專利名稱：：光學(xué)微層析成像的焦平面跟蹤的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明通常涉及光學(xué)層析(OT)成像系統(tǒng)，且更具體地，涉及微觀光學(xué)層析成像，其中諸如生物細胞的小型對象被電磁頻譜的可見光或紫外光部分中的光束照射、旋轉(zhuǎn)并跟蹤，以及產(chǎn)生投影圖像。
背景技術(shù)：
：作為參考結(jié)合于此的Fauver等人的于2004年4月22日公開的專利申請US-2004-0076319-A1公開了一種用于在單個檢測器曝光期間穿過試料(specimen)的厚度沿著垂直于焦平面的軸線連續(xù)掃描光學(xué)成像系統(tǒng)的焦平面的方法和設(shè)備。這樣的一個方法可以通過移動物鏡來實現(xiàn)，由此穿過試料區(qū)域的厚度掃描焦平面，使得在單個檢測器曝光間隔期間連續(xù)掃描整個試料厚度。因此生成分辨率可以取決于移動焦平面的焦點深度和側(cè)面空間分辨率(即，焦平面內(nèi)的分辨率)的偽投影圖像。同時使用一對或多對光源和檢測器陣列，從在達到180度的弧線上的幾個視角(perspective)重復(fù)該過程。試料可以被旋轉(zhuǎn)和/或平移以獲得另外的視點。以這種方式，可以產(chǎn)生一組偽投影，所述偽投影可以輸入到例如為濾波背投影的層析成像重建算法以生成三維圖像。已知技術(shù)對放置在旋轉(zhuǎn)毛細管中心的試料起到很好的效果，這是因為在旋轉(zhuǎn)期間試料不會從初始焦平面移開。但是，許多試料被放置為偏離中心，且會被從初始焦平面移開。這種偏移位置能夠?qū)е露ń蛊畈υ嚵系脑诤蟪上瘾@取重建帶來不利影響。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種用于在光學(xué)層析成像系統(tǒng)中跟蹤對象的方法，其中該對象被包含在具有旋轉(zhuǎn)中心的管中，該對象具有質(zhì)心(centroid)，且該對象偏離旋轉(zhuǎn)中心。在對象旋轉(zhuǎn)時，通過穿過擴展的景深(depthoffield)掃描該對象來獲得圖像數(shù)據(jù)。根據(jù)圖像數(shù)據(jù)來計算對象質(zhì)心距離旋轉(zhuǎn)中心的距離8值。根據(jù)獲得的圖像數(shù)據(jù)來計算旋轉(zhuǎn)角值。通過將被掃描的擴展的景深限制到小于或等于對象廣度(extent)來確定對象廣度，由此提高得到的偽投影圖像中的圖像分辨率。本發(fā)明通常涉及使用激光器或其它照射系統(tǒng)結(jié)合CCD或CMOS檢測器產(chǎn)生的平行光束投影的三維光學(xué)層析成像，且更具體地，涉及流體中的或夾帶在剛性介質(zhì)中包括生物細胞的微觀對象的三維層析成像。結(jié)合在說明書中并構(gòu)成說明書一部分的附圖示出了本發(fā)明的一些方面，且與說明書一起用于解釋本發(fā)明的原理。而且，在附圖中，相同的參考數(shù)字表示若干視圖中的對應(yīng)部分。在附圖中圖1示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的平行光束流光學(xué)層析成像系統(tǒng)的示例性圖示；圖2示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明實施方式的可變運動平行光束光學(xué)層析成像系統(tǒng)的示例性圖示；圖3示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明一個示例性實施方式的系統(tǒng)照明幾何結(jié)構(gòu)的示例性圖示，包括單個源放大凹面光學(xué)鏡對；圖4示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明替換實施方式的系統(tǒng)照明幾何結(jié)構(gòu)的示例性圖示，包括單個源放大凸面光學(xué)鏡對；圖4A示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明另一個可替換實施方式的系統(tǒng)照明幾何結(jié)構(gòu)的另一個示例性圖示，包括單個源放大凸面光學(xué)鏡對；圖5示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的具有多個源放大凹面光學(xué)鏡對的照明幾何結(jié)構(gòu)和成像樣本體積的示例性圖示；圖5A示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的具有多個源放大凸面光學(xué)鏡對的照明幾何結(jié)構(gòu)和成像樣本體積的另一個示例性圖示；圖6是根據(jù)本發(fā)明的實施方式的重建圓柱體的示例性圖示的高度示意圖7示意性顯示了用于說明根據(jù)本發(fā)明的實施方式的TDI圖像傳感器的操作的示例性流程圖8示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的平行射線光束光源系統(tǒng)的示例性圖示；圖9示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的圍繞流管的重建圓柱體的示例，該流管包含諸如細胞的流動對象；圖10示意性顯示了包括沿著Z軸排列的一連串部分圓周的重建圓柱體的示例，該Z軸穿過包含管的物體，其中每一個部分圓周可以包含多個源檢測器對；圖11示意性顯示了本發(fā)明的系統(tǒng)和方法的另一個示例性實施方式，其中至少一個用于檢查的試料被處理以移除非診斷元素并根據(jù)本發(fā)明的實施方式被固定并染色；圖12A和圖12B示意性顯示了分別具有平行光束照明和非平行光束照明的微毛細管304的端視圖13示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方式的用于描述管中對象的布局(placement)的跟蹤參數(shù)的示例性說明；圖14示意性顯示了用于描述R，e的錯誤標識的圖中的偏差的示例性說明，所述錯誤標識導(dǎo)致感興趣對象的焦平面的誤標識；圖15示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明另一個可替換實施方式的表示在Rtt和e上的F所有偏差相關(guān)的輪廓圖16示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的分割感興趣對象并針對與感興趣對象的偽投影圖像PPO相關(guān)聯(lián)的灰度像素來計算質(zhì)心的圖17示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的質(zhì)心的X分量從偽投影到偽投影的趨勢的圖形描述；圖18顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的測量Xm與建模的Xm之間的緊密對應(yīng)；圖19示意性顯示了用于說明本發(fā)明的方法的焦點跟蹤框圖操作的示例性流程圖20示意性顯示了在旋轉(zhuǎn)期間的毛細管；圖21的a，b以及c顯示了在光學(xué)層析成像顯微鏡中的在成像期間的單扁平細胞的圖像。具體實施例方式如附圖中所示出的，對本發(fā)明的描述做出詳細參考。雖然本發(fā)明結(jié)合這些附圖來描述，但是并不打算將其限制于實施方式或這里公開的實施方式，而是打算涵蓋包括在所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明的實質(zhì)和范圍中的所有替換實施方式、修改以及對等物。這里在涉及生物細胞的特定示例方面對本發(fā)明做出進一步描述。但是應(yīng)當理解，這里的示例用于說明本發(fā)明的原理，本發(fā)明并不受此局限。在一個實例中，在微觀體積中構(gòu)造光密度的三維分布能夠量化并確定感興趣的結(jié)構(gòu)、分子或分子探測器的位置。通過使用標記的分子探測器，可以測量貼附于微觀對象中的特定結(jié)構(gòu)上的探測器的數(shù)量。