專利名稱：：動植物描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)的制備方法及其用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，特別涉及一種動植物(物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株)描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)的制備方法，以及該分子條碼系統(tǒng)的用途。
背景技術：
：對農作物品種進行有效鑒定和甄別，在哪個時期也沒變得像今天這樣重要。這除了傳統(tǒng)的農作物種類繁多，品種資源十分豐富的原因以外，還由下列諸多因素引起。首先，隨著農業(yè)生產的發(fā)展，在育種成效愈來愈大的同時，許多種類的遺傳基礎卻變得越來越狹窄。其次，出于制種技術和經營利潤的原因，目前市場上存在很多偽劣品種，包括純度低的雜交種和以次充好、冒充良種的滯銷積壓品種等。第三，用市場占有率較高優(yōu)良雜交種進行分離提純，非法經營偷盜品種等不良現象也屢見不鮮等。同時，出于一些品種很難用肉眼識別，同物異名、同名異物現象又普遍存在以及商業(yè)品種間的遺傳相似性高等原因，使得品種甄別也變的越來越困難。分子生物學理論和技術的迅速發(fā)展，為物種鑒別提供了愈加直接和精確的方法。最大的貢獻來自于加拿大科學家Herbert提出的DNA條碼。他利用線粒體基因，細胞色素C亞基I的一段長度約為600堿基對的序列作為DNA"條碼"去區(qū)分動物物種。但該片段不適合用于植物物種的區(qū)分，因為相對于動物基因組，植物基因組結構變化更快并且具有更低的突變率。因此，用植物基因組中的哪一段DNA序列或哪幾段DNA序列作為區(qū)分植物物種的候選序列至今還存在廣泛的爭議，例如使用細胞質中matK編碼區(qū)序列、rbcL編碼區(qū)序列、trnH和psbA基因間的非編碼序列、還是使用rbcL編碼區(qū)序列和trnH與psbA基因間的非編碼序列組合等類似多片段組合都還未達成一致。無論是對動物還是植物，DNA條碼研究最大的挑戰(zhàn)都是該方法能否區(qū)分近緣或近期分化的物種。然而，生產實踐中，我們需要區(qū)分很多具有相近遺傳關系的品種。例如，世界各地廣泛種植的十字花科蕓薹種中有蕪菁、日本水菜、中國白菜等亞種，其中中國白菜亞種又包括普通白菜、塌菜、菜心、紫菜薹、分蘗菜、薹菜等變種，而每個變種下面還有變型之分，商品化品種更不計其數，應用現有的植物分類中DNA條碼系統(tǒng)來區(qū)分如此近緣的類群顯得無能為力。因此，為了能有效地對亞種、變種、品種或個體進行描述和甄別，需要更多的基因組水平的信息，此時常規(guī)分子標記信息量大的優(yōu)勢就顯現出來了，例如限制性片段長度多態(tài)(RFLP)，隨機擴增多態(tài)DNA(RAPD)，短串聯(lián)重復序列(SSR)，擴增片段長度多態(tài)(AFLP)等分子標記。分子標記雖然也被用于生物進化與系統(tǒng)發(fā)育及動植物分類等方面的研究，但目前所用的分子標記種類單一，個數也不多，因此只能局限在某一類群少數物種的分類或品種的甄別上，而尚未廣泛用于較大范圍的動植物分類和甄別。并且，大多數分子標記區(qū)分物種的缺陷是用于數據分析的都是定性數據，使用的標記種類及數目沒有一套標準，無法為研究者對新物種、近緣或近期分化的品種分類或甄別提供直接可用并可共享的數據信息，因此也就未被研究者列入上述區(qū)分物種的DNA"條碼"的范疇。實際上，目前公認的DNA條碼是基于DNA序列特征的一段堿基序列，并非真正意義上的由多個元素構成的可掃描的條碼。鑒于現有的DNA條碼在鑒別物種尤其是近緣物種中的局限性，有必要建立一套新的可普遍采用的鑒別親緣關系較近的物種的、實現真正意義上可讀的分子條碼，為生物群體甚至個體，尤其是栽培作物以及家養(yǎng)動物的品種鑒定、甄別、標識和審定，以及新品種權保護等建立一套統(tǒng)一、穩(wěn)定的、可普遍采用且分子標記結果可共享和更新的技術體系。主要參考文獻HebertPDN，RatnasinghamS，deWaardJR(2003)Barcodinganimallife:cytochromecoxidasesubunit1divergencesamongcloselyrelatedspecies.ProcRSocLondBBiolSci270:S596_S599.(HebertPDN，RatnasinghamS，deWaardJR。生物條碼在動物中的應用細胞色素c氧化酶亞基1在動物近緣物種中的差異。倫敦皇家學會會議錄B:生物科學，2003，270:S596-S599)Pe皿isiE(2007)Taxonomy.Wanted:abarcodeforplants.Science318:190-191.(PennisiE。分類學需要植物條形碼。禾斗學，2007，318:190-191)KressWJ，WurdackKJ，ZimmerEA，WeigtLA，JanzenDH(2005)UseofDNAbarcodestoidentifyfloweringplants.ProcNatlAcadSciUSA102:8369—8374.