專利名稱：超靈敏傳感器和分析物的快速檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于實時，快速的檢測、鑒定和計數(shù)廣泛種類的分析物的 系統(tǒng)和方法，所述分析物包括，但不限于，細胞(真核，真細菌，古細菌)， 微生物，細胞器，病毒，蛋白質(zhì)(重組或天然蛋白質(zhì))，核酸，朊病毒，和任何 化學(xué)品，代謝物或生物標記物。所述系統(tǒng)和方法，包括激光/光學(xué)/電子裝 置，分析軟件，測定方法和試劑以及高容量的自動控制，特別適合于對在 被污染的食物，臨床樣品和環(huán)境樣品中的病原體和非病原體進行檢測、鑒 定和計數(shù)?？梢杂帽景l(fā)明檢測的其它微生物包括臨床病原體，原生動物和 病毒。
背景技術(shù)：
目前，可獲得一些快速檢測方法來用于檢測分析物諸如細胞(真核，真 細菌，古細菌)，微生物，細胞器，病毒，蛋白質(zhì)(重組或天然蛋白質(zhì))，核酸, 朊病毒,和任何化學(xué)品，代謝物或生物標記物。這些方法的實例包括基于核
酸的測定方法(雜交和聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)) (1, 2， 17， 32)，生化測定法(16, 24)，免疫測定法(4，9)，物理化學(xué)檢測方法(42)，電子檢測方法(35)，顯微鏡 檢測方法(38)，基于噬菌體的測定法(14， 20),基于選擇性培養(yǎng)基和培養(yǎng)的 檢測方法(11,25,31)，和基于光學(xué)的測定法(26)。所有這些目前可獲得的檢測方法由于其固有的局限而不符合理想的檢測系統(tǒng)的所有要求。
在基于PCR的測定法，包括實時PCR測定法和核酸雜交測定法中， 結(jié)合培養(yǎng)步驟來獲得高度敏感性是必要的(32)。如果培養(yǎng)步驟沒有包括在 內(nèi)，會檢測到死細胞，這導(dǎo)致不理想的后果。此外，這是一個復(fù)雜的多重 測定系統(tǒng)，其具有相對高昂的費用，需要訓(xùn)練有素的人員，并且具有比其 它快速方法更長的檢測時間。在樣品或富集培養(yǎng)基中的各種PCR抑制劑 的存在可能影響引物的結(jié)合和擴增并導(dǎo)致假陽性/陰性(36， 39)。因此，所 述基于PCR的測試可能不適合于食品，臨床或環(huán)境樣品(2， 36)。
基于抗體的測定法，諸如ELISA，凝集試驗和探針測試是其它廣泛使 用的方法。然而，因為一些測定法的低靈敏度(諸如探針測試和凝集試驗)， 這些方法通常需要相對較長的富集時間(9)。盡管ELISA的靈敏度相對較 高，其仍舊需要較長的測試時間，并包括費力的程序。此外，ELISA測定 法很昂貴，因為它們需要昂貴的儀器和高質(zhì)量的純化的抗原(4)。
另一種基于抗體的方法是免疫磁性分離(IMS)法，其可以縮短富集時 間并通過使用與磁性顆粒或珠偶聯(lián)的特異性抗體來選擇性地捕獲細菌(30, 33)。 IMS被用于捕獲和濃縮選擇性目標生物，蛋白質(zhì),或核酸(14， 15)。和 其它基于抗體的測定法一樣，IMS也需要富集過程并且受限于用于小體積 的樣品(5,7, 8，29)。 IMS本身是不理想的測定系統(tǒng)，需要進行改進并結(jié)合 到更靈敏得多和與使用者友好的系統(tǒng)中。實際上，IMS可以適合于與本發(fā) 明 一起使用來產(chǎn)生靈敏的檢測系統(tǒng)。
基于生化的測定法，諸如生物發(fā)光(ATP檢測)，與許多其它方法相比 相對較快。然而，有時這種方法需要較長的富集過程來獲得純培養(yǎng)物(12, 18, 28)。使用生物發(fā)光的ATP檢測方法因為病原體的非選擇性，低靈敏度和 固有的ATP干擾(27)而具有限制。因此，其在給定的環(huán)境樣品中，不會將 病原體從普遍的非致病性的微生物區(qū)系生物中區(qū)分出來(28，37)。
用于快速檢測生物顆粒的更新技術(shù)的其中之一是改進的流式細胞術(shù) (FC)。它是有利的研究工具，可以測量基于個體基礎(chǔ)上的細胞的特定性質(zhì) 并具有分選和計數(shù)細胞的能力，因為它們經(jīng)窄的護套孔單列穿過(10,13,22, 23, 41， 43)。用于檢測食物傳播的細菌的基于FC的系統(tǒng)以前由Advanced Analytical Technology, Inc (AATI) (Ames， Iowa)在市場上銷售，但是未取得成功。然而，當應(yīng)用于檢測基于食物的樣品中的細菌細胞時，F(xiàn)C會遇到 問題。例如，當在液體樣品的流動中和目標細菌一起存在來自食物顆粒的
碎片或大小大于0.25 mm的凝固的微生物區(qū)系時，護套和/或孔的開口會被 封閉。不是所有的細菌都是相同大小，因此固定的護套直徑將需要適應(yīng)不 同的細胞大小，而同時要容許細胞單列流過來進行精確的檢測和計數(shù)。這 樣的基于FC的系統(tǒng)也需要16-36小時的富集階段來獲得高靈敏度。與細 菌接觸的真空管、護套和其它的靜態(tài)部分需要在每次檢驗樣品后徹底的洗 滌和消毒，因此其不是用戶友好的。此外，因為這樣的儀器的校準是耗時 和復(fù)雜的過程，該系統(tǒng)可能不適合于不熟悉FC功能和分析的未經(jīng)訓(xùn)練的 人員。此外，太多復(fù)雜的部分可導(dǎo)致問題解答中的困難和頻繁的故障，尤 其是關(guān)于真空驅(qū)動系統(tǒng)。這種儀器也是相當昂貴的，并且機器本身大且笨 重。費用和空間需求將會使這種儀器僅適合于大的且充分建立的測試實驗 室或機構(gòu)。事實上，AATI已經(jīng)從食品檢驗市場撤回了其FC機器。
熒光相關(guān)光譜學(xué)(FCS)是另一種用于獲得生物分子的靈敏和精確檢測 的技術(shù)。FCS是測量非常小體積樣品中的熒光顆粒的波動的技術(shù)。所述波 動由熒光顆粒(或熒光標記顆粒)在檢測體積中分散而導(dǎo)致。限定的檢測 體積位于樣品中并且通過這樣的區(qū)域確定，在所述區(qū)域中激發(fā)激光通過高 孔徑顯微目標物聚焦。發(fā)射的熒光信號通過光子計數(shù)傳感器(例如，光電 倍增管(PMT)或電荷耦合器件(CCD))檢測，當顆粒在給定的時間階段中 通過檢測體積時，其收集關(guān)于熒光強度和顆粒數(shù)量的信息。開發(fā)于19世 紀70年代，F(xiàn)CS廣泛應(yīng)用在以低濃度存在的熒光發(fā)射顆粒的動態(tài)研究中 (40)。就在最近，在共焦顯微鏡裝置的輔助下，檢測微升范圍的樣品體積 的單一顆粒成為可能(6, 19)。這導(dǎo)致在生物相關(guān)系統(tǒng)中的一些應(yīng)用，其中 可以研究納米到微米大小分子的動力學(xué)，動態(tài)學(xué)和濃度。用于檢測微生物 和生物分子的多種FCS應(yīng)用結(jié)合核酸擴增方法和免疫學(xué)方法己經(jīng)成功在 受控制的樣品中得到證實。例如，已經(jīng)顯示結(jié)合在樣品的微米范圍體積的 細菌，病毒和蛋白質(zhì)團聚體中的特異性目標分子中的熒光染料的動態(tài)學(xué)(3， 21, 34)。
盡管FCS技術(shù)具有高靈敏度，關(guān)于作為未加工的食品，環(huán)境或臨床 樣品的檢測或診斷工具的FCS技術(shù)的應(yīng)用存在明顯的缺陷。盡管當在檢測
8體積中存在均一的顆粒時，獲得了最佳的靈敏度，事實上，在真正的天然 存在的測試樣品諸如食品，環(huán)境和臨床樣品中獲得均一性是困難的。例如， 食品勻漿物是包含鹽、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖、膠粒等的復(fù)雜和混濁的流體混 合物。這樣的樣品的不同種類的組成實質(zhì)上以許多不同的方式，諸如自身 熒光的干擾，當顆粒的復(fù)合物通過檢測體積時噪聲信號水平的增加，和來 自意欲的目標分子的發(fā)射的熒光信號的物理封閉而損害FCS的靈敏度。因
此，由于天然存在的樣品的不均一性，F(xiàn)CS技術(shù)并不十分適合于微生物和
納米范圍的生物分子的檢測。
FCS的另一種局限存在于可以測量的樣品的體積中。對這種系統(tǒng)進行 設(shè)計從而分析其中以微升(或更少)范圍包含幾種目標生物或分子的樣品。 然而，大多數(shù)生物和環(huán)境樣品包含大體積(毫升范圍)的少量目標分子。為 了符合FCS的體積要求，需要集中和耗時的步驟來濃縮目標分子到最初樣 品體積的千分之一。盡管通過測量更大樣品體積的多個小級分使用FCS 來檢測目標顆粒是可能的，對于可能僅以一個或兩個被分析的小級分存在 的稀少的目標顆粒而言，這種耗時的任務(wù)在統(tǒng)計學(xué)上將是不可靠的。當發(fā) 現(xiàn)以超過FCS的能力的更大體積存在的小量的目標微生物或分子時，這種 事實阻止FCS提供快速和實時的篩選或檢測。
FCS系統(tǒng)由緊密控制的和聚焦的激光束，復(fù)雜的共焦裝置和精確的激 光發(fā)射源組成，所有的它們需要被結(jié)合到足夠大的儀器中以適合于必需的 部分，還要對其進行設(shè)計以容許易于修理或更換零件，并且其足夠簡潔而 使終端使用者方便操作。這些儀器的開始的生產(chǎn)可以是非常昂貴的并且隨 后的必要的或需要的修理也可以是昂貴的。此外，數(shù)據(jù)分析通常必須由經(jīng) 專門訓(xùn)練的人員進行以確保精確地解釋結(jié)果。因為這些因素，與在本公開 內(nèi)容中所述的本發(fā)明相比，目前的FCS儀器不是那么通用和經(jīng)濟。目前可 以獲得兩種商業(yè)FCS儀器。其中之一是Carl Zeiss (德國)的ConfoCor2/LSM 510，另一種是ISS (Champaign, IL)的ALBA。
如上討論，存在于目前快速檢測分析物，特別是來自食品、環(huán)境和臨 床來源的生物分析物的方法中的主要缺陷包括對于富集過程的需要，低檢 測靈敏度，需要專門的經(jīng)過訓(xùn)練的人員，和對于多重或復(fù)雜的步驟的需要。 這些缺陷的任何一種都會導(dǎo)致不精確的測量或?qū)⒔Y(jié)果的得到從一天延遲到數(shù)天。在食物傳播的或環(huán)境病原體和/或它們的副產(chǎn)物的檢測和隨后的控 制上延遲可能會導(dǎo)致對于公眾的嚴重的醫(yī)療問題和對于食品和診斷工業(yè) 的經(jīng)濟損失。最近，恐怖分子的威脅和在我們國家食品基礎(chǔ)設(shè)施中的意外 的污染已經(jīng)導(dǎo)致了我們社會中的增加的安全問題。
存在對于發(fā)展更靈敏的診斷方法的明顯的需要，所述診斷方法可以用 于快速檢測和鑒定在食品以及環(huán)境和臨床樣品中的低濃度病原體的存在。 本發(fā)明傾向于克服在目前可獲得的分析物檢測技術(shù)中的缺陷。
將參考下面的附圖和伴隨的說明書來討論本發(fā)明這些和其它方面以 及性質(zhì)。