處于說明的目的，諸如生物細胞的對象可以被貼上至少一個染色的或標記的分子探測器，并且所測量的該探測器的量和位置可以產(chǎn)生關(guān)于細胞病態(tài)的重要信息，包括但不限于諸如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宮頸癌以及卵巢癌等各種癌癥。當在光學(xué)微觀過程環(huán)境中使用時，這里常用的以下術(shù)語具有以下含義"毛細管"具有其通常接受的意思，并被規(guī)定為包括內(nèi)徑為100微米或更小的微毛細管或等同物。這樣的毛細管由美國亞利桑那州美國玻利米柯技術(shù)公司(PolymicroTechnologies,LLC.,AZ)制造。"對象"表示單體細胞或其它實體。一個或多個對象可以包括試料。"偽投影"包括表述采樣廣度體積大于光學(xué)鏡的固有景深的單個圖像。"試料"意思是從個體患者的單個測試或過程中獲得的完全的產(chǎn)物，(例如，提交的用于分析的唾液、組織檢査或鼻腔藥棉)。試料可以由一個或多個對象組成。試料診斷的結(jié)果成為病癥診斷的一部分。"樣本"表示即將用于分析的已完成的細胞制備，包括所有或部分試樣(aliquot)或試料。在本發(fā)明的一個示例中，選擇的照明直到通過對象體積之前是平行或近似平行的，該對象體積可以包含將被成像的細胞或其它試料或?qū)ο?。在通過對象之后，后置試料光學(xué)鏡發(fā)散光強度的自然發(fā)生的(emergent)圖案以在垂直于系統(tǒng)的光軸的任何平面產(chǎn)生光強度的放大的圖案并位于后置試料光學(xué)鏡的下游。但是，本發(fā)明不限于平行光束照射，且實際上，這里描述的實施方式對各種波長的多種照射形式都是有用的。參考圖1，示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的實施方式的平行光束流光學(xué)層析成像(PBOT)系統(tǒng)的示例性說明。本發(fā)明提供一種用于對流體或夾帶在剛性介質(zhì)中的小型對象進行成像的設(shè)備和方法，該設(shè)備和方法使用點光源或平行光束投影、圖像傳感器(例如時延積分(TDI)圖像傳感器或CCD或CMOS固態(tài)圖像傳感器等)、以及層析成像圖像重建。在一個示例性實施方式中，光學(xué)層析成像(OT)系統(tǒng)包括流體血細胞計數(shù)器，例如包括重建圓柱體12，該重建圓柱體12圍繞包含管2的物體。根據(jù)光學(xué)層析成像系統(tǒng)的類型，包含管2的物體，例如可以包括細胞夾帶管(其中細胞被保持在膠中)或用于細胞流動的毛細管。PBOT系統(tǒng)4參照坐標系統(tǒng)40被定位，該坐標系統(tǒng)40具有X，Y和Z方向上的坐標。在操作中，感興趣對象l，例如細胞，例如包括人體細胞，被注入到注射管3中。包含管2的物體在注射端5變得更寬并且包括壓力蓋6。鞘液體7在管8處被引入以在包含管2的物體中產(chǎn)生層流。第一光子源9a和第一光檢測器10a與脈沖高度分析器11一起工作以用作觸發(fā)裝置。脈沖高度分析器11用以在例如細胞的對象移動通過管時提供用于該對象的開端或前沿的第一信號30a以及用于該對象的末端或后沿的第二信號30b。在脈沖高度分析器ll中，信號30a、30b、31a以及31b被表示為光強度"I"相對于"TIME(時間)"函數(shù)。脈沖高度分析器11可以是常規(guī)設(shè)計的電子電路等。脈沖高度分析器11產(chǎn)生多個信號14，信號14被發(fā)送到計算機13，在與移動的對象的速度和光檢測器與重建圓柱體12之間的距離相關(guān)的延遲之后，計算機13在線15上發(fā)送觸發(fā)信號到重建圓柱體12，以啟動和終止特定感興趣對象的數(shù)據(jù)收集。此外，第二光子源9b和第二光檢測器10b可以方便地被設(shè)置在距離第一組光子源和光檢測器下游的已知距離，由此對象觸發(fā)第三信號31a和觸發(fā)第四信號31b之間的間隔可以方便地用于計算對象的速度以及用作同步TDI圖像傳感器線傳輸速率的定時信號。定時信號在多個信號14中被傳送到計算機13。可以是任何有用的個人計算機或等同物的計算機13在線16上依次發(fā)送同步信號到重建圓柱體12。應(yīng)當理解，線15和線16表示PBOT系統(tǒng)與計算機之間的通信和控制線，用于在計算機與PBOT系統(tǒng)之間傳輸數(shù)據(jù)、圖像信息、控制信號以及其它信號。以這種方式，例如對象沿著流動軸20的運動可以由電荷從TDI傳感器的一個階段到另一個階段的傳輸速率來匹配，這在以下參考圖7更詳細地描述和顯示?，F(xiàn)在參考圖2，圖2示意性顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方式的可變運動平行光束光學(xué)層析成像系統(tǒng)的示例性圖示。可變運動PBOT系統(tǒng)100利用機械定位器一次將一個夾帶在管中的剛性介質(zhì)中的細胞提供給成像系統(tǒng)。與參考圖l描述的流系統(tǒng)相比，在可變運動PBOT系統(tǒng)100中，只需要一個包括光子源9和光檢測器10的觸發(fā)機構(gòu)，這是因為諸如人體細胞的13對象的速度可以被精確控制以在重建圓柱體12中將光源與圖像傳感器同步。這里觸發(fā)由脈沖高度分析器11和計算機13進行處理并用于啟動和停止數(shù)據(jù)收集。除了需要更少的輸入和輸出之外，脈沖高度分析器11是與脈沖高度分析器11類似的電子電路設(shè)計。如雙箭頭線表示的，在該實施方式中包含管2的物體通過計算機控制的電機17驅(qū)動的螺桿傳動18沿著穿過重建圓柱體12的Z軸平移。包含在管2中的對象還可以通過計算機控制的電機17在Z軸周圍旋轉(zhuǎn)。計算機控制的電機17從計算機13接收控制信息19。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解，只要具有這里公開的益處，能夠平移并旋轉(zhuǎn)包含管2的物體的任何機構(gòu)都能被用以替代螺桿傳動。使用圖像處理、圖像分析和/或計算機層析成像圖像重建技術(shù)可以直接分析或處理來自重建圓柱體12的信號，以提供關(guān)于細胞和其它感興趣對象的二維或三維信息?，F(xiàn)在參考圖3，圖3示意性顯示了用于對感興趣對象1進行成像的平行光束光學(xué)層析成像系統(tǒng)中使用的重建圓柱體12A中的系統(tǒng)照明幾何結(jié)構(gòu)。重建圓柱體12A包括平行射線光束照射源35，用于以多個平行射線光束36照射感興趣對象l。外管32具有光平輸入面60和凹面輸出面29,其中凹面外表面29發(fā)散在穿過感興趣對象1之后從外管32出來的射線61。包含管2的物體位于外管32內(nèi)，其中感興趣對象1被保持在包含管2的物體內(nèi)。這里以雙箭頭示意性表示的電機34被耦合以旋轉(zhuǎn)包含管2的物體，從而提供感興趣對象1的不同視圖。檢測器陣列39被設(shè)置以接收來自凹面輸出面29的射線61。在一個實施方式中，平行射線光束照射源35包括激光器。在另一個示例性實施方式中，可以選擇激光器以在電磁頻譜的可見光部分中發(fā)射射線。在再一個示例性實施方式中，可以選擇激光器以在電磁頻譜的紫外線部分中發(fā)射射線。檢測器陣列39可以有利地包括從組中選擇的傳感器，該組由固態(tài)傳感器、電荷耦合裝置(CCD)傳感器、互補金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)傳感器以及時延積分傳感器組成。在本發(fā)明的另一個實施方式中，被成像的細胞或其它對象被提供在流動管、毛細管、線形容器或夾帶管中。在平行光束光學(xué)層析成像系統(tǒng)的一個實施方式中，感興趣對象1包括具有細胞核30的人體細胞。該細胞還可以包含亞細胞特征或成分。至少一個發(fā)熒光或吸收分子探測器31可被限定為一個或多個細胞成分。包含管2的物體，例如流動管、毛細管、線形管或夾帶管位于外管32內(nèi)，基本與該外管32是同心圓，該外管32具有基本是矩形的外橫截面，且可以具有矩形或圓形的內(nèi)橫截面。外管32也可能有其它橫截面幾何形狀。