(KressWJ，WurdackKJ，ZimmerEA，WeigtLA，JanzenDH。應用DNA條碼區(qū)分開花植物。美國禾斗學院院報，2005，102:8369-8374)NewmasterSG，FazekasAJ，Rag卯athyS(2006)DNAbarcodinginlandplants:evalimtionofrbcLinamultigenetieredapproach.CanJBot84:335—341.(NewmasterSG，FazekasAJ，RagupathyS。陸生植物的DNA條碼rbcL基因片段在多基因片段組合條碼中的應用評估。加拿大植物學報，2006，84:335-341)Lah罕R，vanderBankM，BogarinD，WarnerJ，PupulinF，etal.(2008)DNAbarcodingtheflorasofbiodiversityhotspots.ProcNatlAcadSciUSA105:2923-2928.(LahayeR，vanderBankM，BogarinD，War證J，PupulinF等。DNA條碼區(qū)分生物群落熱點。美國科學院院報，2008，105:2923-2928)NewmasterSG，FazekasAJ，SteevesRAD，JanovecJ(2008)TestingcandidateplantbarcoderegionsintheMyristicaceae.MolEcolResour8:480-490.(NewmasterSG，FazekasAJ，SteevesRAD，JanovecJ。區(qū)分肉豆蔻科植物的候選DNA條碼片段。分子生態(tài)學資源，2008，8:480-490)BernardiG，Alva-CampbellYR，Gasparini幾，FloeterSR(2008)Molecularecology,speciation，andevolutionofthereeffishgenusAnisotremus.MolPhylogenetEvol48(3):929-935.(BernardiG，Alva-CampbellYR，Gasparini幾，FloeterSR。暗礁魚屬異孔石鱸的分子生態(tài)、種形成和進化。分子系統(tǒng)學與進化，2008，48(3):929-935)NguyenNH，DriscollHE，SpechtCD(2008)Amolecularphylogenyofthewildonions(Allium;Alliaceae)withafocusonthewesternNorthAmericancenterofdiversity.MolPhylogenetEvol47(3):1157-1172.(NguyenNH，DriscollHE，SpechtCD。西北美地區(qū)野生洋蔥的系統(tǒng)發(fā)育。分子系統(tǒng)學與進化，2008，47(3):1157-1172)LayHL，LiuHJ，LiaoMH，ChenCC，LiuSY，etal.(2001)GeneticidentificationofChinesedrugmaterialsiny咖(Dioscoreaspp.)byRAPDanalysis.JFoodDrug4Anal9(3):132-138.(LayHL，LiuHJ，LiaoMH，ChenCC，LiuSY等。利用RAPD方法進行薯蕷屬中國藥用材料的遺傳鑒定。藥物食品分析，2001，9(3):132-138)ZhangKYB，LeungHW，YeungHW，WongRNS(2001)DifferentiationofLyciumbarbarumfromitsrelatedLyciumspeciesusingrandomamplifiedpolymorphicDNA.PlantaMed67:379-381.(zhang跳Le皿gHw，YeungHw，WongRNS。利用隨機擴增多態(tài)DNA方法區(qū)分枸杞屬中的相近種。藥用植物，2001，67:379-381)BlessC，PalmeterH，WallaceMM(2006)IdentificationofAcerrubrumUsingAmplifiedFragmentLengthPolymorphism.JForensicSci51(1):31-38.(BlessC，PalmeterH，Wallace匪。利用擴增片段長度多態(tài)性方法區(qū)分紅楓樹種。司法鑒定，2006，51(1):31-38)RekikI，SalimontiA，Kamo皿NG，Muzzal卯oI，L印ais0，etal.(2008)CharacterizationandidentificationofTunisianolivetreevarietiesbymicrosatellitemarkers.Hortscience43(5):1371-1376.(RekikI，SalimontiA，KamounNG，MuzzalupoI，L印ais0等。利用微衛(wèi)星標記描述和區(qū)分突尼斯橄欖樹變種。園藝科學，2008,43(5):1371-1376)