附圖簡述


圖1是本發(fā)明的示范性儀器的示意圖。圖1A是所述儀器的側(cè)視圖， 圖1B是所述儀器的俯視圖2A是中空的小杯設(shè)計的舉例說明；圖2B是薄的矩形小杯設(shè)計的 舉例說明；
圖3是用于分析本發(fā)明的數(shù)字化信號的軟件的算法的實例； 圖4是具有光源的本發(fā)明的另一個實施方案的示意圖，所述光源與小 杯和顯微鏡接物鏡一起排列。
圖5是被設(shè)計用于防止樣品混合物在側(cè)面和其它運動中的沉淀；
圖6是僅用一個動力裝置提供同時的垂直和旋轉(zhuǎn)運動的運動控制裝
置；
圖7是與薄的矩形小杯和光電倍增管(PMT)—起使用的光圖象處理系
統(tǒng)；
圖8是與薄的矩形小杯和俘獲-電荷耦合器件(CCD)—起使用的光圖象 處理系統(tǒng)；
圖9顯示在磷酸鹽緩沖液中的熒光信號計數(shù)對比熒光微球體數(shù)量的相 關(guān)性。每次測量用2分鐘。在不同的天數(shù)收集所有的數(shù)據(jù)。按照珠的數(shù)量 對熒光信號計數(shù)進行繪圖。圖例顯示實驗的日期和具有R平方值的趨勢 線；
圖10顯示在磷酸鹽緩沖液中通過使用與熒光染料綴合的多克隆抗體來檢測鼠傷寒沙門氏菌f5. (KpWmwn'"m)計數(shù)的結(jié)果。顯示熒光信號的平均 計數(shù)對比CFU/ml的繪圖。與對照相比，Ie4/ml的信號計數(shù)和更大的濃度 明顯更大(ANOVA, p<0.05)。在104細胞/ml到1(^細胞/ml的濃度范圍內(nèi) 觀察在信號計數(shù)和CFU/ml之間的高相關(guān)性(112=0.9685)。通過MPN(最大 或然數(shù))方法來確定CFUs。以log等級來表示數(shù)據(jù)。以不同的時間來進行 13組測試(11=13)。顯示平均值+- S.E.(標準差)；
圖11顯示在絞細牛肉中通過使用與熒光染料綴合的多克隆抗體來檢 測鼠傷寒沙門氏菌的結(jié)果。顯示平均信號計數(shù)對比CFU/ml的繪圖(log等 級)。與對照相比，Ie4/ml的計數(shù)和更大的濃度明顯不同。在104細胞/ml 到106細胞/1111的濃度范圍內(nèi)觀察在信號計數(shù)和CFU/ml之間的高相關(guān)性 (R2=0.9685)。通過MPN(最大或然數(shù))方法來確定CFUs。以不同的時間來 進行4組測試(11=4)。顯示平均值+- S.E.(標準差)；
圖12顯示通過使用熒光納米球體在磷酸鹽緩沖液中檢測鼠傷寒沙門 氏菌的結(jié)果。顯示低頻率信號的振幅對比CFU/ml的繪圖。通過PSD函數(shù) 來評估低頻度信號的振幅。通過MPN法來測定CFU/ml。與對照相比，104 細胞/ml樣品的低頻度信號的振幅顯著更高(ANOVA， p<0.01， t-檢驗, pO.Ol)。細胞的濃度以log等級表示。以不同的時間進行三組測試(n二3)。 顯示平均值+- S.E.(標準差)；
圖13顯示通過使用熒光珠在磷酸鹽緩沖液中檢測鼠傷寒沙門氏菌的 結(jié)果。顯示平均信號計數(shù)對比CFU/ml的繪圖。通過MPN法來確定CFUs。 以不同的時間進行10組測試(n-10)。顯示平均值十-S.E.(標準差)?？招娜?角是信號計數(shù)的方法。閉合的圈是加權(quán)計數(shù)的方法；
圖14A是在絞細牛肉中檢測鼠傷寒沙門氏菌的結(jié)果，圖14B是通過 使用熒光珠在萵苣中檢測鼠傷寒沙門氏菌的結(jié)果。顯示平均熒光計數(shù)對比 CFU/ml的繪圖。通過MPN方法來確定CFUs。以不同的時間進行每個樣 品的6組測試(11=6)。顯示平均值十-S.E.(標準差)；禾口
圖15是使用熒光染料在磷酸鹽緩沖液中檢測牛血清白蛋白(BSA)的 結(jié)果。對熒光擊打計數(shù)對比蛋白質(zhì)濃度/ml的繪圖進行計算。每次測量用2 分鐘(120秒)。發(fā)明詳述
盡管本發(fā)明容許許多不同形式的實施方案，在附圖中顯示和本文中詳 細描述的是其具體的實施方案，要理解的是本公開內(nèi)容將被視為本發(fā)明原 理的舉例說明而不意欲將本發(fā)明限制到舉例說明的具體的實施方案。
本發(fā)明涉及用于實時，快速的檢測、鑒定和計數(shù)廣泛種類的分析物的 系統(tǒng)和方法，所述分析物包括，但不限于，細胞(真核，真細菌，古細菌)， 微生物，細胞器，病毒，蛋白質(zhì)(重組或天然蛋白質(zhì))，核酸，朊病毒，和任何 化學(xué)品，代謝物或生物標記物。微生物可以是致病的或非致病的，并且可 以是食物傳播的。所述病原體也可以是臨床的病原體。食物傳播的病原體 的實例包括，但不限于沙門氏菌屬物種(^/附0^//" W.)，李斯特氏菌屬物
種(Z^ en'a w.)，彎曲桿菌屬物種(Ow^y/okzcfe w.)，葡萄球菌屬物種 (&a/ /^/ococcM w.)，弧菌屬物種(7/6n'o ^.)，耶爾森氏菌屬物禾中0"^'<3 W.)，梭菌屬物種(C7o^Wwm w.)，芽孢桿菌屬物種CBa"7/M w.)，脂肪酸 芽孢桿菌屬物種(J"cyc/o6ac/〃^ ^.)，乳桿菌屬物種(丄ac/o&"7/ws ^.)，氣 單胞菌屬物種G4eramo"o^; .)，志賀氏菌屬物禾中(幼/ge〃a ^.)，鏈球菌屬物 禾中(5^印tococcw w)，大腸桿菌(E co/z')，賈第蟲屬物種(G/ara^a平義內(nèi) 阿米巴屬物禾中(五"tomoeki^p.義隱孢子蟲屬物禾中(Co^^w; on'力'wm w.義 異尖屬物種"mk仏^.義二葉槽絳蟲屬物種(￡^/^/o6oAn'Mm w.義侏 形吸蟲屬物種(A^"op/^""H; .義真圓線蟲屬物種(五MWra"gy/WeH; J， 棘阿米巴屬物種(Jca" /2"moe6a w. A和蛔蟲屬物種(爿"an、 ^; .)和腸 細菌。病毒實例包括，但不限于Norovirus，輪狀病毒(Rotavirus),肝炎病 毒，皰疹病毒和HIV病毒，細小病毒和其它病毒病原體。蛋白質(zhì)可以是毒 素，諸如，但不限于黃曲霉毒素，腸毒素，魚肉中毒，有殼的水生動物毒 素，鯖亞目魚中毒，河豚毒，雙吡咯烷類生物堿，蘑菇毒素，植物凝集素 和木藜盧毒素類。
本發(fā)明的系統(tǒng)和方法特別適合于具有復(fù)雜組成的復(fù)合樣品，諸如但不 限于食品、臨床的和環(huán)境的樣品。這些樣品的多種和多樣化的組成可能干 擾許多已知檢測技術(shù)中的檢測。
本發(fā)明的基本的結(jié)構(gòu)和概念從兩種充分表征的系統(tǒng)，即熒光相關(guān)光譜 學(xué)(FCS)和流式細胞術(shù)(FC)中來源和改進。包括激光/光學(xué)/電子裝置，分析自動控制的系統(tǒng)和方法，特別適合于對被污 染的食品、臨床和環(huán)境樣品中的病原體和非病原體進行檢測，鑒定和計數(shù)。 可以用本發(fā)明檢測的其它微生物包括臨床的病原體，原生動物和病毒。
在本發(fā)明中，將液體樣品混懸液中的目標分析物(諸如上面列舉的細胞 和微生物)與適合的試劑混合以形成樣品混合物。試劑包含適當?shù)臒晒馀?體，其通過將所述配體與熒光顆粒，染料和熒光珠綴合而形成。所述配體 特異性地結(jié)合目標分析物。當暴露于具有適合激發(fā)波長的激發(fā)光時，熒光 配體發(fā)出熒光。如果所述樣品混懸液包含目標分析物，目標分析物與熒光 配體結(jié)合。與熒光配體結(jié)合的目標分析物通過激發(fā)體積(也稱作被照射的體 積，掃描體積或檢測體積)并產(chǎn)生可檢測的熒光信號。所述系統(tǒng)對熒光信號 的數(shù)量進行計數(shù)或測量對應(yīng)于分析物的數(shù)量的熒光信號的量?？梢允褂酶?種信號分析工具來測量熒光信號并使它們與分析物的量相關(guān)或鑒定目標 分析物的陽性或陰性存在。所述系統(tǒng)檢測，鑒定目標分析物，并作為在樣 品的激發(fā)體積中的熒光顆粒的數(shù)量或熒光的用數(shù)字表示的測量的函數(shù)對 目標分析物進行計數(shù)。
配體可以是任何類型的分子，其可以識別并結(jié)合互補的
(complimentary)目標分子。所述配體可以結(jié)合細胞的特異性成分或目標 蛋白質(zhì)的目標表位來形成分子復(fù)合物。在優(yōu)選的實施方案中，配體是多克 隆或單克隆抗體(或其混合物)，其特異性結(jié)合于抗原諸如細胞中的細胞成 分或在目標蛋白質(zhì)上的表位。細胞成分通常是大分子，其可以是蛋白質(zhì)， 糖，核酸(DNA或RNA)或糖蛋白。細胞成分優(yōu)選地是在細胞或微生物上 的表面分子。適合于本發(fā)明的表面細胞成分的實例是膜結(jié)合的蛋白質(zhì)。細 胞成分還可以是細胞內(nèi)分子。在另一個實施方案中，所述配體結(jié)合于細胞 或微生物中的特異性核酸序列。核酸可以是DNA或RNA。在該實施方案 中，所述配體可以是互補的核酸序列或另一種分子。
任選地，所述目標分析物在與熒光配體試劑混合前可以是分離的，捕 獲的和/或濃縮的。在優(yōu)選的實施方案中，該步驟可以用免疫磁性分離技術(shù) 獲得，其將在下面詳細討論。所述捕獲/分離/濃縮步驟可以與混合步驟同 時進行。
廣泛種類的樣品適合于本發(fā)明。這些樣品的實例包括，但不限于(a)
13潛在地包含污染病原體(例如，沙門氏菌屬物種，李斯特氏菌屬物種，致病 性大腸桿菌，彎曲桿菌屬物種，葡萄球菌屬物種，弧菌屬物種，脂肪族芽
孢桿菌屬物種，鉤端螺旋體物種(丄印to^/ra w)，內(nèi)阿米巴屬物種，Noro
病毒，腸原性病毒等和毒素蛋白質(zhì)(肉毒桿菌毒素，腸毒素，黃曲霉毒素等))
的食品；(b)潛在地包含致病性微生物和病毒或有害化學(xué)品(諸如除草劑，殺 蟲劑，工業(yè)污染物)的環(huán)境樣品(例如，來自河流，湖泊，池塘，下水道，水 庫等)；和(c)潛在地包含臨床病原體(包括，但不限于致病性細菌和病毒) 的和生物標記物蛋白質(zhì)的臨床樣品；和待測試的對于特異性細胞(例如，癌 細胞，巨噬細胞，紅血細胞，血小板，淋巴細胞，干細胞等)的臨床樣品。 臨床樣品包括，但不限于血液，血漿和其它體液諸如汗、唾液、腦液、脊 髓液，滑液，羊水等。
本發(fā)明還可以用于檢測具有最少擴增的特異性核酸序列。例如，可以 通過使用磁珠來檢測特異性目標序列，所述磁珠具有連接于所述珠表面的 核酸序列的互補序列。這些表面序列具有這樣的熒光染料，所述熒光染料 與所述序列相關(guān)聯(lián)，但是其熒光通過將所述序列成環(huán)的物理機制或通過其 它酶促方式而被猝滅。在結(jié)合于樣品中的目標序列后，這些序列將被暴露 并且熒光染料將被釋放進行熒光發(fā)射。檢測寡核苷酸序列的其它各種方法 可以與本發(fā)明合并來進行檢測和診斷。
儀器設(shè)計
本發(fā)明公開內(nèi)容描述了用于快速檢測廣泛種類的分析物的新的系統(tǒng) 和方法。所述方法可以由被具體地設(shè)計用于該系統(tǒng)和方法的儀器進行。所 述儀器的設(shè)計容許許多不同形式的實施方案，在附圖中顯示和本文中詳細 描述的是其具體的實施方案，要理解的是本公開內(nèi)容將被視為本發(fā)明原理 的舉例說明而不意欲將本發(fā)明限制到舉例說明的具體的實施方案。