包含管2的物體的彎曲表面作為柱面透鏡，會帶來投影系統(tǒng)中可能不想要的聚焦效應(yīng)。具有本公開的益處后，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解如果光源與外管32之間的空間37和管32與檢測器表面39之間的空間33被填充了具有折射指數(shù)與包含管2的物體的折射指數(shù)匹配的材料，則基本可以減少包含管2的物體造成的光子的偏移。此外，管可以光耦合到空間填充材料。這種光耦合可以用例如油或膠來完成?？臻g33中折射指數(shù)匹配的液體，例如油，可以通過端口38方便地被引入以完全填充包含細胞或其它微觀對象的管2與外管32之間的空間。折射指數(shù)匹配的液體、管2和32以及任意膠或圍繞將被成像的細胞的流動液體介質(zhì)具有相同的或近似相同的折射指數(shù)。包含在管2內(nèi)的對象可以在計算機控制下在具有軸向運動和轉(zhuǎn)動的折射指數(shù)匹配的液體和外管32內(nèi)被旋轉(zhuǎn)和/或平移。在操作中，激光器或其它光源35產(chǎn)生平行照射光束36，該光束36撞擊在外管32上，可選地由空間37中的折射指數(shù)匹配的耦合元素傳遞。在沒有散射的情況下，光經(jīng)過穿過管2和32的平行光徑。由于光徑中所有材料的折射指數(shù)都是匹配的，因此經(jīng)過折射指數(shù)匹配的液體和要被成像的體積中的對象空間的光線是平行的。管2和32都包括關(guān)于照明波長的透明或幾乎透明的材料。管2和32都可以包括熔融石英、玻璃或其它類似的光學(xué)材料。15矩形外管32的出口面29可以方便地被設(shè)置具有分散或放大光學(xué)鏡，在一個預(yù)期的實施方式中，該光學(xué)鏡可以是在熔融石英或其它光學(xué)材料中的圓形對稱磨光的凹進或凹陷。該凹陷用作平凹透鏡，使光線路徑61在其出口面29變得分散。這樣的凹陷或任何其它的光學(xué)元件或光學(xué)元件的組合包括多重態(tài)或其它等效元件，被設(shè)計成執(zhí)行相同功能，在這里被稱為后置試料光學(xué)鏡。后置試料光學(xué)鏡通常包括放大光學(xué)鏡。使用已知光學(xué)設(shè)計原理，后置試料光學(xué)鏡的曲率半徑可以被確定并被設(shè)計成給予離開的光線路徑61期望的離散度。離散度和后置試料光學(xué)鏡與TDI、CCD、CMOS或其它圖像傳感器39之間的距離共同確定投影圖像的放大倍數(shù)。所需的放大倍數(shù)由期望的投影圖像的空間分辨率與檢測器像素大小之間的關(guān)系來確定，且放大倍數(shù)最好是遠大于像素大小與期望的投影空間分辨率的商的兩倍。例如，在本發(fā)明的一個預(yù)期的實施方式中，如果投影中的期望的空間分辨率是0.5微米而檢測器像素大小是10微米，則放大倍數(shù)最好是明顯大于40倍。在該示例中，令人滿意的放大倍數(shù)是80倍、IOO倍或者甚至更大。對于本發(fā)明的預(yù)期的實施方式，其中后置試料光學(xué)鏡是外管32的出口面29上的圓形對稱磨光凹陷，且其中該后置試料光學(xué)鏡用作平凹面分散透鏡，該透鏡的前焦平面在無限遠處。不存在后焦平面。因此，放大的投影圖像、偽投影圖像或包含關(guān)于在光穿過要被成像的細胞或其它對象1時光的吸收的信息的影像圖可以通過在TDI、CCD或CMOS檢測器或其它數(shù)字成像檢測器39上獲取出來的發(fā)射的光強度的圖案來產(chǎn)生。檢測器的光轉(zhuǎn)換面可以位于垂直于系統(tǒng)的光軸的任何平面且在后置試料光學(xué)鏡的下游。此外，通過檢測器平面的放置可以選擇放大倍數(shù)在對象下游的檢測器平面離對象越遠，放大倍數(shù)越大。在本發(fā)明的實施方式中，例如圖3和4示意性描繪的，具有單個源-檢測器對，通過從不同視角獲得圖像來執(zhí)行細胞或其它微觀對象的二維或三維層析成像。在獲得在關(guān)于光軸的第一旋轉(zhuǎn)角保持靜止的包含管2的物體的第一投影后，該包含管2的物體可以關(guān)于軸以不連續(xù)的角度被旋轉(zhuǎn)，如雙箭頭34所示。有用的軸被標識為圖2中的Z軸，和/或在圖3和圖4中指向紙夕卜，即垂直于系統(tǒng)的光軸以在關(guān)于光軸的第二旋轉(zhuǎn)角定位細胞或其它對象1。隨后發(fā)射的投影圖像可以在旋轉(zhuǎn)包含管2的物體之后獲得。隨著包含管2的物體以不連續(xù)遞增重復(fù)旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)和成像過程可以重復(fù)進行。在每一個角可以記錄二維投影圖像，直到獲得足夠數(shù)量的投影以產(chǎn)生細胞或其它對象1或它們的部分的三維圖像，或產(chǎn)生描繪在成像對象內(nèi)部的吸收圖案薄片的二維圖像。通過用己知三維圖像重建算法對多個二維投影圖像進行圖像處理來產(chǎn)生三維重建。通過處理從多個投影中提取的數(shù)據(jù)行來產(chǎn)生穿過成像對象的橫向薄片的二維圖像，其中這些數(shù)據(jù)行被定向為與如圖l和圖2中描繪的X軸和Y軸的旋轉(zhuǎn)形式平行。數(shù)據(jù)行通常被稱為檢測器數(shù)據(jù)行。相對于圓錐光束幾何形狀，本發(fā)明描述的方法的一個優(yōu)點是能夠根據(jù)檢測到的投影數(shù)據(jù)行來重建穿過細胞或其它對象的軸向切面(transaxial)薄片，其中許多檢測器數(shù)據(jù)行對通過對象空間的每一個橫向圖像平面起作用。現(xiàn)在參考圖4，圖4示意性顯示了本發(fā)明預(yù)期的重建圓柱體12B中的系統(tǒng)照明幾何形狀的替換實施方式，其中要被成像的細胞或其它對象1被提供在流管或夾帶管2中。重建圓柱體12B包括采用多個平行射線光束36來照射感興趣對象1的平行射線光束照射源35。外管32A具有光平輸入面60和凸面輸出面28，其中凸面外表面28聚集在穿過感興趣對象1之后從外管32出來的射線。如在關(guān)于圖3描述的上述實施方式中，包含管2的物體位于外管32A內(nèi)，其中感興趣對象1被保持在包含管2的物體內(nèi)或流過包含管2的物體。以雙箭頭示意性表示的電機34可以方便地被耦合以旋轉(zhuǎn)和/或平移17包含管2的物體，以提供感興趣對象1的不同視圖。小孔光圈127被設(shè)置在凸透鏡的焦點128處并用于產(chǎn)生出來的射線125的錐形光束。如上所述，檢測器陣列39被設(shè)置以從小孔127接收出來的射線125的錐形光束。在一個示例性實施方式中，外管32A可以有利地具有端口38且圍繞包含管2的物體的空間33填充有液體，例如具有與外管32A和包含管2的物體相同的折射指數(shù)的油。現(xiàn)在參考圖4A，圖4A示意性顯示了本發(fā)明預(yù)期的重建圓柱體12D內(nèi)的系統(tǒng)照明幾何結(jié)構(gòu)的另一個替換實施方式，其中要被成像的細胞或其它對象1可以被提供在流管或夾帶管2中。重建圓柱體12D包括關(guān)于圖4的上述實施方式中的所有元件，還包括光學(xué)元件126。該光學(xué)元件126可以有利地包括位于小孔光圈127與傳感器陣列39之間的平凹光學(xué)鏡或其它分散或放大光學(xué)鏡。如圖4所示，小孔光圈127位于凸透鏡28的焦點128處，并被放置成產(chǎn)生出來的射線125的錐形光束。出來的射線125由平凹光學(xué)元件126接收，由此進一步被分散成射線光束225。如上所述，檢測器陣列39被放置成從小孔光圈127接收出來的射線225的錐形光束。圖5示意性顯示了本發(fā)明另一個實施方式預(yù)期的具有多個源-放大凹形光學(xué)鏡對的照明幾何結(jié)構(gòu)和成像樣本體積的示例性圖示。用于對感興趣對象1進行成像的平行光束光學(xué)層析成像系統(tǒng)通常包括上述參考圖3的照明幾何結(jié)構(gòu)和用于照射感興趣對象1的多個平行射線光束照射源l-N35，其中N至少為2。多個平行射線光束照射源1-N35的每一個在關(guān)于感興趣對象1的不同視角產(chǎn)生多個平行射線光束。