發(fā)明內容本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種用于動植物描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)的制備方法，采用本發(fā)明方法所得的分子條碼系統(tǒng)是具有真正條碼形態(tài)的、能甄別具有較近遺傳關系的動植物物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株。為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種動植物描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟1)、對采用單一或多種分子標記技術獲得的動植物材料的單態(tài)性或多態(tài)性條帶數據進行采集，形成標記集合，作為區(qū)別物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株的分子標記集合；2)、對上述動植物材料獲得的分子標記集合，采用二維條碼技術，將其名稱、分子標記中所用引物、單態(tài)性或多態(tài)性標記及其分析結果進行轉換和儲存，以條形碼的形式表達。作為本發(fā)明的動植物描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)的制備方法的改進動植物材料為物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株。本發(fā)明還同時提供了利用上述制備方法獲得的分子條碼系統(tǒng)的用途用于物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株的鑒定、甄別、標識或審定；或者將上述數據通過計算機、網絡等形式儲存和更新。在本發(fā)明中，對經分子標記技術獲得的條帶采集形成可區(qū)別、可拓展的標記集合，這些標記集合結合其名稱等信息通過采用計算機軟件獲得分子條碼。在本發(fā)明中，當動植物品種為未知種屬，先將所得的分子信息數據與數據庫中已有的信息進行聚類，從而確定所述動植物品種所屬的種屬；當動植物品種為已知種屬，可用此方法獲得其相關分子信息數據等信息，從而充實數據庫。在本發(fā)明中，只要使用該動植物品種的單個樣品，就能制備出相應的分子條碼系統(tǒng)。5本發(fā)明采用分子標記技術用一種分子標記或多種分子標記的組合獲得動植物物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株的基因組信息；利用相關軟件基于以上信息進行聚類或建立系統(tǒng)發(fā)生樹對測試樣品進行甄別；應用條形碼轉換工具或其他的信息儲存方法對品種名或個體名、所用標記和標記實驗結果信息轉換成條形碼或其他儲存形態(tài)，用于特異地以條形碼的形式描述動植物物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株。該條碼能被方便的解碼，并以數據庫或網絡等介質對以上信息進行上傳、儲存、查詢、下載、解碼、共享或更新(圖1)。因此采用本發(fā)明方法所得的用于動植物描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)是具有真正條碼形態(tài)的分子條碼系統(tǒng)。綜上所述，本發(fā)明可普遍應用于鑒別親緣關系較近的物種，為生物群體甚至個體，尤其是栽培作物以及家養(yǎng)動物的品種鑒定、甄別、標識和審定，以及新品種權保護等建立了一套統(tǒng)一的、穩(wěn)定的、可普遍采用且分子標記數據可共享和更新的、真正意義上可讀寫的分子條碼系統(tǒng)。下面結合附圖對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細說明。圖1動植物(物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株)描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)流程圖；圖2植物品種'油冬兒'用M5E1引物組合F-AFLP檢測結果圖；橫坐標代表F-AFLP擴增片段具有的堿基數目，縱坐標代表多態(tài)性片段的熒光信號強度；圖3基于熒光AFLP分析結果采用非加權組平均法對74份十字花科作物品種進行聚類分析結果(油冬兒'分子條形碼；(矮腳黃'分子條形碼；(長梗'分子條形碼；(上海青'分子條形碼；(玉山'豬用M5E1引物組合F-AFLP檢測結果圖4植物f圖5植物f圖6植物f圖7植物f圖8動物f,種,種,種,種,種橫坐標代表F-AFLP擴增片段具有的堿基數目，縱坐標代表多態(tài)性片段的熒光十號強度；圖9基于熒光AFLP數據采用非加權組平均法對17個中國地方豬種和1個野豬f種進行聚類分析結果圖。圖10動物品種'玉山'豬分子條形碼；圖11動物品種'蘭塘'豬分子條形碼；圖12動物品種'上高'豬分子條形碼。'、.