本發(fā)明的示范性儀器，也被稱作病原體鑒定和檢測的實時分析 (R.A.RI.D.)系統(tǒng)，被顯示于圖1A和B。這種示范性系統(tǒng)IO包括激發(fā)光源 12來提供激發(fā)光14來激發(fā)被置于杯20中的樣品混合物17。杯固定器30 固定杯20。樣品混合物17包含可以或可以不包含目標分析物的樣品混懸 液，并且通過將待測試的液體樣品混懸液與以前所述的熒光配體混合而形成。任選地，所述目標分析物在與熒光配體混合前可以是分離的，捕獲的 和/或濃縮的。
在優(yōu)選的實施方案中，杯20是具有圓底的圓柱形杯。杯20可以由適 合于杯的任何已知透明材料制作，其包括，但不限于玻璃或其它硬塑料諸
如聚碳酸酯，聚苯乙烯等。優(yōu)選地，杯20由聚苯乙烯制成。與玻璃相比， 用聚苯乙烯制作的杯20具有更少的散射光作用。此外，其對于外力，比
玻璃具有更好的抗性，因此確保了操作該儀器的那些人員的安全。此外， 對每個聚苯乙烯杯的滅菌的費用比玻璃或其它材料要便宜。杯20的體積
容量優(yōu)選地在毫升范圍內(nèi)，并且更優(yōu)選地從約1到約4ml，并且最優(yōu)選地 是約4 ml。液體樣品混合物17優(yōu)選地被置于杯20中并將其加帽以確保在 杯20中的內(nèi)容物不會溢出杯20。
還可以使用其它不同的杯的形狀和設(shè)計以用于改善的結(jié)果和用于其 它目的。例如，在本發(fā)明中挖空的形狀是有利的(見圖2A)。挖空的杯以這 種方式進行設(shè)計，其在外杯套24中包含內(nèi)套22，在杯20的中心具有空 心18，以這種方式減少了在杯中包含的液體的體積。換言之，液體樣品 17將被包含在杯20的內(nèi)套22和外套24之間，其中中央挖空。這種設(shè)計 的優(yōu)勢是減少了需要的樣品混合物的體積，其接著將通過增加分析物的濃 度來提高測量的靈敏度。在另一個實例中，還可以使用具有薄的矩形形狀 的杯(圖2B)。將杯設(shè)計成具有淺水平深度的矩形形狀，其在杯20中形成 薄膜樣空間。所述薄膜樣特征使小體積的樣品(少于IOO微升)均勻地分布。 杯的深度需要進行實驗確定從而不僅確保所有的樣品在不捕獲空氣的情 況下可以均勻地分散，還將激發(fā)光的焦點置于樣品內(nèi)的正確的位置中。通 過用傳感器系統(tǒng)諸如CCD或PMT掃描杯的表面來檢測分析物。當CCD 掃描通過杯的平表面時，其在樣品中的幾個不同位置對檢測體積進行快相 圖像俘獲。將收集的圖像處理成熒光信號。PMT還可以通過逐行運動掃描 通過杯的表面，并且熒光信號可以直接從樣品中獲得。
除了處理高度濃縮的微升等級的樣品體積的能力之外，這種設(shè)計還在 減少噪聲信號上具有優(yōu)勢。在本發(fā)明的系統(tǒng)中，由于本發(fā)明圓柱形杯的表 面曲率，當激發(fā)和發(fā)射光進行直線垂直運動時，激發(fā)和發(fā)射光可以被偏轉(zhuǎn) 或散射。結(jié)果，真正的發(fā)射光的強度可以被減少，不需要的信號可以被光學(xué)傳感器檢測到。然而，具有平表面的新設(shè)計的杯使激發(fā)和發(fā)射光垂直地 傳遞到杯的表面平面，使在杯的表面產(chǎn)生的光的偏轉(zhuǎn)或散射最少化。在噪 聲信號千擾減少的情況下，對于真正信號的檢測靈敏度可以實質(zhì)上被提 高。此外，通過將掃描路徑控制為單向的，這些類型的掃描系統(tǒng)(逐行掃 描或其它線掃描方式)確保能夠檢測在樣品中不同位置的信號。其可以防 止相同的檢測體積被重復(fù)掃描，這可能是沒有應(yīng)用正確的直線垂直運動速 度時，與圓柱形杯掃描系統(tǒng)相關(guān)的固有缺陷。
杯20的形狀的其它變化包括，但不限于杯底部的形狀(例如，用平 底取代圓底)，直徑和其它外部和內(nèi)部的改進。還可能需要其它的材料改 進來適應(yīng)在儀器設(shè)計和功能上的變化。對于儀器的自動控制和高通量的設(shè)
計，可以使用96孔或384孔板變體或用于圓盤傳送帶系統(tǒng)的多管或杯筒 設(shè)計。矩形杯變化的另一個實例是那些杯可以被一起堆放在多個杯固定器 上，并且激光束可以在杯的一側(cè)聚焦。
可以使用任何激發(fā)光源來提供激發(fā)光14，條件是所述光源可以產(chǎn)生具 有這樣的波長的光，所述波長是激發(fā)配體的熒光標記所需要的。優(yōu)選地， 光源12是激光器，并且更優(yōu)選地是發(fā)光二極管(LED)激光器。在不損害 激發(fā)熒光顆粒的能力的前提下，與使用鹵素氣體(例如氬氣)的激光裝置相 比，LED激光器由于其小型化的尺寸，低發(fā)熱，易于安裝和設(shè)置，易于 用其它波長的激光取代，低成本和長壽命而被優(yōu)選。光源12的實例是具 有7 mW或30 mW功率的單模630 nm波長的激光器。還可以使用激光源 的備選的選擇，諸如氬氣激光或倍頻NdYAG激光器來提高焦點的精確 度。此外，當雙光子激發(fā)系統(tǒng)應(yīng)用于增加目標檢測的特異性時，可以使用 可調(diào)的激光源，諸如可調(diào)的鈦藍寶石激光器。
激發(fā)光源12可以參照杯20以任何角度放置。在優(yōu)選的實施方案中， 激光光源12基本上位于垂直于杯20的位置，但不與杯20排列在一起， 如在圖1A和1B中所顯示的那樣。在另一個實施方案中，激發(fā)光源12基 本上位于垂直杯20的位置，并與其排列在一起，如在圖4A和4B中所顯 示的那樣。
在其中激發(fā)光源12不與杯20排列在一起的實施方案中，將激發(fā)光 14通過分色鏡(也稱作二向色濾色片)35偏轉(zhuǎn)到杯20中的樣品混合物17上。如果光源12與杯20排列在一起，不需要分色鏡35。第一顯微鏡物 鏡(也稱作物鏡)25將激發(fā)光14聚焦，在杯20的樣品混合物17的內(nèi)部位 置形成焦點。物鏡的倍數(shù)優(yōu)選地從約10X到約40X。在優(yōu)選的實施方案中， 第一顯微透鏡25將焦點設(shè)置在杯20的中心。
在杯20中的樣品混合物17的選定體積暴露于激發(fā)光14。選定的體積 可以是杯20中樣品混合物17的部分體積或杯20中樣品混合物17的全部 體積，這可以根據(jù)杯20的形狀和設(shè)計而定。例如，在杯20的設(shè)計為薄的 矩形形狀時，可以選擇樣品混合物17的整個體積。在本發(fā)明中，重要的 是，選定的體積暴露于激發(fā)光14不超過1次，從而避免對分析物的計數(shù) 超過1次。
選擇用于被暴露于激發(fā)光14的樣品17的體積可以通過數(shù)種方式之一 來獲得。例如，通過一個或多個步進電機50移動所述杯從而提供杯20在 一個或多個方向上的移動，這可以是垂直的，水平(側(cè)面)的，旋轉(zhuǎn)的等或 其組合。杯20的運動方向還可以根據(jù)杯20的設(shè)計而定。在一個實施方案 中，將步進電機置于儀器內(nèi)部并控制杯固定器30的直線垂直運動。這種 運動對于掃描大體積的樣品混合物17并避免重復(fù)掃描相同體積是必要的。 這種特征容許當目標分析物在給定樣品中以小量存在時對其進行檢測。在 其中將矩形杯與作為光學(xué)傳感器的CCD —起使用的實施方案中，選定的 扭積可以由CCD位置來確定，這決定被CCD覆蓋的杯的面積。
這種選定的體積被稱作激發(fā)體積，掃描體積或被照射的體積，這是樣 品混合物17中被暴露于激發(fā)光14的體積。
在如在目前的示范性系統(tǒng)中顯示的優(yōu)選的實施方案中，使在杯20中 的選定體積的樣品混合物17暴露于激發(fā)光14的掃描的方式是通過連接于 杯固定器30的動力裝置50給在杯固定器30中固定的杯20提供旋轉(zhuǎn)的和 緩慢的垂直倒轉(zhuǎn)運動。所述動力裝置50由動力控制器55控制。兩種運動 的速度由一個或兩個動力控制器55來控制。在一個優(yōu)選的實施方案中， 兩個動力裝置50和兩個動力控制器55被安裝在儀器內(nèi)部。 一個動力裝置 負責直線運動，另一個動力裝置負責旋轉(zhuǎn)運動。直線/旋轉(zhuǎn)運動的速度，掃 描的起始點，掃描的延續(xù)時間和掃描距離都可以通過運動控制軟件進行調(diào) 節(jié)。在一個實施方案中，直線速度是約0.8英寸/秒，旋轉(zhuǎn)速度是約300 rpm，掃描距離是約0.28英寸。運動的速度和掃描距離可以基于樣品體積和目標
分析物的濃度來調(diào)節(jié)。動力裝置50導(dǎo)致的杯20的運動導(dǎo)致配體-分析物復(fù) 合物以隨機軌跡通過掃描的或被照射的體積。杯20的運動容許大體積樣 品混合物17的掃描并避免重復(fù)掃描相同的體積。具體而言，直線和旋轉(zhuǎn) 運動一起容許當目標分析物在給定樣品混懸液中以小量存在時，對其的檢
杯固定器30和動力50的組件可以連接于金屬棒支架(直線傳動裝 置)58，所述金屬棒支架沿著在金屬棒支架58上的運動軌跡(未顯示)垂直 地移動杯20。主要的控制器可以通過適合的纜諸如RS232纜連接于計算 機的串行端口。
當結(jié)合熒光配體的分析物以被照射的體積暴露時，來自配體的熒光團 以對于熒光團類型獨特的波長發(fā)射能量。如果目標分析物存在于結(jié)合樣品 混合物17中的熒光配體的樣品混懸液中，并且通過分色鏡35，如果存在 的話，以通過第二顯微鏡透鏡58來聚焦發(fā)射光45的話，那么發(fā)射光45 從樣品混合物17中發(fā)射。發(fā)射濾色片70選擇性地僅通過在峰波長附近的 特定范圍的波長(例如640 nm濾色片)，并且濾過的發(fā)射熒光的光46被檢 測器60所采樣。在其中存在分色鏡35的實施方案中，所述分色鏡可以充 當發(fā)射的熒光45的濾色片并且發(fā)射濾色片70是任選的。二向色濾色片35 和發(fā)射濾色片57 二者通過僅濾過單或多光子激發(fā)的具體波長的光來作用 使來自激發(fā)光和散射光的干擾最小化。
濾過的發(fā)射熒光46通過被設(shè)置在狹縫夾75上的狹縫(未顯示)。在
一個實施方案中，兩個光學(xué)狹縫片的組合直接位于檢測器60的前面。一 個是垂直狹縫，另一個是由涂布的黑金屬制成的水平狹縫，盡管可以使用 避免光反射和散射的任何材料。在中間存在間隔的情況下，將所述兩個片 一起放置來形成正方形的針孔。針孔的重要功能是增加在真實的信號和背 景噪聲中的對比。針孔傾向于增加真實的信號與背景噪聲的對比水平，尤 其是當真實的信號和背景噪聲的亮度彼此沒有實質(zhì)上的不同的時候，這偶 然發(fā)生在許多生物樣品中。在優(yōu)選的實施方案中，使用0.005, 0.01,0.015, 0.02,0.025,0.05英寸的垂直和水平狹縫。不同的狹縫大小的應(yīng)用取決于信 號的對比水平。對比越弱，越推薦使用較小的針孔。對于與熒光染料、熒光概球體和熒光納米球體綴合的抗體而言，0.025英寸的狹縫的片適合于