多個平行射線光束照射源l-N35的每一個可以是單個光源，例如激光器，或至少一個激光器，其光穿過一個或多個光纖或光纖束，如以下關(guān)于圖8所描述的。外管41具有多個光平輸入面63和多個對應(yīng)的凹形輸出面65，其中多個對應(yīng)的凹形輸出面65使在穿過感興趣對象1之后從外管41出來的光線分散，由此產(chǎn)生感興趣對象1的放大的投影圖像?？商鎿Q地，如以上關(guān)于圖3所述的，后置試料光學(xué)鏡可以包括任何放大光學(xué)元件或元件的組合，包括多重透鏡或其它等同物。在這里所述的其它示例中，包含管2的物體位于外管41內(nèi)，其中感興趣對象1保持在包含管2的物體內(nèi)，且多個檢測器陣列l(wèi)-N39被放置成接收出來的射線36E。多個檢測器陣列1-N39中的每一個被設(shè)置成從多個凹形輸出面65中的一個或多個接收出來的射線36E。圖5A示意性顯示了本發(fā)明實施方式預(yù)期的具有多個源-放大凸形光學(xué)鏡對的照明幾何結(jié)構(gòu)和成像的樣本體積的另一個示例性圖示。圖5A被構(gòu)造成與圖5基本相似，不同之處在于外管51A具有多個光平輸入面66和多個對應(yīng)的凸形輸出面67，其中多個對應(yīng)的凸形輸出面67聚集在穿過感興趣對象1后從外管41A出來的射線68。包含管2的物體位于外管41A內(nèi)，其中感興趣對象1保持在包含管2的物體內(nèi)。多個小孔光圈127位于凸形輸出面67的各個焦點69處，其中多個小孔光圈127中的每一個從多個對應(yīng)的凸形輸出面67中的一個接收射線以產(chǎn)生出去的錐形光束70。多個檢測器陣列l(wèi)-N39被放置成接收錐形光束70。多個檢測器陣列l(wèi)-N39中的每一個如上所述的被構(gòu)建且被放置成從多個小孔光圈127中的一個或多個接收出來的射線。參考圖6，圖6顯示了本發(fā)明實施方式預(yù)期的重建圓柱體12C的有用設(shè)計。這里，一圈點光源27在包含管2的物體周圍被放置且一圈圖像傳感器25被設(shè)置成位于包含點光源27的平面的上方、其上或下方的平面中。雖然在圖示中只示出了四個點光源和四個傳感器，但是應(yīng)當理解一圈光源和一圈圖像傳感器可以有利地包括更多數(shù)量，以足夠進行成像對象的層析成像重建。圖像傳感器可以位于點光源的平面的下方、上方或之中。通過在分開的平面上放置點光源27和圖像傳感器25，圓柱體相對側(cè)上的點光源不會在物理位置上干擾其它照射光束。每一個點光源可以方便地產(chǎn)生平行射線光束135，如以上參考圖3、4、4A、5和5A所述的，該平行射線光束135在穿過成像對象后被放大。在移動穿過重建圓柱體的過程中，細胞1經(jīng)過至少一個光子點光源。本發(fā)明的關(guān)鍵特征是多個具有可選擇波長的光子點光源27圍繞包含管的物體放置并與該物體共圓心。光子點光源與相對的CCD、CMOS、TDI或其它圖像傳感器25結(jié)合操作，這些圖像傳感器25對光譜的可選擇部分敏感，由此允許獲取穿過細胞1發(fā)射的光的投影。以這種方式，可以產(chǎn)生一組投影射線135，該投影射線可以被描述為連接光源點和單個傳感元件的直線。沿著特定投影射線離開光源點的光子數(shù)量與在特定傳感元件處接收到的光子數(shù)量之間的差與丟失或削弱的光子數(shù)量有關(guān)，該丟失或削弱是由于與沿著投影射線路徑的包含管2的物體中的細胞和其它物質(zhì)的互相作用而造成的。但是，光散射、光子能量變化、有缺陷的幾何結(jié)構(gòu)和較差的準直可能導(dǎo)致復(fù)雜情況，且當多個光源點被同時激發(fā)時，來自不同光源的光子可以到達特定的傳感元件。隨著小心構(gòu)建重建圓柱體，例如通過為點光源圖形明智選擇如上所述的幾何形狀以及其相對的檢測器，并通過適當定時或復(fù)用多個點光源的激活和傳感器陣列的讀出，可以最小化由這些問題導(dǎo)致的光子污染。通過系統(tǒng)校準可以部分解決光子污染，例如沒有細胞出現(xiàn)。即，可以輪流點亮每一個光源且可以測量光源對每一個傳感器的影響，由此提供偏差數(shù)據(jù)以用于標準化系統(tǒng)。附加的校準步驟可能需要例如，成像乳膠聚合物小球或其它微球體或扁圓球狀體，其光學(xué)特性是已知的且遍布細胞成像的感興趣密度范圍。現(xiàn)在參考圖7，圖7示意性顯示了說明TDI圖像傳感器的操作的流程圖50的示例。對應(yīng)于細胞圖像單元的電荷被往下傳輸?shù)脚c圖像同步的TDI傳感器的一列像素單元。電荷傳輸按順序發(fā)生，直到從列中積累的電荷在傳感器26的底部寄存器處被讀出。在本發(fā)明預(yù)期的光學(xué)層析成像系統(tǒng)的一個實施方式中，多個TDI傳感器25被定向，由此每個傳感器具有線傳輸方向52，該方向52與沿著Z軸的細胞運動方向20平行。通過來自計算機13的定時信號或時鐘信號，TDI圖像傳感器線傳輸速率與細胞的速度同步。圖7的流程圖顯示了運動的細胞1以及其沿著時間線1334在不同時刻關(guān)于TDI傳感器25的位置。在時刻=0，細胞1只在TDI傳感器25的上方且沒有感測到圖像。在時刻=1，細胞1被TDI傳感器25部分成像。細胞l的影像圖51—次被成像一條線。從時刻=0到時刻=5，對應(yīng)于每條圖像線的電荷22被傳輸?shù)絺鞲衅飨袼貑卧?3的下一條線，該像素單元23與TDI圖像傳感器下的圖像線的運動同步。以這種方式，對應(yīng)于每一個像素的電荷在TDI傳感器25的每一個列24下被積累直到在時刻=5在底部寄存器26處被讀出。TDI傳感器被定向使得線傳輸方向52與沿著Z軸的細胞運動方向20平行。TDI圖像傳感器線傳輸速率與細胞速度同步。根據(jù)TDI圖像傳感器中的線數(shù)量或階數(shù)，額外的光生電荷被積累且信號被增強(例如達到96層(fold)96階的TDI傳感器，例如DalsaIL-E2傳感器)。光源現(xiàn)在參考圖8，圖8示意性顯示了本發(fā)明實施方式預(yù)期的平行射線光束光源的示例性圖示。在該示例中，平行射線光束光源包括與光纖110耦合的激光器105。光纖110可以包括單獨的光纖或光纖束或等同物。在操作中，多個光纖110接收激光束107并將平行射線光束36傳送到環(huán)繞流管或毛細管的光源位置。以這種方式，通過將來自單個激光器的光束通過多個光纖以為所述光束規(guī)定路線，可以減少如以上參考圖5和圖5A描述的多個光源系統(tǒng)所需的激光器數(shù)量?？梢栽诠饫w110的輸入端或輸出端或這兩端結(jié)合諸如透鏡和/或鏡子的光學(xué)元件。在操作中，每一個激光束的直徑可以大約為半個到幾個毫米，允許單個激光器耦合每一個激光光源外的具有大約30微米到100微米的幵口的多個光纖。每一個光源可以具有相同的一般特性，優(yōu)選地光源可以近似小圓形點光源；光源可以是激光器、激光二極管或發(fā)光二極管；光源可以具有己知頻譜容量的亮度；*從光源發(fā)射出的光子可以形成已知幾何形狀的光束，例如所有的光子射線都平行的線束(pencil)光束；每一個光源為一個投影角度產(chǎn)生數(shù)據(jù)。在一個示例數(shù)據(jù)收集幾何結(jié)構(gòu)中，沿著軸是包含管的物體的中心軸的螺旋線排列的多個光源在細胞移動穿過模塊時從多個投影角度產(chǎn)生數(shù)據(jù)。根據(jù)傳感器的幾何結(jié)構(gòu)，一些點光源以不同的角度在相同的圓周周圍被放置，由此投影不會在傳感器處重疊。期望的光源數(shù)量是每一個平面重建(x-y平面)或立體重建中所需分辨率的函數(shù)。此外，通過使用不同的二極管或其它激光器或通過對白光源或其它寬帶光源、例如汞或氙弧燈進行帶通濾波，可以選擇光源的波長?？梢允褂靡恍┻x項來產(chǎn)生光源點，例如激光器或激光二極管；激光器-光纖束組合；激光器前的窗孔或其它高強度光子源；在小孔的入口側(cè)和出口側(cè)使用光子的表面等離子體振子聚焦的窗孔；具有小橫截面的光纖；來自光子源前面的短焦距透鏡的虛擬點光源；*照射無機發(fā)光材料(phosphor)表面上的點的電子束(CRT形式)；以及上述各種組合。使用分散光束的幾何結(jié)構(gòu)，點光源離感興趣對象1(例如細胞)越近，放大倍數(shù)越大，這是因為對象離光源越近，該對象對著的幾何角度越寬。