濾，濾液再加乙醇復(fù)沉淀，過濾，真空干燥即可。
[0010]所述白術(shù)多糖在水提 取前，采用95%乙醇回流脫脂。
[0011]本發(fā)明的白術(shù)多糖(PAM)為采用上述方法自制得到。實驗表明適宜濃度的PAM可提高正常KupfTer細(xì)胞吞噬功能，增加NO和TNF- α的釋放，提示PAM有激活正常Kupffer細(xì)胞免疫功能的作用。已知，中藥增強免疫和抗腫瘤活性作用，與其誘生TNF-α有密切關(guān)系；Ν0具有多種免疫活性，可抗病毒和細(xì)胞內(nèi)病原體感染，并能殺傷和抑制腫瘤生長?？梢?，適宜劑量的PAM無疑將有利于提高機體抗病能力，在免疫缺陷病和腫瘤等疾病的治療方面，具有實際應(yīng)用價值?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0012]圖1右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)對照品凝膠色譜圖，
[0013]其中從下向上分子量依次為DO:180,Dl:2500:D2:4600,D3:7100,D4:10000,D5:21400 ；
[0014]圖2PAM分子量測定凝膠色譜圖，
[0015]1.PAM 分子量為 4300 ；
[0016]圖3PAM水解產(chǎn)物液相色譜圖，
[0017]1.阿拉伯糖；2.甘露糖；3.葡萄糖；4.半乳糖。
【具體實施方式】
[0018]下面結(jié)合實驗例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
[0019]實施例1自制白術(shù)多糖(PAM)
[0020]DEAE-纖維素填料購自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司。
[0021]取白術(shù)藥材1000g左右，粉碎成粗顆粒，浸泡30min，用體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇加熱回流脫脂2h，濾渣用3倍量水反復(fù)提取三次，合并水提液，濃縮。濃縮液用乙醇、丙酮反復(fù)洗三次，沉淀冷凍干燥，即得白術(shù)粗多糖。取白術(shù)粗多糖溶于少量蒸餾水中，DEAE-纖維素柱進(jìn)行分離，分別用蒸餾水、0.lmol/L NaCl溶液洗脫，洗脫液用蒽酮-硫酸法在630nm波長處測定吸光度值，收集含多糖的蒸餾水部分洗脫液。將洗脫液透析，透析液濃縮后，加乙醇至濃度75% (V/V)，放置過夜，過濾，沉淀用適量75%乙醇洗滌后，用水溶解，過濾，濾液加入乙醇復(fù)沉淀后，減壓抽濾，真空干燥即得白術(shù)多糖(PAM)。
[0022]采用凝膠色譜法對多糖的分子量進(jìn)行測定，用標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖溶液作校正曲線方程，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線求的多糖分子量(見圖1)。結(jié)果顯示，白術(shù)多糖經(jīng)DEAE-纖維素柱分離純化后得到PAM為均一多糖，其分子量為4300Da (見圖2)。
[0023]供分子量測定用右旋糖酐分子量標(biāo)準(zhǔn)對照品(中國藥品生物制品檢定所提供，D0、D1、D2、D3、D4、D5 分子量依次為 180,2500,4600,7100,10000,21400)。
[0024]取PAM50mg于水解管中，加入5mmol/L的硫酸50mL，真空封管，置于烘箱中110°C反應(yīng)6h。反應(yīng)完成后冷卻至室溫，加入Ba(OH)2粉末中和pH值為7，過濾收集濾液。取阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖對照品適量，配置成對照品溶液。采用高效液相色譜法，氨基柱，示差折光檢測器進(jìn)行分析，結(jié)果顯示PAM的主要成分為阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖(見圖3)。
[0025]實施例2小鼠實驗
[0026]1.儀器與材料
[0027]實驗動物體重20~30g健康BALB/C小鼠，雌雄兼用，由西安交通大醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。在恒溫、光照周期12h: 12h環(huán)境中，飼養(yǎng)Iwk后用于實驗，實驗前24h禁食，任意飲水。