正確檢測。在另一個實施方案中，狹縫夾75具有兩個鈕，容許調(diào)節(jié)狹縫(或
針孔)的垂直和水平位置。
接著，被濾過的發(fā)射光46以一定釆樣速率(諸如20-100K Hz)由檢 測器60采樣，產(chǎn)生多信號峰，其可以作為熒光強度對時間的函數(shù)F(t)用圖 表示。檢測器60是光學(xué)傳感器。在優(yōu)選的實施方案中，所述檢測器60是 光電倍增管(PMT)，諸如來自Hamamatsu, Japan的HC 120 PMT。在另一 個實施方案中，檢測器60是雪崩光電二極管(ADP)，其具有比PMT更高 的量子功效。在另一個實施方案中，檢測器60是電荷耦合器件(CCD)。光 學(xué)傳感器的選擇不僅取決于其靈敏度，還需要考慮杯20的設(shè)計和傳感器 與數(shù)據(jù)獲得硬件的相容性。
檢測器60通過適合的纜62 (諸如BNC纜)連接于A/D轉(zhuǎn)換器65。 所述A/D轉(zhuǎn)換器65將來自檢測器60的類似信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。將數(shù) 字化信號稱為原始數(shù)據(jù)。將A/D轉(zhuǎn)換器65通過適合的纜(未顯示)(諸如 100針I(yè)/O纜等)連接于被置于主機(未顯示)中的數(shù)據(jù)獲得卡(未顯示)。
數(shù)字化信號可以通過一個或多個不同的信號模式識別模型，諸如但不 限于功率譜密度函數(shù)(PSD)，信號峰計數(shù)方法，加權(quán)信號方法來進行分析。 在信號振幅，脈沖寬度和振幅中的變化通過信號方法進行評價，并確定目 標分析物是否存在于樣品中。測試結(jié)果可以定量或定性地顯示。
作為時間的函數(shù)的給出光電流的信號的時間示蹤被儲存在計算機中 并通過軟件進行分析，所述軟件是對于本發(fā)明的儀器所具體開發(fā)的。所述 軟件考慮了低通過濾過方案來避免不需要的電子和機械噪聲信號。所述軟 件還可以使用數(shù)種方法來分析信號。低和中等頻率的信號可以通過，例如 功率譜密度函數(shù)(PSD)來進行分析。所意欲的目標信號大部分屬于這種頻 率范圍。此外，另一種方法確定信號峰的數(shù)量。當信號峰的振幅大于背景 噪聲的振幅時，將信號峰計算在內(nèi)。將背景的平均振幅和變化作為閾值振 幅來確定陽性峰。用于所述軟件的算法的實例示范性地顯示于圖3中
與來自背景的那些相比，來自結(jié)合熒光配體的目標分析物的信號在脈 沖寬度上更寬，而在振幅上更高。對軟件進行設(shè)計來通過其脈沖長度和振 幅將真實的信號和噪聲區(qū)分開。當考慮它們的脈沖寬度和振幅時，真實的信號比背景信號更有影響。在一個優(yōu)選的實施方案中，進行多重水平的數(shù) 據(jù)分析來確保實時地以給定的靈敏度精確和一致的檢測目標分析物。在一 個優(yōu)選的實施方案中，通過下列分析方法來分析原始數(shù)據(jù)，它們是1)通 過使用功率譜密度(PSD)函數(shù)進行低頻和中頻信號的幅值分析，2)對振幅大
于平均背景值的信號峰的數(shù)量進行計數(shù)，和3)脈沖或振幅加權(quán)方法。每種
分析方法的簡要描述見下。
在本發(fā)明中，原始數(shù)據(jù)是由結(jié)合熒光試劑的目標分析物，未結(jié)合的熒 光試劑，光反射或散射光噪聲和電子/機械信號干擾和其它產(chǎn)生的熒光信號 的混合物。因此，需要這樣的數(shù)據(jù)分析方法，其能夠從所有其它的噪聲信
號中區(qū)分所需的熒光信號。PSD函數(shù)是這樣的分析方法的其中之一。PSD 函數(shù)將原始的熒光信號解構(gòu)成特定信號模式的分段信號塊。每個信號塊由 從原始信號獲得的類似的振幅和頻率模式組成。那些振幅和頻率數(shù)據(jù)與信 號模式塊組合在一起來產(chǎn)生另一種水平的在低，中和高信號頻率范圍被標 記和指定的信號模式。在最終形式的PSD信號中的低和中頻率范圍大部分
是真實的信號，其中大部分的噪聲信號被排除在外。因此，通過使用PSD 函數(shù)，產(chǎn)生自目標分析物的熒光信號可以從噪聲信號中區(qū)分出來。PSD函 數(shù)的這種優(yōu)點容許當目標生物存在于給定樣品中時，在噪聲信號干擾最少 的情況下，評價在信號的振幅/頻率中的變化。PSD實際上是眾所周知的 算法系統(tǒng)。但是，按照特定儀器和試劑系統(tǒng)應(yīng)用這種PSD可以是定制的， 因此在數(shù)據(jù)分析程序中具有獨特的特征。
消除不需要的噪聲信號的另一種方式是使用低通濾色片。所述低通濾 色片阻擋大量的以高頻發(fā)生的噪聲信號，但是通過較低頻率的信號進行分 析。存在兩種類型的低通濾色片；模擬電路類型和數(shù)字電路類型。盡管優(yōu) 選數(shù)字電路類型低通濾色片，兩種類型都與本發(fā)明的系統(tǒng)相容。
接著，通過對具有比截止振幅更大的振幅的所有的信號峰進行計數(shù)來 對濾過的原始數(shù)據(jù)進行信號計數(shù)分析，所述截止振幅被作為閾值。為了獲 得正確的閾值，分析包括大量的噪聲信號的沒有濾過的數(shù)據(jù)。將未濾過的 數(shù)據(jù)的平均值和變化(標準偏差)設(shè)置為閾值。用于所述分析的變化的程度 取決于根據(jù)不同的信號強度所使用的試劑類型。例如，平均值加變化的1.5 倍的閾值用于分析從熒光染料顆粒試劑系統(tǒng)中收集的數(shù)據(jù)，將平均值加3倍變化用作閾值來分析來自熒光微球體試劑系統(tǒng)的數(shù)據(jù)。
當目標分析物以非常低的濃度存在于樣品中時，從峰計數(shù)方法得出的 結(jié)果似乎沒有明顯地與背景具有不同。計數(shù)方法不能從需要的或真實的信 號中識別背景信號。更合適的，對振幅大于閾值的任何峰進行計數(shù)。結(jié)果， 當目標分析物諸如微生物在給定樣品中以極小量存在時，計數(shù)結(jié)果傾向于 是不準確的。在這些情形中，設(shè)計加權(quán)方法來進一步抑制噪聲信號的干擾 并提高檢測系統(tǒng)的靈敏度。加權(quán)方法使用信號峰的振幅和脈沖寬度。振幅 取決于強度，并且脈沖寬度通過測量信號峰在閾值振幅以上起落的延續(xù)的 時間來確定。在這種分析中，比閾值大的個體信號峰與其本身的脈沖寬度 或振幅相乘。接著合計所有的值，這被作為加權(quán)值。
該方法基于由目前的熒光試劑產(chǎn)生的信號的獨特特征。由于在檢測體 積中的不同大小和停留時間，由與本發(fā)明的熒光試劑結(jié)合的目標分析物產(chǎn) 生的信號與來自未結(jié)合的熒光試劑以及其它的噪聲的信號相比，具有更長 的延續(xù)時間和更大的振幅?？紤]到該事實，預(yù)期我們需要的或真實的信號 的加權(quán)值基本上大于背景信號的加權(quán)值。因此，即使當目標分析物在樣品 中的含量極少時，需要的信號與背景(來自未結(jié)合的熒光試劑)信號的差異 也變得清楚。計數(shù)方法與加權(quán)分析的組合應(yīng)用獲得了本發(fā)明的系統(tǒng)的巨大 的靈敏度。
在顯示于圖1A和1B和圖4A和4B的本發(fā)明的優(yōu)選的實施方案中， 將所有的光學(xué)裝置排列在金屬穩(wěn)定器78上。在儀器中的所有的組分可以 用不透光的鋁容器覆蓋以防止散射光的干擾進入光學(xué)傳感器60。在另一 個實施方案中，狹縫夾75具有兩個調(diào)節(jié)狹縫或針孔的垂直和水平位置的 小鈕。所有的內(nèi)部組件可以用不透光的容器進行覆蓋，所述不透光的容器 用不透聲的材料隔離以減少機械噪聲。
在顯示于圖4A和4B的另一個實施方案中，構(gòu)型類似于在圖1A和 1B中顯示的實施方案的構(gòu)造，除了第一顯微透鏡25和激發(fā)光源12被再 次定位，從而使第一顯微透鏡25和光源12 二者目前都位于杯20的約90° 的位置，其中光源12直接位于顯微鏡透鏡25的后面，從而使所有的這些 組件(光源12、第一顯微透鏡25和杯20)基本上排列在直線上并且來自光 源12的激發(fā)光14通過第一顯微透鏡25被聚焦到置于杯20中的樣品混合
21物17中。分色鏡35被移去因為不再需要它來將激發(fā)光14從光源12偏 轉(zhuǎn)到樣品混合物17中。
在另一個實施方案中，樣品混合物17的被照射的體積可以通過杯20 的特殊運動被最大化。被照射的體積越大，可以被包括在掃描中的目標分 析物分子的數(shù)量越多，導(dǎo)致了目標分析物中更低的檢測限制和量化所述分 析物的更高的精確度和一致性。在一個實施方案中，特殊運動包括旋轉(zhuǎn)杯 20，同時讓其重復(fù)垂直運動。所述運動由兩個單獨的步進電機驅(qū)動，其由 兩個單獨的可編程的動力控制器所協(xié)調(diào)。 一個步進電機負責旋轉(zhuǎn)，而另一 個步進電機負責垂直運動。在顯示于圖5和6中的另一個實施方案中，垂 直和旋轉(zhuǎn)運動都由連接于傳動裝置90的一個電機50所驅(qū)動。杯固定器30 將杯20(未在圖6中顯示)垂直地固定并位于螺旋桿80的頂部。所述桿80 上刻有嚙合有傳動裝置90的螺旋槽84。當電機50和連接的傳動裝置前部 90旋轉(zhuǎn)時，傳動裝置前部90沿著螺旋槽84移動并垂直地驅(qū)動桿80，同 時桿80旋轉(zhuǎn)。通過轉(zhuǎn)換傳動裝置旋轉(zhuǎn)的方向來逆轉(zhuǎn)垂直運動的方向。在 該實施方案中的一個電機的動力系統(tǒng)比兩個電機的系統(tǒng)在更低的生產(chǎn)費 用，更小的機械大小，更容易進行部件的裝配和替換，更小的機械振動和 噪聲，和較不復(fù)雜的運動控制軟件的設(shè)計上具有優(yōu)勢。
當檢測時間變得更長時，如果存在于樣品混合物17中的話，顆粒的 沉淀可以發(fā)生在杯20的底部，這可以削弱本發(fā)明系統(tǒng)的檢測精確度，一 致性和靈敏度。為了防止在樣品混合物17中的顆粒的沉淀，還可以考慮 結(jié)合使用如在圖5中顯示的杯20來進行杯20的側(cè)面位移或運動，所述 杯20裝備有回流制動器94從而使在將樣品混合物17過濾到杯20中時， 在樣品混合物17和回流制動器94之間有極少或沒有空氣被捕獲。空氣98 僅出現(xiàn)在與樣品混合物17分離的回流制動器94上面。當不具有回流制動 器的杯被置于側(cè)面并進行快速直線運動時，當在杯20中在樣品混合物17 的上面有空氣被捕獲時，可導(dǎo)致液體的渦旋流。在該實施方案中被插入杯 20中的回流制動器94防止了空氣在杯20中被捕獲在樣品混合物17上面 并防止了渦旋流和隨后的任何顆粒在樣品混合物17中的沉淀。還可以使 用在圖5中顯示的杯20以不同于側(cè)面運動的其它運動防止沉淀。
本發(fā)明的一個優(yōu)勢是在檢測細胞，蛋白質(zhì)和代謝物中以及量化這些生物分析物中的高水平的靈活性。如前面所討論，杯20可以以薄的矩形體
形狀存在(圖2B)。這種矩形杯適合于上述生物分析物。使用圓柱形杯以及