在簡單的投影系統(tǒng)中，放大倍數(shù)近似為1VN(A+B)/A，其中A是點光源與對象(細胞)之間的距離，而B是對象與檢測器之間的距離。反過來，如果預(yù)先知道系統(tǒng)設(shè)計需要的分辨率，則可以為該特定分辨率優(yōu)化幾何結(jié)構(gòu)。作為背景，本領(lǐng)域技術(shù)人員被引向主編為Blass,M.的HandbookofOptics:FiberOpticsandNonlinearOptics(第二版，巻IV，麥格勞'希爾出版公司，2001)?，F(xiàn)在參考圖9，圖9示意性顯示了本發(fā)明實施方式預(yù)期的圍繞包含諸如細胞的流動對象1的流管2的重建圓柱體12E的示例。重建圓柱體12E包括例如，包括多個平行射線光束源72的螺旋線70，該平行射線光束源72被放置在預(yù)定的螺旋狀的坑中。傳感元件39被放置成在光線穿過細胞或其它感興趣對象1并被后置試料光學(xué)元件放大之后從點光源接收該光線，如以上參考圖3、4、4A、5和5A所述的。雖然多個平行射線光束源72的排列是螺旋狀的，但是本發(fā)明預(yù)期的重建圓柱體中使用的平行射線光束源陣列可以采取很寬種類的幾何圖案，這部分取決于電子器件的速度、細胞速度以及在傳感器(檢測器)實現(xiàn)無重疊投影信號的幾何結(jié)構(gòu)。例如，參考圖10，圖10顯示了包括一系列部分圓周74的重建圓柱體12F，該圓周74沿著穿過包含管2的物體的Z軸排列，其中每一個部分圓周74可以包含多個源-檢測器對。固定光學(xué)點光源72結(jié)合圍繞管的圓周安裝的與該點光源72相對的檢測器39可以在細胞流過光源時采樣穿過整個細胞的多個投影角。通過對光源和發(fā)射或削弱傳輸?shù)暮?或分散的和/或發(fā)射的光的發(fā)射或讀出進行定時或?qū)ζ浒l(fā)射和讀出兩者都進行定時，每一個檢測到的信號與在流動細胞的Z方向上沿著軸的特定已知位置相符。以這種方式，以己知速度沿著垂直于光源(該光源被引起發(fā)射或以同步方式被檢測)的已知軸流動的細胞可以從光學(xué)上被分割成穿過該細胞的投影，該投影可以被重建以形成x-y平面上的2D薄片。通過堆疊或從數(shù)學(xué)上組合連續(xù)的薄片，該細胞的3D圖片會出現(xiàn)。還有可能結(jié)合細胞運動和圍繞流動軸的光源(或多個光源)的定位來生成可以例如以螺旋狀方式重建的數(shù)據(jù)，從而產(chǎn)生細胞的3D圖片。通過堆疊從線形(1D)投影中重建的連續(xù)的平面圖像或直接根據(jù)平面(2D)投影可以完成三維重建。細胞的3D圖片可以產(chǎn)生亞細胞結(jié)構(gòu)和位置以及標記的分子探測器的數(shù)量的定量測量，從而提供診斷信息。焦平面和對象跟蹤這里描述的本發(fā)明可以進一步地預(yù)期對感興趣對象進行成像的光學(xué)層析成像系統(tǒng)。光學(xué)層析成像系統(tǒng)包括光源，該光源用于以多個射線光束照射感興趣對象；包含管的物體，其中感興趣對象保持在包含管的物體內(nèi)，由此該感興趣對象被多個射線光束照射以產(chǎn)生從包含管的物體出去的射線。檢測器被設(shè)置成接收出來的射線并產(chǎn)生成像數(shù)據(jù)。用于跟蹤感興趣對象的裝置被耦合以接收并響應(yīng)該成像數(shù)據(jù)。感興趣對象的圖像可以包括投影圖像或偽投影圖像。通常通過從沿著光軸被整合(integrate)的一連串焦平面中整合一連串圖像來產(chǎn)生偽投影圖像。焦平面優(yōu)選地被背對背排列。這里描述的跟蹤裝置可以包括用于跟蹤偽投影圖像中心的裝置、用于跟蹤投影圖像中心的裝置或用于跟蹤焦平面的裝置?，F(xiàn)在參考圖11，圖11顯示了本發(fā)明的影像圖光學(xué)層析成像系統(tǒng)的另一個示例性實施方式，其中至少一個用于檢查的試料301(例如細胞或多個細胞)被處理以移除非診斷單元，并且被固定并染色。試料301然后被懸浮在膠狀介質(zhì)302中。膠混合物中的細胞接著被插入到內(nèi)徑約為40微米-60微米的玻璃微毛細管304中。在一個實施方式中，對膠施加壓力以將試料301移動到高倍顯微鏡(這里由物鏡306表示)的光路徑中。在替換實施方式中，管可以相對于該物鏡平移，而試料相對于管保持靜止。一旦試料位于合適的位置，管304被旋轉(zhuǎn)以允許獲取在管旋轉(zhuǎn)的預(yù)定范圍內(nèi)取得的期望對象的多個高分辨率圖像。在一個有用的實施方式中，在180度的管旋轉(zhuǎn)范圍內(nèi)獲得大約250個圖像。當沿著光軸整合時，圖像形成偽投影圖像。通常使用濾波的背投影來處理圖像以產(chǎn)生試料的3D層析成像描述?；趯游龀上裰亟?，特征可以被計算并用于檢測具有癌癥特性和癌癥先兆特性的細胞。這些特征被用在分類器中，分類器的輸出表示受調(diào)査對象是癌癥細胞的可能性。在其它事物之間，高質(zhì)量重建和分類取決于在步驟三中采取的對所有圖像的良好定焦。本發(fā)明提供一種用于建立對此處所述的處理過程期間取得的所有偽投影的良好定焦的方法?，F(xiàn)在參考圖12A和圖12B，分別顯示了以平行光束照射和非平行光束照射的微毛細管304的端視圖。在任一種情況下，為了將光離開感興趣對象(例如試料301)之后的光衍射最小化，最好是轉(zhuǎn)動管，由此最小化對象與物鏡之間的距離，該物鏡在圖像獲取周期期間被整合。因此圖像獲取必須在感興趣對象、試料301處在位于零軸310內(nèi)的位置P1時開始，其中零軸310與物鏡306的光軸交叉，優(yōu)選地與物鏡306的光軸垂直。感興趣對象然后如表示移動路徑312的虛線所示的旋轉(zhuǎn)，在位置P2停止。注意的是這樣做系統(tǒng)的焦點平面(planeoffocus)必須改變以對應(yīng)于移動路徑312。在一個有用的實施方式中，焦點跟蹤系統(tǒng)被結(jié)合到本發(fā)明光學(xué)層析成像系統(tǒng)和方法，并操作以在對象中心對準零軸310時觸發(fā)偽投影圖像的獲取。焦點跟蹤系統(tǒng)還操作以調(diào)節(jié)焦點，使得該焦點跟蹤系統(tǒng)在圍繞管旋轉(zhuǎn)時跟蹤對象中心。注意這里描述的跟蹤系統(tǒng)可以在光學(xué)層析成像系統(tǒng)中使用，該光學(xué)層析成像系統(tǒng)使用任何合適形式的照明或光學(xué)器件，包括平行光束照明或光學(xué)器件、扇形光束、點光源以及其它本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的等效光源。25現(xiàn)在參考圖13，圖13示意性顯示了描述管中的對象的位置的跟蹤參數(shù),包括R—管中心到對象中心的半徑；e—西塔，在開始圖像獲取時測量的對象相對于0度軸的角位移或者角偏差值(圖像獲取最優(yōu)選地在e為o時開始，因此在圖像獲取開始時的任何其它值是角偏差的指示)?，F(xiàn)在參考圖i4，圖中示意性圖示了偏差，特點是R，e的錯誤標識導(dǎo)致感興趣對象的焦點平面的誤標識。由于對象在圓形路徑上運動，因此在R正確標識到對象中心且在對象中心對準零軸時應(yīng)當開始圖像獲取。當對象被認為定位在零軸上但實際與零軸有為e的偏移時，偏差就會產(chǎn)生。如果e不為零(0)，則對象真正的移動路徑314與假定的移動路徑316之間有差別。在這種情況下，所示的關(guān)系I^R真cos(e)也會把R的值估低。雖然在圖像獲取開始時對象處于焦點中，但是如果隨著對象旋轉(zhuǎn)過180°而沒有對e偏移做出調(diào)節(jié)，則增加的偏差會在對象中心與跟蹤系統(tǒng)指派的焦平面之間擴大。用于對象的焦點平面F可以被建模為等式lF-F管中心-R真cos(0)sin(nPP/249)，其中PP是圖像編號PP=0、1、2、…、249。當R是真實值(Rk)且6=0時，該路徑對應(yīng)于對象的真實并期望的路徑。該軌跡可以在等式2中被建模為等式2F真F管中心-R真sin(nPP/249)使用等式1和2，焦點中的偏差F偏差可以被建模為(F-F真)的差。