[0028]藥物及處理白術(shù)多糖(PAM，自制，純度大于99.9%)，從白術(shù)藥材(由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生藥教研室郭增軍教授鑒別為Atractylodes Macrocephala Koidz.)的干燥根提取，易溶于水，主要成分為阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。用前用蒸餾水溶解，經(jīng)高壓滅菌，離心后取上清液。
[0029]試劑放線菌素D、IV型膠原酶、噻唑藍(lán)(MTT)和脂多糖(LPS)均為Sigma產(chǎn)品；RPM1-1640培養(yǎng)基及新生牛血清為Gibco產(chǎn)品；腫瘤壞死因子a (TNF-α )、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶(ALT)、血清谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、一氧化氮(NO)、乳酸脫氫酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。
[0030]儀器日本島津UV-2550紫外可見分光光度計；DG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀。
[0031]2.方法
[0032]2.1體外Kupffer細(xì)胞誘導(dǎo)
[0033]選用正常的BALB/C小鼠，戊巴比妥鈉皮下注射麻醉BALB/C鼠，無菌取肝，D-Hank’s緩沖液沖洗去血，除去膽囊及非肝組織，置消毒的小玻璃瓶中用眼科剪刀剪碎，肝組織塊剪成Imm3大小。每克肝組織加IOmL0.05%鏈霉蛋白酶E溶液，輕輕吹打消化lOmin。200目不銹鋼篩網(wǎng)濾過，IOOXg離心IOmin,棄上清，D-Hank’ s緩沖液清洗2遍,30%~70%Percoll分離液梯度離心15min( 1000X g)，取中間層，RPM1-1640液清洗2遍，10%FCS培養(yǎng)于玻璃培養(yǎng)瓶，4h后，用RPM1-1640輕輕沖洗3次去除非貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為分離純化的Kupffer細(xì)胞。采用臺盤蘭染色法測定小鼠肝內(nèi)Kupffer細(xì)胞的存活率大于95%，結(jié)果表明，其細(xì)胞存活率滿足要求。過氧化物酶染色鑒別，KupfTer細(xì)胞純度大于90%。培養(yǎng)20h，待Kupffer細(xì)胞貼壁后，去除上清液，以含10%新生牛血清RPM1-1640培養(yǎng)基(10%NBS-1640液)，將PAM倍比稀釋成系列質(zhì)量濃度(800，400，200，100,50和25mg -L-1)作用于Kupffer細(xì)胞。10%NBS-1640液為陰性對照，以終質(zhì)量濃度為40mg.L-1的脂多糖(LPS)為陽性對照，每組設(shè)4復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h后，測定吞噬功能；分別收集上清液，-80°C保存，待測NO，TNF- α 和 LDH。
[0034]2.2體外PAM對肝實質(zhì)細(xì)胞的作用
[0035]選用正常的BALB/C小鼠，用水合氯醛(3.5%，lmL/100g, ip)麻醉后固定體位、消毒胸腹部皮膚，打開腹膜，游離門靜脈和下腔靜脈后，距肝門約Icm處插入22號導(dǎo)管行門靜脈插管，下腔靜脈插入固定另一導(dǎo)管備用。37 °C預(yù)溫D-HanksjfW 25mL/min流速灌注，數(shù)分鐘后可見肝臟膨大，顏色均勻蒼白。剪開下腔靜脈放出積血積液，門靜脈換用含0.025%IV型膠原酶的Hanks液迅速灌約lOmin。待肝臟韌性消失，壓迫下陷不易恢復(fù)時切斷肝周韌帶，剪下肝臟，置于4°C預(yù)冷的PBS中；劃開肝被膜，用玻璃分針輕輕梳理肝臟，以促使細(xì)胞分散。收集細(xì)胞懸液置于400目尼龍網(wǎng)上過濾，濾液即為肝臟細(xì)胞懸液.用4°C的PBS洗滌肝臟細(xì)胞3次，將細(xì)胞懸液鋪于60% Percoll液面上，4°C，200g離心15min，收集沉淀，即得到分離純化的肝細(xì)胞，加入含10%胎牛血清(10%FCS)的RPM1-1640培養(yǎng)液。置37°C、5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每24小時更換培養(yǎng)基。采用0.25%胰酶消化3~5min后進(jìn)行細(xì)胞傳代。采用臺盤蘭染色法測定小鼠肝細(xì)胞的存活率為96 土 3%，結(jié)果表明，其細(xì)胞存活率滿足體外培養(yǎng)的要求。以“膠原蛋白凝膠三明治”培養(yǎng)小鼠肝實質(zhì)細(xì)胞，加入PAM，終質(zhì)量濃度800，400，200，100，50和25mg.?Λ每濃度設(shè)4復(fù)孔，10%NBS_1640液為空白對照。培養(yǎng)24h后，收集上清液，待測LDH。