-具體實施例方式實施例1、十字花科作物的甄別和分子條碼構建選用蕓薹(Brassicar即a)、甘藍(B.oleracea)、芥菜(B.j皿cea)禾口蘿卜(R即ha皿ssativus)作物的74份品種材料(表1)進行分子條碼構建和品種甄別。表1、74份十字花科作物品種信息種/變種(拉丁名)品種種/變種(拉丁名)品種Brassicarapassp.chinensisvar.pekinensis黃芽菜Brassicarapassp.rapifera玉環(huán)盤菜Brassicarapassp.chinensisvar.pekinensis黃芽14Brassicarapassp.rapifera楠溪盤菜Brassicarapassp.chinensisvar.pekinensis浙白4號Brassicarapassp.rapifera溫抗l號Brassicarapassp.chinensisvar.pekinensis浙白6號Brassicarapassp.rapifera溫盤l號Brassicarapassp.chinensisvar.pekinensis早熟5號Brassicajuncearar.turnida金絲芥Brassicarapassp.chinensisvar.pekinensis浙白8號Brassicajuncearar.turnida瘤芥菜Brassicarapassp.chinensisvar.communis油冬兒Brassicajuncearar.turnida鄞雪18Brassicarapassp.chinensisvar.communis矮腳黃Brassicajuncearar.turnida惠圓早Brassicarapassp.chinensisvar.communis長梗Brassicajuncearar.turnida潮豐l號Brassicarapassp.chinensisvar.communis上海青Brassicajuncearar.turnida九頭鳥Brassicarapassp.chinensisvar.communis矮抗青Brassicajuncearar.turnida桐農l號Brassicarapassp.chinensisvar.communis五月蔓Brassicajuncearar.turnida香螺種Brassicarapassp.chinensisvar.communis抗熱605Brassicajuncearar.turnida甬豐l號7<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>對表1中的每份品種材料，均分別進行如下步驟的內容(1)基因組DNA序列的獲得取各材料葉片0.5g，以CTAB法提取基因組DNA。(2)利用熒光AFLP分子標記獲得各材料基因組信息酶切基因組DNA:取250ng基因組DNA，采用EcoRI和MseI進行雙酶切；酶切體系2.5UEcoRI0.125iiL，2.5UMseI0.25iiL，10XY+/TangoBuffer(含10XBSA)5.OilL，加(1朋20至酶切體系為25iiL;37。C溫育6h，后用7(TC水浴處理15min滅酶活性；得酶切產物。DNA片段連接在25iiL酶切產物中加ddH200.6yL，10X連接Buffer3.0yL，EcoRI接頭0.5yL(接頭序列見序列表SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示)，MseI接頭0.5iiL(接頭序列見序列表SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示)，T4DNA連接酶0.4yL，終體系為30iiL;20。C或室溫連接過夜；得連接后DNA模板。預擴預擴體系25iiL:ddH2016.1yL，連接后DNA模板2.5yL，EcoRI預擴引物(50ng*iiL-l)0.7iiL(序列見序列表SEQIDNo:5所示)，MseI預擴引物(50ngiiL—"O.7iiL(序列見序列表SEQIDNo:6所示)，dNTPs(lOmmolL—00.5iiL，10XPCRreactionbuffer(含Mg202.0iiL，2UTaqPolymerase2.5iiL。預擴增的PCR反應程序為94°C，30s;56°C，30s;72°C，60s;18個循環(huán)，得預擴產物；取5預擴產物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，拍照觀察結果。預擴產物4t:保存?zhèn)溆糜谶x擇性擴增。選擇性擴增AFLP選擇性擴增體系20L:模板(預擴產物稀釋100倍)1yL，EcoRI選擴引物(3.3ngyL)1.5PL(序列見序列表SEQIDNo:7所示)，MseI選擴熒光引物(20ngiiL-l)1.5iiL(序列見序列表:SEQIDNo:8所示)，dNTPs(lOmmol*L)0.4iiL，10XPCRreactionbuffer(*Mg2+)2.0iiL，TaqPolymerase0.5iiL，ddH2013.liiL。94。C預變性120s，94。C，30s;65。C，30s;72s，60s，每個循環(huán)退火溫度降低0.7。