等式3F偏差R真sin(JiPP/249)(l-cos(e))通過對所有PP整合等式3，可以發(fā)現(xiàn)用于評估焦點偏差的總的嚴重性的度量。等式4卩所有偏差=(2:rt*Rx/249)*(l畫cos(0))設(shè)R真/R管-R比，該等式的后半部分(secondhalf)被描述為-30°《6《30°且0《Rtt《0.8的輪廓圖。這在圖15中被描述且給出了在R比和e上F所有偏差關(guān)系曲線的含義。注意到出于該示例的目的，249表示獲得了250個偽投影圖像的情況。如果獲得不同數(shù)量的偽投影圖像，則常數(shù)249必須做相應(yīng)調(diào)整。通過視覺檢查的R，e的估計是偏差傾向工作，因為在觀察到可感知的對象移動之前需要相當大的e偏差。另一方面，在e不確定的情況下要確定到真實的對象中心的距離是很難的。因此本發(fā)明的目標是提供一種方法用于1.估計R，以及2.建立觸發(fā)圖像獲取的方法，由此在對象中心經(jīng)過零軸310時采集數(shù)據(jù)?，F(xiàn)在參考圖16，圖16顯示了分割感興趣對象并針對與感興趣對象的偽投影圖像PP0相關(guān)聯(lián)的灰度像素來計算質(zhì)心的圖。估計R首先要做的事是找到對象質(zhì)心。這可以通過分割感興趣對象并用與感興趣對象相關(guān)聯(lián)的灰度像素來計算質(zhì)心。1.閾值通過找到方框區(qū)域320中平均亮度等級來找到偽投影PP0的閾值。2.連通分量算法被應(yīng)用到閾值圖像332以分割所有非零像素都連通的對象。該過程產(chǎn)生標記的圖像324。注意的是外來的非連通特征，例如特征323，通過閾值和連通分量算法基本被移除和/或變黑(darkened)。3.基于識別感興趣對象中的像素325而選擇對應(yīng)于感興趣對象的分量。4.對象326的選擇產(chǎn)生掩模，該掩模之后被應(yīng)用到原始灰度值圖像。通過基于逆轉(zhuǎn)的灰度值計算質(zhì)心Cm來找到對象中心。在一個示例性實施方式中，通過使用包括第一75個像素的方框區(qū)域從左上角向下移動75個像素再移動到相對邊來測量平均亮度等級從而確定平均亮度等級。閾值被設(shè)定在方框區(qū)域中像素平均灰度值的85%左右。當然本發(fā)明不受此限制且本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用等效的閾值設(shè)定方法。選擇感興趣對象的步驟可以基于用戶輸入，例如，用戶激活計算機顯示器屏幕上的像素或自動具有圖形識別算法或等效軟件算法。一旦感興趣對象在獲得第一個偽投影期間被選擇，則通過毛細管的窗口325可以被建立，其中窗口做得比感興趣對象更大以提供整個對象的視圖，但不是包含不感興趣信息的圖像的一部分。這樣，在之后的圖像獲取期間，只需要通過窗口觀察對象并可以跳過選擇步驟?，F(xiàn)在參考圖17，圖17顯示了質(zhì)心的X分量從偽投影到偽投影的趨勢的曲線描述。根據(jù)上述的方法可以找到單個偽投影圖像的質(zhì)心。在開始圖像獲取的時候，通過分析質(zhì)心的X分量Xm從偽投影到偽投影的趨勢來計算對象的R和e。由于對象運動路徑是圓形的，因此當該運動從物鏡視角觀察時，旋轉(zhuǎn)的對象中心的移動可以由余弦函數(shù)來描述。Xm趨勢數(shù)據(jù)可以被建模為X'm:等式5<formula>formulaseeoriginaldocumentpage28</formula>在等式5中，該模型的參數(shù)的特性如表1所示。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表l:模型參數(shù)描述焦點跟蹤參數(shù)解決方案根據(jù)以下等式，對所有的250個偽投影通過最小化Xm與X'm之間的RMS偏差可以解決表l中的參數(shù)。等式6偏差二VE(Xm-X'm)2/250在等式6中，粗體字Xm用于表示所有PP上的Xm的集合。對于圖17的情況，進行產(chǎn)生以下模型參數(shù)的探究。圖18顯示了測量的Xm與建模的X"之間的緊密對應(yīng)。<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表2:模型參數(shù)值對于該解決方案，可以得到3.35e-3的總RMS偏差。注意的是參數(shù)B和c可以在等式中去掉(或設(shè)為o)而基本不影響結(jié)果。因此，本發(fā)明的方法的有用的實施可以在不考慮參數(shù)B和C的情況下執(zhí)行。焦點跟蹤實施現(xiàn)在參考圖19，圖19顯示了本發(fā)明的方法的焦點跟蹤框圖。之前部分的分析顯示了通過用等式5的模型配備用于Xm的測量值可以估計用于合適焦點跟蹤的參數(shù)而具有較小的偏差。在本發(fā)明預(yù)期的光學(xué)層析成像系統(tǒng)中，當期望的對象進入視線時，需要找到R并估計該對象中心何時經(jīng)過零軸，由此可以開始用于重建的圖像獲取。在對象被識別以獲取后收集一組k個圖像，ppl-ppk，其中k可以是對重建3D圖像有用的任意圖像數(shù)量。該組k個圖像被收集以具有R的初始估計。在對象以任何特定方式被放置時不需要收集該組k個圖像，因為該組k個圖像將被用于估計R的真實值并建立觸發(fā)點，該觸發(fā)點收集將用于重建的偽投影圖像。在步驟332，為偽投影ppl-ppk中的對象找到X分量Xm,、Xm2、Xm3、...Xmk的質(zhì)心值，且記錄每一個圖像的收集時刻tl、t2、t3、...tk。在步驟334，計算tk時刻的R和6值。在步驟338，基于該數(shù)據(jù)以及用于PP收集的時鐘336估計0的實時值。在步驟340，檢測該值與值0的近似性。在步驟350，當6在下一個時鐘周期被預(yù)期為0時，激活用于獲取250個偽投影集的觸發(fā)。通過比較值《與標準，可以檢查控制器旋轉(zhuǎn)微毛細管的合適的功能?！冻^該標準會啟動服務(wù)呼叫并使數(shù)據(jù)被丟棄。參數(shù)A給出了微毛細管中心的平均偏差。該值可以與為其制定的規(guī)格相比較。超過該規(guī)格的A值會停止數(shù)據(jù)收集并警告用戶該管需要重新回到中心位置。現(xiàn)在參考圖20，圖20示意性顯示了用于圖示本發(fā)明另一個實施方式的旋轉(zhuǎn)期間的毛細管。該毛細管410具有直徑為d的內(nèi)壁412和旋轉(zhuǎn)中心422，該旋轉(zhuǎn)中心422是該毛細管的中心。說包括對象414的試料通過基本填滿毛細管410的合適的膠416或等效物質(zhì)被保持在相對于毛細管內(nèi)壁412的位置。物鏡420被設(shè)置以觀察對象414。雖然不限于此，但是對象414可以包括例如生物試料，該生物試料包括細胞或更具體地包括細胞內(nèi)的感興趣結(jié)構(gòu)，例如用吸收性染料染色的細胞核。在多個位置Po、Pn、P90以及P哪顯示了對象414，其中多個位置中的每一個位置示出了在毛細管410旋轉(zhuǎn)期間在不同時刻的位置。例如，位置Po表示對象414的質(zhì)心與將毛細管一分為二的焦平面重合的位置。焦平面F0可以有利地位于垂直于物鏡420的光軸的平面中。相反地，位置P9。位于沿著物鏡420的光軸或與焦平面Fo成90。角的平面中。Fo與Fn之間的距離h在90°時最大，等于值a。位置Pn對應(yīng)于與焦平面Fo成角度A的位置。只顯示了毛細管的內(nèi)壁。試料的路徑取決于其到旋轉(zhuǎn)中心422的距離。在本發(fā)明用于調(diào)節(jié)焦平面跟蹤的過程的一個有用的示例性實施方式中，焦點首先被設(shè)定在Fo，通過定焦在內(nèi)管壁上在管壁離得最遠的截面(section)處可以得到該FQ。用于確定Fo的可選方法是在內(nèi)管壁處找到光反差反向零交叉。最優(yōu)的焦點可以通過操作者通過透鏡觀察得到，或更優(yōu)選地，通過機器視覺算法在由計算機控制調(diào)節(jié)焦點時定位圖像內(nèi)的最清晰的邊緣來得到。然后管旋轉(zhuǎn)427直到試料位于離中心422的最大距離且處于與管壁在最寬間隔處的相同的焦平面Fo中。感興趣結(jié)構(gòu)的質(zhì)心被設(shè)置并以光標來標記或使用標準機器視覺算法來標記。