旋轉(zhuǎn)和垂直運動可以導(dǎo)致相同目標的重復(fù)測量，這是因為其中不存在被標 記的分析物的信息。光檢測掃描方法可以通過減少重復(fù)的測量增加檢測的
精確度。可以獲得兩種類型的掃描， 一種具有PMT傳感器(或類似傳感 器系統(tǒng))，另一種具有電荷耦合器件(CCD)。兩種類型的掃描需要使用薄的 正方形或矩形杯取代圓柱形杯。與圓柱形杯相比，薄的矩形杯容納更少的 體積(與毫升范圍相比，微升范圍)，并因此通過降低體積來增加液體樣品 的表觀濃度。此外，薄的矩形杯可以在廣泛的區(qū)域內(nèi)傳播液體樣品，這導(dǎo) 致具有均一濃度的目標分析物的更均一的分布。
當用薄的矩形杯取代圓柱形杯并使用PMT來掃描發(fā)射熒光信號時， 還需要替換系統(tǒng)的一些組分。例如，用具有軌道的側(cè)面運動來取代旋轉(zhuǎn)運 動，并使所述杯固定器適應(yīng)于矩形形狀，而不是圓柱形杯。熒光信號的PMT 掃描也必須被改進。如在圖7中所顯示，在該實施方案中的PMT通過軌 道系統(tǒng)和步進電機驅(qū)動的逐行掃描薄的矩形杯的表面(步驟l)來產(chǎn)生來自 PMT的信號流(步驟2)?？梢酝ㄟ^這種PMT掃描來獲得兩個具體的功能。 首先，基于熒光發(fā)射數(shù)據(jù)，PMT可以指示目標信號的存在。軟件設(shè)計可以 基于以側(cè)面和上下運動的PMT掃描速度來計算目標信號的位置。這也減 少了不止一次對相同的目標進行計數(shù)的可能性，因此增加了檢測靈敏度和 精確度。第二，來自PMT的信號流數(shù)據(jù)可以從兩維信號陣列被重新構(gòu)建 成如在圖7的步驟3中顯示的目標形狀的圖像。即使PMT在步驟2中產(chǎn) 生電信號流，在給定的目標分析物諸如細胞上的PMT的取樣時間可以提 供有價值的信息。例如，與被掃描的杯的運動速度的運算規(guī)則計算組合， PMT的電信號流可以在樣品的給定區(qū)域中產(chǎn)生目標分析物(例如，細胞)的 位置圖譜并產(chǎn)生本身在圖7的步驟4中顯示的目標分析物的外圍圖像。結(jié) 果，數(shù)據(jù)分析可以提供目標分析物的大小和定位。此外，在目標的類型是 細胞的情形中，電信號的振幅給出熒光的強度并且其傳遞細胞上的熒光的 分布信息。
如在前面所討論，CCD光學(xué)傳感器還可以與在圖2B中所顯示的薄 的矩形杯設(shè)計結(jié)合使用。與PMT作為傳感器相比，CCD的優(yōu)勢是如果給定區(qū)域足夠小到照相機能夠進行處理的程度，則CCD不需要掃描，因為 其在所述區(qū)域采取熒光信號的快照俘獲。當來自目標源的光或熒光發(fā)射激
活CCD象素時，來自CCD的每個象素的信號產(chǎn)生關(guān)于所述分析物的定位
和大小的信息。這樣的光發(fā)射的不同強度還可以產(chǎn)生目標分析物分布的圖
像。CCD的另一個優(yōu)勢是在檢測已經(jīng)以二維存在的信號中，其可以提供目 標分析物的定位，并消除相同目標的重復(fù)測量。
所述CCD可以以數(shù)種方式之一進行設(shè)置和操作。例如，如果樣品大 小(矩形表面大小)對于圖像的CCD容量足夠小，那么其可以位于固定的位 置并且不一定進行掃描以獲得需要的數(shù)據(jù)結(jié)果。當使用者需要測量大體積 的樣品，或細胞或目標的尺寸太小，因此需要增加分辨率時，掃描方法可 以與CCD —起使用。在該情形中，如在PMT掃描方法的情形中，CCD 照相機掃描矩形杯的表面。在必要的掃描后，個體掃描圖像可以被重構(gòu)以 產(chǎn)生需要的數(shù)據(jù)。例如，如在圖8中所顯示，杯表面的區(qū)域可以被分成數(shù) 個子區(qū)(例如，4X4或12X12)，并且CCD可以在每次讀出一個子區(qū)(步驟 1-4)，并且接著將每個子區(qū)的圖像合并以構(gòu)建成被掃描區(qū)域的完整圖片(步 驟5)。
試劑和方法
已經(jīng)開發(fā)高質(zhì)量的試劑和精確的方法來獲得本發(fā)明的檢測系統(tǒng)的最 佳靈敏度，特異性和一致性來檢測和量化目標分析物，特別是生物分析物 諸如細胞，微生物，蛋白質(zhì)和核酸或核酸序列，尤其是對于復(fù)雜樣品諸如 食品，環(huán)境和臨床樣品，其中所述目標分析物在非常復(fù)雜的基質(zhì)中，所述 基質(zhì)具有非常復(fù)雜和高度變化的組合，這在許多情況下干擾檢測方法。
通常，本發(fā)明的對于這些復(fù)雜的生物樣品的檢測方法由下列關(guān)鍵步驟 組成(1)捕獲/分離/濃縮,(2)熒光標記,和(3)目標分析物的檢測。
第一個步驟是通過使用適合的試劑和裝置處理樣品后，從原始樣品中 捕獲，分離和/或濃縮目標分析物。存在許多方法來捕獲，分離和濃縮樣品 中的分析物，并且所述方法是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員已知的。這些方法的實 例包括，但不限于各種色譜技術(shù)(例如大小排阻色譜法，吸附色譜法，薄層 色譜法，pH梯度色譜法，鹽梯度色譜法，高效液相色譜法，配體-結(jié)合色譜法等)，過濾，離心，電泳，等電聚焦，透析，低壓升華干燥法，免疫分離 法，免疫磁性分離法等。在優(yōu)選的實施方案中，將免疫磁性分離技術(shù)用在 該步驟中以符合下面標準從不純的或復(fù)雜的生物樣品中具體捕獲目標分 析物并將分析物濃縮成小體積以易于處理。用試劑A和磁性回收器進行該 步驟。試劑A是包含與適合的配體綴合的磁性顆粒(例如微球體)的溶液， 所述配體能夠與待檢測的分析物結(jié)合以形成配體-磁性顆粒復(fù)合物。適合的 配體的實例包括，但不限于在液體介質(zhì)中的多克隆/單克隆抗體，可溶性受 體或寡核苷酸探針，所述液體介質(zhì)諸如具有防止微球體團聚的任選的去污 劑和封閉劑。盡管本文使用術(shù)語"免疫磁性分離"，其并不意味著所述配 體必須排它性地是免疫分子作為抗體。如早前討論，所述配體還可以包括 其它適合的配體諸如但不限于可溶性受體和寡核苷酸探針。磁性微球體通 常是包封氧化鐵的聚苯乙烯珠并且可具有不同的大小(例如，直徑從
O.OlPm至lj 4.8Pm)和不同的表面性質(zhì)。珠大小和表面性質(zhì)的選擇根據(jù)不同 的因子諸如分析物和待綴合在珠上的配體的類型。在本發(fā)明的一個實施方 案中，磁性微球體的大小在直徑上是約0.86tai。用于將液體綴合到磁性微 球體上的方法是在文獻中有充分記載，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知 的。磁性回收器物理地從樣品的剩余物中分離配體-磁性顆粒復(fù)合物，所述 樣品的剩余物可能包含干擾目標分析物的檢測的不需要的物質(zhì)。所述磁力 回收器可以根據(jù)具體應(yīng)用被設(shè)計成具有不同磁力強度的各種形狀。當樣品 與試劑A混合時，在樣品中的目標分析物形成分析物-配體-磁性顆粒復(fù)合 物。接著，將這種復(fù)合物用磁性回收器從樣品中分離出來。總而言之，已 經(jīng)開發(fā)或可以開發(fā)用于具體分析物的專用試劑和裝置以容許進行與常規(guī) 方法相比，廉價、容易、較少出錯和快速的樣品制備。
第二個步驟是用熒光標記來自第一個步驟的分離的目標分析物。該過 程可以例如，通過將獲自第一個步驟的分析物-配體-磁性顆粒復(fù)合物與包 含熒光顆粒(其可以是無機或有機的熒光團，所述熒光團包括但不限于熒光 染料和熒光珠，球體或其它類型的熒光分子)的試劑B—起溫育以形成包 含分析物-配體-磁性顆粒復(fù)合物和配體-熒光顆粒復(fù)合物的樣品混合物來 完成，所述試劑B通過將熒光顆粒與適合的配體諸如但不限于多克隆/單 克隆抗體或核酸探針進行綴合來形成。用于將配體與熒光顆粒綴合在一起的方法是文獻中充分記載的并且是本領(lǐng)域那些技術(shù)人員公知的。在試劑B 中的這些配體-熒光顆粒復(fù)合物根據(jù)綴合于熒光顆粒的配體的類型，例如， 通過特異性抗原-抗體反應(yīng)或核酸雜交，結(jié)合于在分析物-配體-磁性顆粒復(fù) 合物中的目標分析物從而形成熒光標記的分析物復(fù)合物?？梢酝ㄟ^將試劑 A和試劑B同時加入在液體介質(zhì)中的樣品中，隨后使所述混合物經(jīng)受磁 力作用來將第一個步驟和第二個步驟合并在一個步驟中。
盡管當熒光顆粒制備自熒光染料時，配體-熒光顆粒復(fù)合物的大小保 證了與在所述磁性配體復(fù)合物的表面上的目標分析物的最大接近，來自該 復(fù)合物的熒光的低量子產(chǎn)率和快速衰減可以導(dǎo)致檢測結(jié)果中的較差靈敏 度和不一致性。
熒光球體(微米或納米等級的大小)是用在本發(fā)明的試劑B中的優(yōu)選的
熒光顆粒。使用這種試劑來克服熒光染料顆粒所具有的如上提及的缺陷。 熒光球體具有比熒光染料顆粒更大的量子產(chǎn)率，因為大量的熒光團可以被 包封在聚苯乙烯珠中。因此，當結(jié)合與適合配體綴合的熒光微米/納米球體 的目標分析物以被照射的體積被光源激發(fā)時，更強的熒光信號被發(fā)射。結(jié) 果，當在樣品混合物中存在低水平的背景發(fā)射光時，信號與噪聲比得到提 高，這可以通過系列的洗滌步驟來實現(xiàn)。
還可以將納米等級大小的量子點(quantum dot)用作在試劑B中的熒 光顆粒。這種納米顆粒具有比熒光微米/納米球體更大的量子產(chǎn)率和長期的 光穩(wěn)定性。此外，它們的斯托克司頻移(StokesShift)(在激發(fā)和發(fā)射光譜最 大值之間的波長差異)離得很遠，這對于熒光測量而言是有利的。例如， 量子點納米球體之一在480 nm波長進行激發(fā)并且在640 nm波長發(fā)射信 號。量子點的這些性質(zhì)使激發(fā)光對檢測產(chǎn)生自目標分析物的真實的放射光 的干擾最小化，同時顯著增加真實信號的強度。與納米等級大小的優(yōu)勢結(jié) 合，使用與適合的配體綴合的量子點將實質(zhì)上增加信號與噪聲比，導(dǎo)致本 發(fā)明檢測系統(tǒng)的提高的靈敏度。
在進行從熒光標記的目標分析物檢測發(fā)射的熒光信號的第三個主要 步驟之前，在增加信號與噪聲比上，洗滌是必要的。洗滌次數(shù)和數(shù)量必須 根據(jù)熒光顆粒的顆粒大小和樣品類型通過實驗進行確定。如在本發(fā)明中公 開的實施例中所顯示，洗滌步驟可以是手動的，或可以通過高通量自動控制的系統(tǒng)進行，所述系統(tǒng)使用一致、精確和可靠的液體處理性能來進行正 確洗滌，這將導(dǎo)致本發(fā)明的檢測系統(tǒng)的一致性和增加的靈敏度。現(xiàn)在，洗 滌的樣品混合物已經(jīng)準備好進行下一個步驟。
第三個和最后一個主要步驟是測量從在第二個步驟中制備的熒光標 記的目標分析物中發(fā)射的熒光信號。將洗滌的樣品混合物置于被放置在如 上所述的本發(fā)明儀器的杯固定器30的杯20中。檢測和測量濾過的發(fā)射熒