C，經13個循環(huán)后，退火溫度降至56t:，再進行30個以下循環(huán)的擴增94°C，30s;56°C，30s:72。C，60s后72t:延伸7min。用滅菌ddH20將選擇性擴增產物稀釋20倍，取少量(如5yL)稀釋產物，加入等量的上樣緩沖液，94t:變性5min，后立即放置于冰上。變性的PCR產物用4.5%的聚丙烯酰胺凝膠在ABI3100序列分析儀1500V，35mA，150W，5(TC條件下電泳2h，收集膠圖像。注SEQIDNo:7和No:8是MseI選擴熒光引物和EcoRI選擴引物的通稱，術尾N表示A、T、G、C四堿基中的任一個。應用GENEMAPPER軟件進行數據收集，檢測結果以"油冬兒"用M5E1引物組合F-AFLP檢測結果為例說明，如圖2。從選擇性擴增引物中選出擴增成功率為100%且擴增結果多態(tài)程度最高的8對引物M5E2(序列見序列表SEQIDNo:9禾PSEQIDNo:10所示)、M6E1(序列見序列表SEQIDNo:ll禾PSEQIDNo:12所示)、M3E2(序列見序列表SEQIDNo:13禾PSEQIDNo:14所示)、M5E1(序列見序列表SEQIDNo:15禾口SEQIDNo:16所示)、M6E(序列見序列表SEQIDNo:17和SEQIDNo:18所示)、M4E7(序列見序列表SEQIDNo:19和SEQIDNo:20所示)、M1E2(序列見序列表:SEQIDNo:21和SEQIDNo:22所示)、M8E3(序列見序列表:SEQIDNo:23和SEQIDNo:24所示)用于74份十字花科植物的甄別和描述。(3)74份十字花科植物的甄別對上述8對引物選擇性擴增結果利用NTSYSpc2.1軟件采用非加權組平均法進行聚類分析，74份十字花科植物被一一區(qū)分開(圖3)。由此證明本發(fā)明采用上述8對引物就能把這74個遺傳關系很近的植物區(qū)分開來，而常規(guī)的DNA條碼所用的那些基因序列無法實現上述區(qū)分。利用本發(fā)明的方法，當有若干個樣品被混雜時，可利用此步驟區(qū)分出樣品中有幾類，即實現了聚類分析。(4)分子條碼構建利用PDF417軟件把各品種的品種名、熒光AFLP所用的選擇性擴增引物序列堿基組成、選擇性擴增產物按堿基數大小順序排列的信息轉換成二維條碼。上述順序可按照各引物名稱上的數字從小到大進行排列(例如先按照M1、M2……，然后再按照E1、E2……)。該條碼的大小根據儲存信息的多少而變化，以'油冬兒'、'矮腳黃'、'長梗'和'上海青'為例，把品種名、所用的熒光AFLP選擇性擴增引物組合M5E1和M5E2序列，擴增產物大小排列結果應用PDF417軟件轉換成二維條碼分別如圖4、圖5、圖6和圖7。10實施例2、豬屬的甄別和分子條碼構建選用豬屬17個中國地方豬種和1個野豬品種進行分子條碼構建(表2)。表2、17個中國地方豬種和1個野豬品種信息<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>對表2中的每份品種材料，均分別進行如下步驟的內容(1)基因組DNA序列的獲得豬前腔靜脈采血5mL，EDTA抗凝凍臧。用傳統(tǒng)酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，產物純度約在80%97%左右，TE溶解后稀釋到終濃度50ng/iiL。(2)利用熒光AFLP分子標記獲得各材料基因組信息酶切基因組DNA:取250ng基因組DNA，采用EcoRI和MseI進行雙酶切。酶切體系2.5UEcoRI0.125iiL，2.5UMseI0.25iiL，10XY+/TangoBuffer(含10XBSA)5.OiiL，加滅菌ddH20至酶切體系為25iiL。37t:溫育6h，后用7(TC水浴處理15min滅酶活性；得酶切產物。DNA片段連接在25iiL酶切產物中加ddH200.6yL，10X連接Buffer3.0yL，EcoRI接頭0.5yL(接頭序列見序列表SEQIDNo:1和SEQIDNo:2所示)，MseI接頭0.5iiL(接頭序列見序列表SEQIDNo:3和SEQIDNo:4所示)，T4DNA連接酶0.4yL，終體系為30iiL;20。C或室溫連接過夜；得連接后DNA模板。預擴預擴體系25iiL:ddH2016.1yL，連接后DNA模板2.5yL，EcoRI預擴引物(50ng*iiL-l)0.7iiL(序列見序列表SEQIDNo:5所示)，MseI預擴引物(50ngiiL—"O.7iiL(序列見序列表SEQIDNo:6所示)，dNTPs(lOmmolL—00.5iiL，10XPCRreactionbuffer(含Mg2+)2.0L，2UTaqPolymerase2.5iiL。預擴增的PCR反應程序為94t:，30s;56°C，30s;72°C，60s;18個循環(huán)，取5預擴產物在1.2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，拍照觀察結果。4t:保存用于選擇性擴增。