[0036]2.3體內(nèi)Kupffer細(xì)胞誘導(dǎo)
[0037]小鼠隨機分5 組，每組 5 只，PAMl，PAM2，PAM3 和 PAM4 組分別 ig ΡΑΜ0.05,0.1,0.5和1.0g^kg—1，連續(xù)給藥7天，生理鹽水為對照。最后一次給藥后lh，麻醉小鼠，摘眼球法取血，制備血清，待測sALT和sGST。同時分離Kupffer細(xì)胞(方法同上)，培養(yǎng)24h后，測定吞噬功能；收集上清液，_80°C保存，待測NO，TNF- α和LDH ;收集培養(yǎng)24h貼壁細(xì)胞，調(diào)整至同一細(xì)胞濃度，超聲破碎，待測ACP。
[0038]2.4吞噬功能
[0039]將Kupffer細(xì)胞懸液以1.25 X IO5個加入96孔培養(yǎng)板，得到單層細(xì)胞，棄上清液，加入0.072%中性紅0.1mL/孔，培養(yǎng)30min，棄中性紅，并用PBS洗去未被吞噬的中性紅，最后加入細(xì)胞裂解液0.1mol.171冰醋酸-無水乙醇(I: I)，靜置過夜，于酶標(biāo)儀上測A54。處的吸收值。
[0040]2.5TNF- α，NO, LDH, ACP, sALT 和 sGST 的測定
[0041]參照試劑盒進(jìn)行測定。
[0042]2.6統(tǒng)計學(xué)處理
[0043]數(shù)據(jù)均以MeaniSD表示，兩組之間均數(shù)比較采用t檢驗。
[0044]3.結(jié)果
[0045]3.1PAM對Kupffer細(xì)胞及肝實質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH含量影響
[0046]LDH漏出量反映藥物對培養(yǎng)細(xì)胞的損害情況。如表1所示，體外給予PAM，各劑量組LDH漏出量無明顯升高，表明PAM體外給藥對Kupffer細(xì)胞及肝實質(zhì)細(xì)胞沒有直接損害作用。
[0047]表1PAM對Kupffer細(xì)胞及肝實質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH含量影響(n=4，Mean土 SD)
【權(quán)利要求】
1.白術(shù)多糖在提高kuffer細(xì)胞免疫功能的藥物或保健品中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述藥物為治療免疫缺陷病或腫瘤的疾病的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，所述白術(shù)多糖采用下列方法制得:采用水提取后得到的提取物用丙酮或/和乙醇多次沉淀后，冷凍干燥，再經(jīng)DEAE-纖維素柱進(jìn)行分離，水洗脫后，濃縮物用乙醇沉淀，干燥即得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，所述白術(shù)多糖的制備方法詳細(xì)步驟如下:(1)水回流提取三次，合并，濃縮；(2)濃縮液用乙醇、丙酮反復(fù)洗三次，沉淀冷凍干燥，即得白術(shù)粗多糖；(3)將白術(shù)粗多糖溶于少量蒸餾水中，DEAE-纖維素柱進(jìn)行分離，分別用蒸餾水、0.1mol/LNaCl溶液洗脫，收集蒸餾水洗脫液，(4)將洗脫液透析，透析液濃縮，加乙醇沉淀，放置過夜，過濾，干燥即得白術(shù)多糖(PAM)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，所述步驟(4)中還包括乙醇復(fù)沉淀步驟，過濾物加乙醇洗滌后用水溶解，過濾，濾液再加乙醇復(fù)沉淀，過濾，真空干燥即可。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用`，所述白術(shù)多糖在水提取前，采用95%乙醇回流脫脂。
【文檔編號】A61K31/715GK103550243SQ201310558127
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】王嫦鶴, 耿慶光, 王發(fā), 唐娜, 王蓀璇, 馮潤東 申請人:陜西省食品藥品檢驗所