光46。熒光通過一系列如前所述的光學(xué)裝置并被轉(zhuǎn)化為電信號，所述電信 號通過數(shù)據(jù)分析軟件實時進行分析。在一個實施方案中，根據(jù)在杯20中 的樣品混合物的體積，將發(fā)射的熒光測量約30秒到約2分鐘。在上述的 本發(fā)明中的儀器的操作簡單地將杯20放置在杯固定器30中，隨后點擊起 始按鈕來開始測量。當預(yù)先設(shè)定的測量時間終止時，動力控制/數(shù)據(jù)獲得軟 件自動終止操作，隨后顯,結(jié)果。在一個實施方案中，通過計算機運行軟 件，所述計算機是與儀器分離的裝置。在一個優(yōu)選的實施方案中，軟件可 以通過結(jié)合在所述儀器中的中央處理裝置進行操作。在本發(fā)明的儀器及其 各種實施方案中的高靈敏度可以在2分鐘內(nèi)，在使用最少的體力勞動的情 況下提供精確的結(jié)果。
上述分析物檢測方法可以被改進和定制從而適應(yīng)于檢測樣品中各種 類型的各種分析物，這將在下面詳細進行討論。
在食品，臨床和環(huán)境樣品中的致病性微生物的檢測
(A) IMS/熒光微球體方法
這種方法使用在試劑A中應(yīng)用配體-磁性微球體的免疫磁性分離(IMS) 和在試劑B中應(yīng)用熒光微球體的熒光標記的組合。在一個優(yōu)選的實施方案 中，試劑A包含用在前描述的適合的配體包被的磁性微球體。磁性微球體 的大小的直徑可以例如從0.86 um變化到4um。微球體的大小的選擇根 據(jù)待測試的樣品的性質(zhì)。例如，如果樣品具有高粘度和混濁度，對于目標 生物的高回收比率，優(yōu)選更大的磁性微球體(例如，介于2.8至U4um)。另 一方面，如果樣品是粘性較少和更澄清的溶液，對于正確回收，更小的微 球體諸如0.86um是充分的。
可以使用各種方法來制備試劑A和試劑B用于這種具體的或其它的應(yīng)用。如下詳細描述示范性的方法。
鏈霉抗生物素蛋白包被的微球體包封的磁珠通過鏈霉抗生物素蛋白/ 生物素結(jié)合綴合于生物素化的多克隆抗體。鏈霉抗生物素蛋白包被的磁性 微球體的等分試樣與生物素化的多克隆抗體一起在室溫溫育約30分鐘， 伴隨輕柔的顛轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)運動。將反應(yīng)溶液置于磁珠回收器中達3分鐘，隨后
將溶液輕輕倒出并添加洗滌緩沖液(具有吐溫-20的0.1 M磷酸緩沖鹽溶液 (PBS),pH7.4)。重復(fù)該步驟2次。將得到的沉淀重懸并用儲存緩沖液進行 儲存。在該實例中的儲存緩沖液由具有吐溫-20， BSA的0.1M的磷酸緩沖 鹽溶液(PBS)， pH 7.4和適合濃度的proclin組成。吐溫-20和BSA通過 阻斷微球體的非特異性結(jié)合來幫助防止微球體聚集。Procline是廣譜的抗 菌劑并且可以根據(jù)試劑需要的保存限期以一定濃度添加。試劑在使用前進 行超聲波處理。
試劑B包含用多克隆抗體包被的熒光微球體。該顆粒的大小范圍在是 直徑從約lum到約4um。所述激發(fā)波長(Ex)的范圍可以是從約400 nm 到約700 nm，并且發(fā)射波長(Em)范圍可以從400腿到約700 nm。 Ex/Em 波長范圍的選擇取決于安裝在所用的儀器中的光學(xué)發(fā)射濾色片70。在該具 體的實例中，選擇光學(xué)裝置來檢測640 nm(Em)熒光。樣品混合物的條件 也可以在Ex/Em光譜方面影響熒光微球體的選擇。例如，對于包含血液的 樣品而言，優(yōu)選具有超過540 nm (Em)的熒光微球體以避免從樣品中的內(nèi)
源熒光顆粒產(chǎn)生的自身熒光的干擾。
通過在微球體的表面上的羧基(-COOH)基團和抗體的胺基團之間的通
過酯中間體的共價結(jié)合，將多克隆抗體綴合于熒光微球體。這種反應(yīng)通過 添加碳二酰亞胺來激活羧基基團進行介導(dǎo)。優(yōu)選地，使用EDAC (乙基3-(3-二甲基氨基丙基碳二酰亞胺)來激活熒光微球體的表面上的羧基基團。將所 述多克隆抗體與COOH-激活的熒光微球體于室溫一起溫育達約30分鐘， 隨后在8000 rpm離心來洗滌任何未結(jié)合的抗體。重懸得到的沉淀并用10 mMTris, 0.05%牛血清白蛋白(BSA),和0.05%吐溫-20來儲存。在使用前將
所述試劑進行超聲波處理。
將適當超聲處理的試劑A和試劑B同時添加到用于測試的樣品的等 分試樣中以形成粗制的樣品混合物，隨后在室溫進行約30分鐘的溫育，伴隨輕柔的顛轉(zhuǎn)(end-over)旋轉(zhuǎn)運動。將所述粗制樣品混合物置于磁珠回收 器中達約3分鐘，隨后將溶液輕輕倒出并加入洗滌緩沖液。將該洗滌步驟 重復(fù)2次。將沉淀重懸到緩沖液中以形成樣品混合物，所述樣品混合物可 以接著被轉(zhuǎn)移到杯20中。上述程序也可以在杯20中發(fā)生。優(yōu)選地，在被 置于儀器中的杯固定器30之前，將所述杯20用帽封閉。發(fā)射的熒光的測 量在室溫進行約30秒。
(B) IMS/熒光染料方法
這種方法使用在試劑A中應(yīng)用磁性微球體的免疫磁性分離(IMS)和在 試劑B中應(yīng)用熒光染料的熒光標記的組合。試劑A是就在上述的免疫分 離IMS/熒光微球體方法的方法中所用的相同的試劑。試劑B是綴合于熒 光染料分子而不是熒光微球體的多克隆或單克隆抗體。在該實例中， AlexaFluorTM(Molecular Probes, Eugene, OR)是熒光染料顆粒。AlexaFluor 具有633/647 nm的Ex/Em范圍。染料的選擇基于我們的儀器的光學(xué)裝置。 具有不同的Ex/Em范圍的不同的AlexaFluoreTM還可以在改進光學(xué)濾色片 的情況下使用。
AlexaFluore 就在使用前，通過將二甲亞砜(DMSO)添加到染料中來 進行激活。在攪拌的情況下，將激活的染料緩慢加入溶解在碳酸氫鈉緩沖 液中的抗體。將所述混合物在連續(xù)攪拌的情況下于室溫溫育1小時。將綴 合物通過離心和膜過濾的組合從未結(jié)合的游離染料中進行分離。將得到的 綴合物在4。C用包含疊氮化鈉的PBS緩沖液進行儲存。
在室溫，將待測試的樣品的等分試樣與試劑A —起溫育約20分鐘。 將磁珠回收器應(yīng)用于樣品約3分鐘來分離目標分析物，隨后用新鮮的緩沖 液洗滌其2次。將所述溶液輕輕倒出，并將所述沉淀用洗滌緩沖液重懸。 加入試劑B并將其在室溫溫育約30分鐘，伴隨輕柔的顛轉(zhuǎn)旋轉(zhuǎn)。將在樣 品中的磁性熒光標記的配體復(fù)合物置于磁珠回收器中約3分鐘并將洗滌步 驟重復(fù)2次。將得到的沉淀重懸在緩沖液中并將其轉(zhuǎn)移到杯20中。將杯 20置于儀器的杯固定器30中。在室溫，在約30秒內(nèi)進行發(fā)射光的測量。
C) IMS/熒光納米球體方法
29IMS/納米球體的方法使用三種不同的試劑的組合(試劑A，B,和C)。試 劑A是用在該部分前面描述的兩種方法中的相同的試劑。試劑B包含生 物素化的多克隆/單克隆抗體。試劑B通過特異于抗原識別的抗體活性位 點結(jié)合于目標微生物的表面。在試劑B中的抗體還通過抗體的生物素化 的Fc部分和鏈霉抗生物素蛋白包被的納米球體之間的相互作用結(jié)合于熒 光納米球體。試劑C包含與鏈霉抗生物素蛋白綴合的熒光納米球體。納 米球體的大小范圍從約20 nm到約200 nm。Ex/Em范圍介于400 nm和700 nm之間。通過在微球體的表面上的羧基(COOH)基團和鏈霉抗生物素蛋白 的胺基團之間的通過酯中間體的共價結(jié)合，將鏈霉抗生物素蛋白綴合于熒 光納米球體。這可以通過添加碳二酰亞胺來激活羧基基團，隨后用鏈霉抗 生物素蛋白蛋白質(zhì)進行溫育來進行。未結(jié)合的鏈霉抗生物素蛋白通過透析 來去除。
在一個實施方案中，使用EDAC(乙基3-(3-二甲基氨基丙基碳二酰亞 胺)來激活在熒光納米球體表面上的羧基基團。在室溫，將所述鏈霉抗生物 素蛋白與激活的納米球體一起溫育約30分鐘或更長，隨后進行透析來去 除未結(jié)合的抗體。透析膜的分子量截留值在約300到約500 kDa的范圍內(nèi)。 所述綴合物用10 mM Tris， 0.05% BSA, 0.05%吐溫-20進行儲存。還可以 將試劑C應(yīng)用于與鏈霉抗生物素蛋白綴合的量子點。量子點具有CdSe-ZnS 核心并且其大小范圍在直徑上從10nm到100nm。使用與光學(xué)裝置相容的 具有Ex/Em范圍的量子點。綴合方法類似于上述方法。
將待測試的樣品的等分試樣在室溫與試劑A和試劑B —起溫育約30 分鐘。將磁珠回收器應(yīng)用于樣品約3分鐘以分離目標分析物，隨后用新鮮 的緩沖液洗滌2次。將溶液輕輕倒出并將沉淀用新鮮緩沖液重懸。加入試 劑C并將其在室溫，在約30分鐘或更少的時間內(nèi)溫育，伴隨輕柔的搖動。 將樣品置于磁珠回收器約3分鐘并重復(fù)洗滌步驟2次。將得到的沉淀重懸 在緩沖液中，并將其轉(zhuǎn)移到杯20中。上述方法也可以發(fā)生在杯中。將杯 20置于在儀器中的杯固定器30中。在室溫，在約30秒或更多的時間內(nèi)進 行發(fā)射光的測量。
還可以將前述方法和試劑用在食品、臨床和環(huán)境樣品的致病性微生物 的多重檢測中。在程序順序上的改進如下。取代使用靶向一種分析物的單一類型的磁性微球體，將與不同的抗體或核酸探針綴合的磁性微球體的混 合物與待測試的樣品一起溫育來提取多重目標分析物。需要對在混合物中 的每種試劑的組成進行優(yōu)化來確保每種目標分析物的高效回收。磁珠回收
(retrieving)和洗滌方法與上述相同。將洗滌的樣品與綴合于不同抗體或 核酸探針的前述熒光試劑(熒光染料顆?；蛭⒚谆蚣{米球體)的混合物一起 溫育。每種試劑具有獨特的發(fā)射光譜，其容許鑒定樣品中的不同的分析物。 為了從所述樣品中分離多重發(fā)射熒光的光，需要將多重發(fā)射濾色片和多重 光子傳感器安裝在儀器中。
總的存活細胞計數(shù)或特異性生物的檢測
開發(fā)下列方法來對在食品、臨床或環(huán)境樣品中發(fā)現(xiàn)的總的存活生物 (TVO)或特異性生物進行檢測和計數(shù)。
為了對總的活生物進行檢測和計數(shù)，在該方法中使用兩種不同的試劑 (試劑A和B)。試劑A包含滲透所有的生物并對它們的核酸進行染色的 熒光染料。為此目的的適合的熒光染料的實例根據(jù)具體的應(yīng)用包括，但不 限于SYTO熒光染料(Molecular Probes, Eugene, OR)和相當?shù)娜玖?。試劑B 包含僅標記死生物的核酸的熒光染料。為此目的的適合的熒光染料的實例 包括，但不限于SYTOX熒光染料(Molecular Probes, Eugene, OR)和相當?shù)?染料。將樣品的等分試樣首先在室溫與滲透所有的微生物的膜并對它們的 核酸進行染色的試劑A—起進行溫育。在簡短的洗滌步驟后，加入試劑B 并將其在室溫溫育，其特異性地對死生物的核酸進行染色。接著，將染色 的生物轉(zhuǎn)移到杯20中。將杯20置于儀器中的杯固定器30中，優(yōu)選地將 杯20用在杯20上的蓋子進行封閉。或者，反應(yīng)可以發(fā)生在杯20中，其 中轉(zhuǎn)移到杯中的步驟成為不必要的。發(fā)射光的測量在室溫發(fā)生約2分鐘。 通過死生物對比活生物的群體分析，可以獲得總的活生物的計數(shù)。