使用可用機器視覺工具來測量質(zhì)心到旋轉(zhuǎn)中心的距離。有用的機器視覺工具可以根據(jù)語言來構(gòu)建，該語言例如是美國德克薩斯州奧斯汀美國國家儀器有限公司(NationalInstrumentsofAustin,TX)的LabviewTM軟件。測量的距離值用于使用等式Fn=Fc+(asin(AJ)以對應(yīng)的旋轉(zhuǎn)角(A)來計算焦平面(hn)的改變。然后hn被轉(zhuǎn)換成信號，該信號被發(fā)送到壓電物鏡定位器421，該壓電物鏡定位器421根據(jù)試料的平移的質(zhì)心以正弦函數(shù)來移動物鏡。例如，如果a被測量為10um，則旋轉(zhuǎn)1°，試料就遠離焦平面0.174um。在90°，F(xiàn)n距離Fo為10um，而在180°，F(xiàn)。和Fn相同?，F(xiàn)在參考圖21a，b和c，其中顯示了在光學(xué)投影層析成像顯微鏡中成像期間單個扁平細胞的圖像。細胞包括細胞核""c，m^在毛細管壁vv內(nèi)被細胞質(zhì)c^圍繞。圖21a顯示了在起始位置的細胞，其中細胞旋轉(zhuǎn)到該細胞的細胞核離管中心的距離最大時的位置。圖21b顯示了旋轉(zhuǎn)90。后的細胞。細胞核現(xiàn)在出現(xiàn)在管的中心。圖21c顯示的細胞的細胞核的位置在180°旋轉(zhuǎn)循環(huán)的末端。在圖21a至圖21c中，管壁tw被顯示為在細胞之上以及之下的水平線。虛線表示毛細管的中心(t^管壁，cyt-細胞質(zhì)，mu^細胞核)。測試焦平面跟蹤的方法是將對象414放在起始位置PQ。對質(zhì)心415進行標記，然后旋轉(zhuǎn)試料直到該試料被精確定位在兩個管壁的中間，而沒有改變焦點。在一種實施中，在毛細管開始旋轉(zhuǎn)之前就開始數(shù)據(jù)獲取。一旦旋轉(zhuǎn)管，對象應(yīng)當在旋轉(zhuǎn)循環(huán)的中間時刻到達焦點。如果獲得偽投影，則對象應(yīng)當在250個偽投影的編號為125的偽投影時刻到達焦點。在旋轉(zhuǎn)期間諸如對象運動方向和對象速度的變量也可以幫助確定對象半徑和角度。一般來說，通過單個曝光期間在照相機上掃描物鏡獲得的諸如偽投影的擴展的景深圖像可以被用于產(chǎn)生圖像，這是因為不需要對象位置的先驗知識。圖像的最大景深為管的內(nèi)徑。由于過度掃描常常導(dǎo)致擴展的景深圖像中的分辨率和對比度的丟失，因此最好是優(yōu)化景深擴展使得在不需要明顯過度掃描的情況下包含對象?？梢酝ㄟ^測量對象的廣度來確定優(yōu)化的景深擴展。然后對象的廣度可以用于最小化掃描范圍以產(chǎn)生擴展的景深偽投影圖像。使用在對象跟蹤校準期間獲得的圖像數(shù)據(jù)(或如果需要可以獲得另外的圖像數(shù)據(jù))，可以確定對象廣度。通過沿著垂直于管軸的方向在至少兩個角度確定對象的廣度，可以找到最小掃描范圍。選擇的兩個視角必須相差90度。例如，通過在O度位置找到對象廣度，可以通過將對象旋轉(zhuǎn)到90度位置來找到最小掃描范圍。同樣地，通過在對象處于90度位置時測量對象廣度，可以在O和180度確定最小掃描范圍。除了通過90度的最小旋轉(zhuǎn)采集多個圖像來確定最大對象廣度，在第一旋轉(zhuǎn)角度e和第二旋轉(zhuǎn)角度e+90°可以采取對象廣度的兩個擴展景深測量，并且對象廣度的最差情況值可以根據(jù)以下關(guān)系來計算對象—廣度((廣度》2+(廣度一。)2)。減小物鏡掃描范圍可能需要為用于3D重建的偽投影中的校準精確性或?qū)Ρ榷缺４嫣嵘龍D像質(zhì)量。在這種情況下，掃描范圍被細分為多個部分，以及獲得的多個擴展的景深圖像。在本發(fā)明的方法的另一個實施方式中，控制信號根據(jù)對象的平移的質(zhì)心以正弦曲線方式(sinusoidally)移動物鏡。管具有旋轉(zhuǎn)循環(huán)，距離值和一組角度值可以用于計算物鏡位置的成比例的正弦函數(shù)。該正弦函數(shù)具有與旋轉(zhuǎn)循環(huán)成比例的波長。在本發(fā)明的方法的另一個實施方式中，產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)的對象的投影圖像的步驟包括在層析成像重建期間將投影圖像集中在重建圓周內(nèi)。正弦函數(shù)可以由例如正弦函數(shù)的導(dǎo)數(shù)的另外的函數(shù)來調(diào)整，以進一步控制物鏡的掃描從而形成偽投影。使用諸如導(dǎo)數(shù)的輔助函數(shù)，用于在旋轉(zhuǎn)期間更精確地保存所產(chǎn)生的感興趣對象、細胞、結(jié)構(gòu)或其它項的圖像中的更高空間頻率和圖像對比度。本發(fā)明的方法的其它變形通常識別出焦平面運動可能不等于物鏡的運動。更具體地，是與光學(xué)投影層析成像有關(guān)的穿過對象的焦平面的運動。在一個示例性變形中，由于成像偏差可能是第一階球面像差引起的，因此如上所述的基礎(chǔ)正弦波函數(shù)焦平面調(diào)節(jié)被預(yù)先扭曲以具有預(yù)先補償值，以在整個視區(qū)將軸移動校正在最佳焦點。在另一個示例中，調(diào)節(jié)焦平面的預(yù)先補償査找表通過使用位于視區(qū)的不同區(qū)域的隔離的微球體來執(zhí)行。在另一個示例中，使用特定毛細管夾層的預(yù)先補償校準在掃描每一個樣本之前被執(zhí)行。在又一個示例中，在管旋轉(zhuǎn)時而不是使用夾層中靜止的管來解決管的偏心率時執(zhí)行調(diào)節(jié)焦平面的預(yù)先補償。在另一個示例中，焦平面是用于在細胞旋轉(zhuǎn)時膠的厚度變化的預(yù)先補償。這里以相當多的細節(jié)描述了本發(fā)明以符合專利法規(guī)并給本領(lǐng)域技術(shù)人員提供應(yīng)用本發(fā)明新穎的原理所需的信息，并構(gòu)建并使用所需的示例性及專用的部分。然而應(yīng)當理解的是可以通過特定的不同設(shè)備來執(zhí)行本發(fā)明，且裝置和重建算法以及對設(shè)備細節(jié)和操作過程的各種修改可以在不脫離本發(fā)明正確的精神和范圍的情況下實現(xiàn)。權(quán)利要求1、一種用于在光學(xué)層析成像系統(tǒng)中跟蹤對象(414)的方法，其中所述對象(414)被包含在具有旋轉(zhuǎn)中心(422)的管(410)中，所述對象(414)具有質(zhì)心(415)，且所述對象(414)偏離所述旋轉(zhuǎn)中心，該方法包括以下步驟通過在所述對象(414)旋轉(zhuǎn)時穿過擴展的景深掃描所述對象(414)來獲得圖像數(shù)據(jù)；計算所述對象(414)的質(zhì)心(415)離所述旋轉(zhuǎn)中心的距離值，其中所述距離值是根據(jù)所獲得的圖像數(shù)據(jù)來計算的；計算在所選擇的位置(Pn)中的所述對象(414)的旋轉(zhuǎn)角度值(βn)，其中所述旋轉(zhuǎn)角度值(βn)是根據(jù)所獲得的圖像數(shù)據(jù)來計算的；確定所述對象(414)的廣度；以及將被掃描的擴展的景深限定為小于或等于所述對象(414)的廣度，從而提高產(chǎn)生的偽投影圖像中的圖像分辨率。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中獲得圖像數(shù)據(jù)的步驟包括將物鏡(420)定焦在焦平面(Fn)上，所述方法還包括將所述距離值和一組旋轉(zhuǎn)角度值(A)轉(zhuǎn)換成用于控制所述物鏡(420)的平移的控制信號以使得所述焦平面跟蹤所述對象(414)的中心的步驟。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中確定所述對象(414)的廣度的步驟根據(jù)以下關(guān)系來計算o一"—ex&"=J((e;Ce""+(exfe""Q0。))oZy'e"—表示所述對象(414)的廣度;"^70表示在選擇的旋轉(zhuǎn)角e處得到的所述對象(414)的廣度的第一測量結(jié)果；以及ex&""+,表示在選擇的旋轉(zhuǎn)角9+90°處得到的所述對象(414)的廣度的第二測量結(jié)果。