通過目標核酸序列檢測特異性生物
這種檢測特異性生物的方法使用包含磁性微球體的一種試劑，所述磁 性微球體與來自16SriDNA， 18SrDNA,或特異性基因的生物-特異性寡核苷 酸綴合。特異性的目標序列可以通過使用磁珠進行檢測，所述磁珠具有連接于珠的表面的核酸的互補序列。這些表面序列具有與所述序列相關(guān)的熒 光染料，但是通過使序列成環(huán)的物理機制或通過其它的酶促方式其熒光被 猝滅。在結(jié)合于樣品中的目標序列后，這些序列將被暴露，熒光染料將被 釋放進行熒光發(fā)射。所述方法還可以用在微生物的多重檢測中。與在微球 體表面上的特異性寡核苷酸綴合的不同熒光光譜的微球體與待測試的分
析物樣品一起進行溫育。每種標記的試劑具有不同的Em光譜。通過多重
傳感器來檢測信號，每種檢測一種具體的波長。 蛋白質(zhì)，生物標記物和代謝物的檢測
為了檢測蛋白質(zhì)，生物標記物和代謝物，使用兩種試劑(試劑A和B)。 試劑A與在免疫分離(IMS)/熒光微球體方法中所述的試劑A相同。試劑B 與在免疫分離(IMS)/熒光顆粒的方法中所述的試劑B相同。將試劑A和 所述樣品混合和溫育。在溫育約10分鐘后，用洗滌緩沖液(PBS-吐溫20 (0.01%))洗滌樣品一次，接著將其重懸于預(yù)加溫(37"C)的反應(yīng)緩沖液。加入 試劑B來制備樣品。通過在測試管中上下吸取數(shù)次來重懸樣品，所述樣 品接著在顛轉(zhuǎn)的情況下，在37'C被溫育約30分鐘。溫育后，將每個測試 管施加于磁性回收器約3分鐘并用洗滌緩沖液洗滌2次，接著重懸到終體 積1 ml的檢測緩沖液。接著，測量其蛋白質(zhì)濃度。
分析多個樣品的高通量的自動控制系統(tǒng)
在本發(fā)明中的儀器的上述實施方案的任一個還可以包括高通量的自 動控制系統(tǒng)來處理和分析多個樣品。高通量系統(tǒng)的實例包括，但不限于高 通量傳動系統(tǒng)和高通量的自動控制多重系統(tǒng)。
在高通量的傳動系統(tǒng)中，所述系統(tǒng)包括一個或多個齒條，每個齒條固 定包含樣品混合物的多個杯或管。制備樣品以與各種試劑反應(yīng)的所有步 驟，包括液體轉(zhuǎn)移，混合，渦旋，應(yīng)用磁力，將杯從齒條上移到儀器中的 杯固定器上等，可以作為儀器的部分或作為與所述儀器組合進行工作的獨 立的組件充分進行自動控制。
在高通量的多重系統(tǒng)中，將具有不同數(shù)量的孔(例如8-384)的深孔板用 作多重平臺。對于操作所需要的所有的步驟，包括，例如液體操作，溫育，混合，應(yīng)用磁力等可以作為儀器的部分，或作為與所述儀器結(jié)合工作的獨 立的組件充分地進行自動控制。
與目前可獲得的分析物檢測技術(shù)，尤其是對生物分析物諸如細胞，微 生物，蛋白質(zhì)和核酸或核酸序列的檢測技術(shù)相比，本發(fā)明具有許多優(yōu)勢。
實施例
實施例l.熒光微球體的檢測
熒光峰的數(shù)量被計數(shù)并且與熒光微球體的濃度相關(guān)。所述微球體的直
徑是約2.5 um并且其具有630/640 nmEx/Em光譜。接著，將在終體積為 4 ml的0.1 M PBS中的包含稀釋的微球體的杯進行同時的垂直和旋轉(zhuǎn)運 動。杯移動的垂直和旋轉(zhuǎn)的速度分別是0.8英寸/sec和300 rpm。在100 kHz 的取樣速率上，在2分鐘的過程中獲得數(shù)據(jù)。如在本申請前面所述對原始 數(shù)據(jù)進行分析和顯示結(jié)果，其對熒光信號的數(shù)量進行計數(shù)，所述熒光信號 的脈沖寬度介于0.05-0.2毫秒之間并且脈沖振幅大于平均值背景加標準偏 差的3倍(平均值+3SD)。
將結(jié)果顯示于圖9中。在不同的日子進行5組不同的實驗。針對熒光 珠的濃度對熒光信號計數(shù)進行繪圖。如在圖9中所顯示，甚至當實驗在不 同的時間和天數(shù)進行時，來自每個濃度的計數(shù)是非常一致的。所述數(shù)據(jù)不 僅顯示在不同實驗時間，方法和實驗進行者之間的固有差異最小，而且它 們還證實本發(fā)明的儀器對熒光信號的檢測能力是一致的和可靠的。在不同 實驗上的這種一致性和可靠性還通過在熒光計數(shù)數(shù)量和珠數(shù)量之間的高 相關(guān)性來顯示，如通過0.9626的高W值所指示。這顯示本發(fā)明的系統(tǒng)能 夠檢測低到10熒光珠/ml以及從10/ml到10Vml的珠濃度的廣泛范圍。在 該濃度范圍內(nèi)， 一致性和高相關(guān)性容許評價消光系數(shù)來對在給定樣品中的 珠的數(shù)量進行計數(shù)。
實施例2在磷酸鹽緩沖液中通過使用與熒光染料綴合的多克隆抗體來檢 測沙門氏菌
將鼠傷寒沙門氏菌(ATCCW4028)在37°C，在5 ml的LB培養(yǎng)基中培 養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物在PBS緩沖液，pH7.0中進行洗滌，并在8,000 Xg離心10分鐘，進行2次。將細胞沉淀物重構(gòu)成其在PBS中的原始濃度。過
夜培養(yǎng)物接近于5xl(^細胞/ml的標準濃度。用O.l MPBS緩沖液稀釋過 夜培養(yǎng)物來制備在總體積為1 ml的PBST(O.l MPBS,0.01%吐溫20)中從 0細胞/ml到10e細胞/ml范圍的濃度。將每種稀釋的培養(yǎng)物的一部分鋪在 鼠傷寒沙門氏菌選擇性瓊脂上并在37'C過夜溫育來證實實際上的菌落形 成單位(CFU)。
在每個樣品中，加入100ul的(約105珠，直徑0.86"111)的用針對沙門
氏菌的多克隆抗體包被的磁性微球體，隨后將其置于室溫30分鐘，伴隨 輕柔的搖動。將所述樣品置于磁性回收器中約3分鐘，將溶液輕輕倒出。 將該步驟重復(fù)2次。重懸最終的沉淀物，并將針對沙門氏菌的與Alexa Fluor 633偶聯(lián)的多克隆抗體(9昭)在總體積為1 ml的PBST中，于室溫溫育30 分鐘。在轉(zhuǎn)移到杯中之前，樣品進行如上所述的相同洗滌步驟。在室溫， 在300 rpm的旋轉(zhuǎn)速度和0.8英寸/sec的垂直速度上進行測量。在100 kHz 的取樣速率上，在30秒過程內(nèi)獲得數(shù)據(jù)。如本申請前面所述來分析原始 數(shù)據(jù)。
將來自一種方法的結(jié)果描繪于圖10中。對于每種樣品，將其脈沖振 幅大于平均值背景+ SD的脈沖振幅的熒光信號計算在內(nèi)。針對CFU/ml， 對每種濃度(從O/ml到106細胞/1111)的熒光信號計數(shù)的平均值進行繪圖(圖 12)。在不同的時間進行13組測定。超過10"細胞/ml的樣品的信號計數(shù)明 顯大于不包含細胞的對照的信號計數(shù)(ANOVApO.Ol)。這顯示當沙門氏菌 物種以1(/細胞/ml或更大濃度存在于生物樣品中時，本發(fā)明的系統(tǒng)能夠在 數(shù)小時內(nèi)，在不需富集的情況下檢測所述沙門氏菌物種。在試劑系統(tǒng)和信 號分析程序得到進一步改善的情況下，靈敏度將增加到102-103細胞/1111濃 度的檢測能力。
實施例3在絞細牛肉中，通過使用與熒光染料綴合的多克隆抗體來檢測沙 門氏菌
通過使用Alexa Fluor綴合的多克隆抗體，在被穿刺(spiked)的絞細牛 肉中檢測鼠傷寒沙門氏菌。將25g的絞細牛肉加入在無菌的細菌分離器袋 中的225 ml的PBST中。在室溫，于280 rpm消化2分鐘后，用在總體積為1 ml的PBST中的鼠傷寒沙門氏菌穿刺牛肉勻漿物的等分試樣。將所述 樣品與磁珠(約105珠，直徑0.86um)—起在室溫溫育IO分鐘，隨后進行 洗滌步驟2次(每次洗滌2分鐘)，所述磁珠用針對沙門氏菌物種的多克隆 抗體包被。用PBST重懸得到的沉淀并將其與綴合于AlexaFluor 633的針 對沙門氏菌的9昭多克隆抗體一起在室溫溫育30分鐘。樣品在被轉(zhuǎn)移到 杯中之前，進行如上所述的相同的洗滌步驟。
在室溫，在300 rpm的杯旋轉(zhuǎn)速度和0.8英寸/sec的垂直速度進行測 量。在lOOkHz的取樣速率，在2分鐘的過程中獲得數(shù)據(jù)。按照在本申請 中前面所述來分析原始數(shù)據(jù)。其對這樣的熒光信號進行計數(shù)，所述熒光信 號的脈沖寬度在0.05-0.2毫秒之間，并且脈沖振幅大于平均值背景+ 3 SD 的脈沖振幅。將每個稀釋的樣品鋪在抗生素選擇的瓊脂培養(yǎng)基上，于37 t:過夜來證實實際上的CFU/ml。整個過程消耗的時間少于1小時。
針對CFU/ml來對來自每個濃度(0/ml到107細胞/ml)的熒光信號計數(shù) 的平均值進行繪圖(圖11)。在不同的時間進行四組測試。觀察到與前面在 磷酸鹽緩沖液中檢測沙門氏菌所顯示的類似的介于熒光信號計數(shù)和 CFU/ml之間的相關(guān)性。超過104細胞/1111的樣品的信號計數(shù)明顯高于對照 的信號計數(shù)。并且，在1(^細胞/ml到1(f細胞/ml的濃度范圍內(nèi)顯示介于 計數(shù)和CFU/ml之間的高度相關(guān)性(R、0.98)。該數(shù)據(jù)清楚地顯示當沙門氏 菌物種以1(^細胞/ml或更大的濃度存在于絞細牛肉中時，我們的系統(tǒng)能夠 在1小時內(nèi)檢測所述沙門氏菌物種。
實施例4.通過在磷酸緩沖液中使用熒光納米球體來檢測沙門氏菌
使用納米等級大小的熒光珠以在磷酸鹽緩沖液中檢測鼠傷寒沙門氏 菌。使用與前面的實施例2中所述的方法類似的方法，除了使用納米球體 的試劑。在每個樣品中，將針對沙門氏菌的3嗎的生物素化的多克隆抗體 與磁珠一起溫育。進行與實施例2相同的溫育和洗滌步驟。重懸最終的沉 淀，并將針對沙門氏菌的納米球體綴合的多克隆抗體在室溫，在總體積為 lml的PBST中的樣品中進行溫育。在被轉(zhuǎn)移到杯中之前，將樣品進行相 同的洗滌步驟。在室溫，在杯的300 rpm的旋轉(zhuǎn)速度和0.8英寸/sec的垂 直速度進行測量。在100 kHz的取樣速率上獲得數(shù)據(jù)，進行30秒。通過本發(fā)明的軟件分析原始數(shù)據(jù)。
將來自功率譜密度(PSD)函數(shù)的結(jié)果顯示在圖12中。在圖12中，將
低頻信號的振幅針對CFU/ml進行繪圖。其顯示，在10Vml樣品的振幅中 的增加與對照的增加相比，非常顯著(ANOVApO.Ol， t-檢驗pO.01)。此夕卜， 在104細胞/1111樣品中沒有觀察到假陰性(數(shù)據(jù)未顯示)。結(jié)果不僅證實我們 的系統(tǒng)能夠在一小時內(nèi)，在不需富集的情況下，檢測在生物樣品中以104 細胞/ml和更大濃度存在的沙門氏菌物種，而且其還顯示我們的系統(tǒng)通過 使用熒光納米球體提高了檢測能力。
實施例5.在純培養(yǎng)物中通過使用熒光珠檢測沙門氏菌物種.