4、根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述物鏡(420)根據(jù)所述對象(414)的平移的質(zhì)心(415)而以正弦曲線方式移動。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋轉(zhuǎn)循環(huán)，且所述距離值和一組角度值用于計算物鏡(420)位置的正弦函數(shù)，該正弦函數(shù)具有與所述旋轉(zhuǎn)循環(huán)成比例的波長。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中通過附加函數(shù)來調(diào)節(jié)所述正弦函數(shù)以控制所述物鏡(420)的掃描，從而形成偽投影。7、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括產(chǎn)生旋轉(zhuǎn)的對象(414)的投影圖像的步驟。8、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在旋轉(zhuǎn)期間在所述對象(414)內(nèi)的至少一個結(jié)構(gòu)的所產(chǎn)生的圖像中保持更高的空間頻率和圖像對比度。9、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括以下步驟在一組視角處掃描所述對象(414)的至少一個特征，以產(chǎn)生一組圖像;根據(jù)所述一組圖像來確定存在0度視角，在該0度視角處所述至少一個特征在離管軸最大距離處被測量；以及相對于所確定的0度視角校準偽投影系統(tǒng)。10、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述管(410)包括管軸，所述方法還包括以下步驟在一組視角處掃描所述對象(414)的至少一個特征，以產(chǎn)生一組圖像;根據(jù)所述一組圖像來確定90度位置(P9o)，在該90度位置(P卯)所述至少一個特征出現(xiàn)在所述管(410)中間的第一圖像中且與所述物鏡(420)最接近；對應(yīng)于將所述管(410)旋轉(zhuǎn)90度以返回到0度位置，選擇第二圖像；測量所述第二圖像來得到對象離所述管軸的距離以確定半徑；以及相對于所確定的0度位置校準偽投影系統(tǒng)。11、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括以下步驟在一組視角處掃描所述對象(414)的至少一個特征，以產(chǎn)生一組圖像；根據(jù)所述一組圖像，針對對應(yīng)于所述一組視角的圖像測量所述至少一個特征離管軸的距離；以及針對所述一組視角中的至少一個視角，計算適合找到半徑和角度的余弦函數(shù)。12、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，該方法還包括以下步驟獲得圖像并將所述對象(414)的至少一個特征定位在所述管(410)中初始定位的位置；測量所述至少一個特征離管軸的距離；沿著物鏡(420)的光軸掃描該物鏡(420)，以找到所述至少一個特征的深度；以及根據(jù)所述距離和深度測量結(jié)果來確定所述至少一個特征的半徑和角度。13、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有內(nèi)管壁(412)，所述方法還包括以下步驟通過定焦在所述內(nèi)管壁(412)上截面處來將焦點設(shè)定在初始焦平面(Fo)，在所述截面處所述初始焦平面位于穿過管(410)的中心軸橫切所述管(410)的平面上；旋轉(zhuǎn)所述管(410)直到具有質(zhì)心(415)的感興趣結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)接近所述內(nèi)管壁(412)中的一個；標記所述感興趣結(jié)構(gòu)的質(zhì)心(415);測量所述質(zhì)心(415)到所述旋轉(zhuǎn)中心的距離(a);根據(jù)等式FfF寸(asin(々))在每一個旋轉(zhuǎn)角(/)計算焦平面的改變(hn);以及將hn轉(zhuǎn)換成傳送到物鏡定位器(421)的信號，該物鏡定位器(421)根據(jù)所述感興趣結(jié)構(gòu)的平移的質(zhì)心(415)來以正弦函數(shù)形式移動所述物鏡。14、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋轉(zhuǎn)循環(huán)，且所述距離值和一組角度值用于計算物鏡(420)位置的正弦函數(shù)，所述正弦函數(shù)具有與所述旋轉(zhuǎn)循環(huán)成比例的波長，且其中所述正弦函數(shù)以預(yù)先補償值被預(yù)先扭曲，以在整個視區(qū)將軸移動校正在最佳焦點。15、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋轉(zhuǎn)循環(huán)，且所述距離值與一組角度值用于計算物鏡(420)位置的正弦函數(shù)，所述正弦函數(shù)具有與所述旋轉(zhuǎn)循環(huán)成比例的波長，且其中使用位于視區(qū)的不同區(qū)域的隔離的微球體來校準用于調(diào)節(jié)所述正弦函數(shù)的預(yù)先補償查找表。16、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋轉(zhuǎn)循環(huán)，且所述距離值與一組角度值用于計算物鏡(420)位置的正弦函數(shù)，所述正弦函數(shù)具有與所述旋轉(zhuǎn)循環(huán)成比例的波長，且其中在掃描每一個樣本之前執(zhí)行使用特定毛細管夾層的預(yù)先補償校準。17、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋轉(zhuǎn)循環(huán)，且所述距離值與一組角度值用于計算物鏡(420)位置的正弦函數(shù)，所述正弦函數(shù)具有與所述旋轉(zhuǎn)循環(huán)成比例的波長，且其中在所述管(410)旋轉(zhuǎn)時執(zhí)行用于調(diào)節(jié)所述正弦函數(shù)的預(yù)先補償。18、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述管(410)具有旋轉(zhuǎn)循環(huán)，且所述距離值與一組角度值用于計算物鏡(420)位置的正弦函數(shù)，所述正弦函數(shù)具有與所述旋轉(zhuǎn)循環(huán)成比例的波長，且其中所述正弦函數(shù)是在所述管(410)旋轉(zhuǎn)期間用于膠的厚度變化的預(yù)先補償。全文摘要一種用于在光學(xué)層析成像系統(tǒng)中跟蹤對象(414)的方法，其中該對象(414)被包含在具有旋轉(zhuǎn)中心(422)的管(410)中，該對象(414)具有質(zhì)心(415)，且該對象(414)偏離所述旋轉(zhuǎn)中心。通過在所述對象(414)旋轉(zhuǎn)時穿過擴展的景深掃描對象(414)來獲得圖像數(shù)據(jù)。根據(jù)圖像數(shù)據(jù)來計算所述對象(414)的質(zhì)心(415)離所述旋轉(zhuǎn)中心的距離值，根據(jù)所獲得的圖像數(shù)據(jù)來計算旋轉(zhuǎn)角度值(βR)。確定所述對象(414)的廣度，將被掃描的擴展的景深限定為小于或等于所述對象(414)的廣度，從而提高產(chǎn)生的偽投影圖像中的圖像分辨率。文檔編號G06K9/00GK101536016SQ200780041453公開日2009年9月16日申請日期2007年9月11日優(yōu)先權(quán)日2006年9月18日發(fā)明者A·C·尼爾森,E·J·賽貝爾,M·E·福韋,M·G·梅耶爾,R·H·約翰遜,R·J·拉恩,T·諾伊曼申請人:華盛頓大學(xué)