將鼠傷寒沙門氏菌(ATCCW4028)在37°C，在5 ml的LB培養(yǎng)基中培 養(yǎng)過夜。將培養(yǎng)物在PBS緩沖液中進行洗滌，并在8,000 X g離心10分 鐘，進行2次。將細胞沉淀物重構(gòu)成其在PBS中的原始濃度。過夜培養(yǎng)物 接近于5xl(^細胞/ml的濃度。用O.l MPBS緩沖液稀釋過夜培養(yǎng)物來制 備在總體積為1 ml的PBST (0.1 M PBS， 0.01%吐溫20)中的從0細胞/ml 到1()S細胞/ml的濃度范圍。
將在免疫分離(IMS)/熒光微球體方法中所述的每種100u 1的試劑A和 B同時加入等分的細菌樣品中。將所述樣品混合物在室溫溫育30分鐘， 同時伴隨輕柔的搖動以優(yōu)化抗原-抗體反應(yīng)。將所述樣品管置于磁性回收器 中3分鐘，并將溶液輕輕倒出。用lml的PBST重懸得到的沉淀(細菌-試 劑A， B復(fù)合物)并將其轉(zhuǎn)移到杯中。
于室溫，在300 rpm的旋轉(zhuǎn)速度和0.8英寸/sec的垂直速度進行測量。 在100kHz的取樣速率上獲得數(shù)據(jù)，進行2分鐘。通過在前面的部分中描 述的信號計數(shù)方法和加權(quán)信號方法來分析原始數(shù)據(jù)。圖13顯示來自信號 計數(shù)方法(上面的線)和加權(quán)計數(shù)方法(底線)的結(jié)果。將這樣的熒光信號進行 計數(shù)方法和加權(quán)方法，所述熒光信號具有比平均值背景+3SD的振幅更大 的振幅和在0.05-0.2 ms范圍內(nèi)的脈沖寬度。如在圖13中所顯示，與對照(沒 有細胞)相比，超過1(^細胞/ml的樣品的信號計數(shù)和加權(quán)值明顯更高。所 述結(jié)果顯示本發(fā)明能夠在一小時內(nèi)，在不需富集的情況下，檢測在磷酸鹽 緩沖液中以104細胞/ml和更大濃度存在的沙門氏菌物種，實施例6.在食品樣品(絞細牛肉和萵苣)中通過使用熒光珠來檢測沙門氏 菌物種
對于在絞細牛肉樣品中檢測沙門氏菌而言，將io克的絞細牛肉轉(zhuǎn)移 到具有280Pm孔大小的過濾的細菌分離器袋中，隨后加入90 ml的磷酸鹽 緩沖液。在細菌分離器中，以230rpm將樣品勻漿2分鐘，隨后進行低速 離心以去除大的食物顆粒(500x g, 5分鐘)。用UV光照射得到的中層液體 樣品達40分鐘以去除任何土著沙門氏菌或其它細菌。當接種在LB瓊脂(無 抗生素)上時，沒有細菌生長，這證實了這種肉汁樣品中的無菌狀態(tài)。盡管 這不一定意味著所有被照射的可能的土著沙門氏菌都不與抗體試劑反應(yīng)， 如仍舊可以在完整的膜表面上具有表面抗原的那些，但是也沒有指示土著 沙門氏菌存在于絞細牛肉樣品中。用指定數(shù)量的鼠傷寒沙門氏菌穿刺無菌 的肉汁樣品。使用與在前面實施例中所述的在純培養(yǎng)物中使用熒光珠檢測 沙門氏菌物種類似的方法(見實施例5)。
分析原始數(shù)據(jù)，并且顯示這樣的結(jié)果，其對這樣的熒光信號的數(shù)量進 行計數(shù)，所述熒光信號的脈沖寬度介于0.05-0.2 ms之間，并且脈沖振幅大 于平均值背景+3SD的脈沖振幅。在圖14A中，觀察到與前面在磷酸鹽緩 沖液中顯示的類似的介于熒光信號計數(shù)和CFU/ml之間的相關(guān)性。與對照 相比，超過1(^細胞/ml的樣品的信號計數(shù)明顯更高。該數(shù)據(jù)清楚地顯示我 們的系統(tǒng)在1小時內(nèi)，能夠檢測絞細牛肉中以104細胞/1111或更大濃度存在 的沙門氏菌物種。
對于在萵苣樣品中檢測沙門氏菌而言，將10克的萵苣用沙門氏菌進 行穿刺，接著將其轉(zhuǎn)移到具有280 pm孔大小的過濾的細菌分離器袋中， 隨后加入50ml PBS。將所述樣品以230 rpm在細菌分離器中勻漿2分鐘。 用手施加輕柔的力量來擠壓細菌分離器的袋以產(chǎn)生液體樣品。由于萵苣樣 品沒有產(chǎn)生與肉樣品一樣多的食物顆粒，來自細菌分離器袋中的液體沒有 通過離心進一步處理。使用與在前面實施例中所述的在純培養(yǎng)物中使用熒 光珠檢測沙門氏菌物種類似的方法(見實施例5)。分析原始數(shù)據(jù)，并且顯 示這樣的結(jié)果，其對這樣的熒光信號的數(shù)量進行計數(shù)，所述熒光信號的脈 沖寬度介于0.05-0.2 ms之間，并且脈沖振幅大于平均值背景+ 3SD的脈沖
37振幅。如在圖14B中顯示，可在這種實際的食品樣品中獲得104細胞/1111 的低靈敏度水平。
實施例7.檢測BSA
如本發(fā)明的實施例一樣進行牛血清白蛋白(BSA， MW 68kD) (Ambion, TX)的檢測以證實蛋白質(zhì)分子的檢測能力。將修飾的抗-BSA多克隆抗體 (Bi0meda)磁珠(Bang's Labs, IN)和一定量的使用的BSA (10 ng， 1 ng, 0.1 ng，陰性對照)混合在1.5ml的管中到200 pl的體積。在10分鐘溫育后， 用500 的PBST將珠的每個管洗滌1次，接著將其用PBST重懸到100 pl。將預(yù)加溫(37"C)的PBS-T單獨(陰性對照)或預(yù)加溫(37"C)的包含熒光染 料標記的抗-BSA多克隆抗體(9昭)的PBS-T加入到每個管中至最終的測 試體積為200 )il。通過將珠上下吸移數(shù)次進行重懸，接著將測試管在37 。C溫育30分鐘，伴隨旋轉(zhuǎn)。溫育后，將每個管施加于磁體(magnet)3分鐘， 并用500 |il的PBST洗滌兩次，接著將其重懸到lml PBST的最終體積。 分析原始數(shù)據(jù)并且顯示這樣的結(jié)果，其對這樣的熒光信號的數(shù)量進行計 數(shù)，所述熒光信號的脈沖寬度介于0.05-0.2 ms之間，并且脈沖振幅大于平 均值背景+ 3SD的脈沖振幅。如在圖15中所顯示，在1 ml的最終體積中 102-104pg/ml的范圍與熒光計數(shù)相關(guān)，證實了我們的系統(tǒng)在25分鐘的檢測 時間內(nèi)的靈敏度和目前的0.1 ng/ml的檢測局限(LOD)。
盡管已經(jīng)舉例說明和描述了具體的實施方案，在不背離本發(fā)明的精神 的前提下，可作出許多改進，并且保護的范圍僅由后附的權(quán)利要求的范圍 進行限制。參考文獻
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權(quán)利要求
1. 一種用于實時，快速檢測復(fù)合樣品中的目標分析物的方法，其包括(a)在液體介質(zhì)中提供具有第一體積的樣品；(b)從所述樣品中捕獲和分離所述目標分析物；(c)將被捕獲的和分離的目標分析物與用熒光標記物標記的配體混合以形成樣品混合物，其中所述配體能夠結(jié)合于所述目標分析物；(d)在一定的掃描時間段內(nèi)，用激發(fā)光掃描一定體積的樣品混合物，所述激發(fā)光具有能夠激發(fā)所述熒光標記物從所述樣品混合物中發(fā)射發(fā)射光的波長，其中所述掃描對于任何給定體積的樣品混合物都不重復(fù)；(e)在所述掃描時間段內(nèi)將所述發(fā)射光的強度記錄為信號峰的量；和(f)從記錄的信號峰來計算在掃描體積的樣品中的目標分析物的數(shù)量。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中掃描一定體積的樣品混合物通過給所述樣品混 合物同時提供以旋轉(zhuǎn)速度進行的旋轉(zhuǎn)運動和以垂直速度進行的垂直倒轉(zhuǎn) 運動來完成，其中所述旋轉(zhuǎn)速度大于所述垂直速度，并且被掃描的體積與 掃描的時間成比例。
3. 權(quán)利要求2的方法，其中掃描一定體積的樣品混合物通過給所述樣品混 合物提供側(cè)面運動來完成。
4. 權(quán)利要求1的方法，其中用光學(xué)傳感器來記錄所述發(fā)射光的強度，所述 光學(xué)傳感器選自由下列各項組成的組光電倍增管(PMT)，雪崩光電二極 管(ADP)和電荷耦合器件(CCD)。
5. 權(quán)利要求l的方法，其中所述激發(fā)光是由激光器產(chǎn)生的激光束。
6. 權(quán)利要求5的方法，其中所述激光器是發(fā)光二極管(LED)激光器。
7. 權(quán)利要求1的方法，其中所述目標分析物選自由下列各項組成的組細 胞，微生物，細胞器，病毒，蛋白質(zhì)，核酸，核酸序列，朊病毒，和化學(xué)品, 代謝物，或生物標記物。
8. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標分析物是微生物并且所述方法在不經(jīng) 過富集步驟的情況下檢測非常少量的微生物。
9. 權(quán)利要求1的方法，其中所述目標分析物是核酸序列并且所述方法在不經(jīng)過擴增步驟的情況下檢測非常低水平的序列。
10. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標分析物是活細胞或死細胞的DNA 。
11. 權(quán)利要求1的方法，其中所述目標分析物是微生物。
12. 權(quán)利要求11的方法，其中所述微生物是致病性的。
13. 權(quán)利要求1的方法,其中所述目標分析物是食物傳播的病原體。
14. 權(quán)利要求13的方法，其中所述食物傳播的病原體選自由下列各項組成 的組沙門氏菌屬物禾中GSa/mo"e//^/7.)，李斯特氏菌屬物種(IiWen'a ^ .)， 彎曲桿菌屬物種(Ozmpy/oZ^rfe ^.)，葡萄球菌屬物種(Stop/^/ococcw x/ .)， 弧菌屬物種(l^n'o平)，耶爾森氏菌屬物種(l^w'm'a ^ .)，梭菌屬物種 (CVo欣Wwm w.)，芽孢桿菌屬物種CB"c"/w ，)，脂肪酸芽孢桿菌屬物種 04//c_yc/o^c///j w.)，乳桿菌屬物種(Z^ctok "7/w s; .)，氣單胞菌屬物種 04eramo"os s/ .)，志賀氏菌屬物種0S7n'ge〃a取)，鏈球菌屬物種OS^印tococcw W)，大腸桿菌(五.co//)，賈第蟲屬物種(G/aW^ ^J，內(nèi)阿米巴屬物種(五wtomoe^ w.入隱孢子蟲屬物禾中(CV^ to印wWww 入異尖屬物種 "m's^^^.入二葉槽絳蟲屬物種(Z)^/^〃o6oAWwm^ .義侏形吸蟲屬物 禾中(A^"o/ /2>^&" j/ .A真圓線蟲屬物種(J^wsrra"gy/We;y J>，棘阿米巴屬 物種"caW/zamoe6a w.義和蛔蟲屬物種(^scan's 禾Q腸細菌。
15. 權(quán)利要求l的方法，其中所述配體選自由下列各項組成的組單克隆 抗體，多克隆抗體，可溶性受體，寡核苷酸探針和核酸序列。
16. 權(quán)利要求12的方法，其中所述微生物是臨床的病原體。
17. 權(quán)利要求7的方法，其中所述病毒選自由下列各項組成的組 Norovims，輪狀病毒，肝炎病毒，皰疹病毒和HIV病毒和細小病毒。
18. 權(quán)利要求7的方法，其中所述蛋白質(zhì)是毒素。
19. 權(quán)利要求18的方法，其中所述毒素選自由下列各項組成的組黃曲霉 毒素，腸毒素，魚肉中毒，有殼的水生動物毒素，鯖亞目魚中毒，河豚毒， 雙吡咯烷類生物堿，蘑菇毒素，植物凝集素和木藜蘆毒素類。
20. 權(quán)利要求7的方法，其中所述代謝物是蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，糖或肽。
21. 權(quán)利要求l的方法，其中所述樣品選自由下列各項組成的組食品樣 品，臨床的樣品和環(huán)境樣品。
22. 權(quán)利要求1的方法，其中所述檢測選自由下列各項組成的組鑒定、 量化、計數(shù)及其組合。
23. 權(quán)利要求1的方法，其在捕獲和分離所述分析物后還包括通過將所述 樣品重構(gòu)在第二體積中的濃縮步驟，其中所述第二體積少于所述第一體 積。
24. 權(quán)利要求1的方法，其中所述分析物的捕獲和分離通過免疫磁性分離 法來完成，所述方法包括(a) 用配體涂布磁性顆粒來形成配體-磁性顆粒復(fù)合物，其中所述配體能夠 結(jié)合于所述分析物；(b) 在液體介質(zhì)中將所述配體-磁性顆粒復(fù)合物與所述樣品混合來形成在 混懸液中的分析物-配體-磁性顆粒復(fù)合物；和(c) 使所述混懸液經(jīng)受磁力以從液體介質(zhì)中的樣品中分離所述分析物-配 體-磁性顆粒復(fù)合物，隨后去除具有所述樣品的液體介質(zhì)。
25. 權(quán)利要求24的方法，其中所述配體選自由下列各項組成的組單克隆 抗體，多克隆抗體，可溶性受體，寡核苷酸探針和核酸序列。
26. 權(quán)利要求25的方法，其中所述磁性顆粒是珠，微球體，或納米球體。
27. 權(quán)利要求1的方法，其中所述步驟(b)和(c)同時進行。
28. 權(quán)利要求l的方法，其中所述熒光標記物選自由下列各項組成的組熒 光染料，熒光珠，熒光微球體，熒光納米球體，和納米量子點。
29. 權(quán)利要求l的方法，還包括在步驟(c)和步驟(d)之間的洗滌步驟。
30. 權(quán)利要求l的方法，其中所述目標分析物是細胞，并且所述方法檢測 所述樣品中的總的活細胞計數(shù)。
31. —種用于實時，快速檢測液體樣品中的目標分析物的系統(tǒng)，所述系統(tǒng) 包括固定所述液體樣品的樣品固定器；提供激發(fā)光束以激發(fā)所述樣品中的熒光標記物發(fā)射發(fā)射光的光源； 將所述激發(fā)光束聚焦在所述樣品中的物鏡；容許在一定時間段內(nèi)使一定體積的樣品被暴露于所述激發(fā)光束并通 過所述激發(fā)光束進行掃描的構(gòu)件，其中所述暴露和掃描對于任何給定體積 的樣品混合物都不重復(fù)；在所述時間段內(nèi)，記錄所述發(fā)射光的強度的檢測器；和 根據(jù)在所述時間段內(nèi)所記載的發(fā)射光的強度來計算所述樣品中的細 胞或微生物的數(shù)量的構(gòu)件。
32.權(quán)利要求31的系統(tǒng)，其中容許在一定時間段內(nèi)使一定體積的樣品被暴 露并通過所述激發(fā)光束進行掃描的構(gòu)件是同時給所述樣品以旋轉(zhuǎn)速度提 供旋轉(zhuǎn)運動和以垂直速度提供垂直倒轉(zhuǎn)運動的動力裝置，其中所述旋轉(zhuǎn)速 度大于所述垂直速度。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于對廣泛種類的分析物進行實時，快速檢測，鑒定和計數(shù)的系統(tǒng)和方法，所述分析物包括，但不限于，細胞(真核，真細菌，古細菌)，微生物，細胞器，病毒，蛋白質(zhì)(重組或天然蛋白質(zhì))，核酸，朊病毒，和任何化學(xué)品，代謝物或生物標記物。所述系統(tǒng)和方法，包括激光/光學(xué)/電子裝置，分析軟件，測試方法和試劑，和高通量自動控制，特別適合于對被污染的食品，臨床樣品和環(huán)境樣品中的病原體和非病原體進行檢測，鑒定和計數(shù)?？梢杂帽景l(fā)明檢測的其它微生物包括臨床病原體，原生動物和病毒。
文檔編號G06K9/00GK101432739SQ200580032695
公開日2009年5月13日 申請日期2005年7月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月29日
發(fā)明者樸浩申, 趙益魯, 金明立 申請人:金實驗室公司