選擇性擴增AFLP選擇性擴增體系20L:模板(預擴產物稀釋100倍)1yL，選擇性擴增引物分別使用實例1中選出的8對引物M5E2(序列見序列表:SEQIDNo:9和SEQIDNo:10所示)、M6E1(序列見序列表SEQIDNo:11和SEQIDNo:12所示)、M3E2(序列見序列表SEQIDNo:13和SEQIDNo:14所示)、M5E1(序列見序列表SEQIDNo:15禾PSEQIDNo:16所示)、M6E2(序列見序列表SEQIDNo:17禾PSEQIDNo:18所示)、M4E7(序列見序列表SEQIDNo:19和SEQIDNo:20所示)、M1E2(序列見序列表SEQIDNo:21和SEQIDNo:22所示)、M8E3(序列見序列表SEQIDNo:23和SEQIDNo:24所示)，引物各用1.5iiL，dNTPs(10,1L)0.4iiL，10XPCRreactionbuffer(含Mg2+)2.0iiL，TaqPolymerase0.5iiL，ddH2013.1iiL。94。C預變性120s，94°C，30s;65。C，30s;72s，60s，每個循環(huán)退火溫度降低0.7t:，經13個循環(huán)后，退火溫度降至56t:，再進行30個以下循環(huán)的擴增94。C，30s;56。C，30s;72。C，60s后72。C延伸7min。用滅菌ddH20將選擇性擴增稀釋20倍，取少量(如5iiL)稀釋產物，加入等量的上樣緩沖液，94t:變性5min，后立即放置于冰上。變性的PCR產物用4.5%的聚丙烯酰胺凝膠在ABI3100序列分析儀1500V，35mA，150W，5(TC條件下電泳2h，收集膠圖像。應用GENEMAPPER軟件進行數據收集，檢測結果以動物品種'玉山'豬用M5E1引物組合F-AFLP檢測結果為例，如圖8。(3)17個中國地方豬種及1個野豬品種的甄別對上述8對引物選擇性擴增結果利用NTSYSpc2.1軟件采用非加權組平均法進行聚類分析，17個中國地方豬種被一一區(qū)分開(圖9)。(4)分子條碼構建利用PDF417軟件把各品種的品種名、熒光AFLP所用的選擇性擴增引物序列堿基組成、選擇性擴增產物按堿基數大小順序排列的信息轉化成二維條碼，該條碼的大小根據儲存信息的多少而變化，以'玉山'、'蘭塘'和'上高'三個地方豬種為例，把品種名、所用的熒光AFLP選擇性擴增引物組合M5E1和M5E2序列，擴增產物大小排列結果應用PDF417軟件轉換成二維條碼見圖10、11和12。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發(fā)明公開的內容直接導出或聯(lián)想到的所有變形，均應認為是本發(fā)明的保護范圍。序列表SEQIDNo:1SEQIDNo:1的信息(i)序列特征12(A)長度:17bp(B)類型核酸(C)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述EcoRI接頭上游引物(xii)CTCGTAGACTGCGTACCSEQIDNo:2SEQIDNo:2的信息(i)序列特征(D)長度18bp(E)類型核酸(F)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述EcoRI接頭下游引物(xii)AATTGGTACGCAGTCTACSEQIDNo:3SEQIDNo:3的信息(i)序列特征(G)長度16bp(H)類型核酸(I)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:MseI接頭上游引物(xii)GACGATGAGTCCTGAGSEQIDNo:4SEQIDNo:4的信息(i)序列特征(J)長度:14bp(K)類型核酸(L)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:MseI接頭下游引物(xii)TACTCAGGACTCATSEQIDNo:5SEQIDNo:5的信息(i)序列特征(M)長度20bp(N)類型核酸(0)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述EcoRI預擴引物(xii)ATTGATTTGGGCCGGTTCAGSEQIDNo:6SEQIDNo:6的信息(i)序列特征(P)長度23bp(Q)類型核酸(R)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:MseI預擴引物(xii)ATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCSEQIDNo:7SEQIDNo:7的信息(i)序列特征(S)長度18bp(T)類型核酸(U)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述EcoRI選擴引物(xii)GACTGCGTACCAATTCNNSEQIDNo:8SEQIDNo:8的信息(i)序列特征(V)長度18bp(W)類型核酸(X)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:MseI選擴引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAANNSEQIDNo:9SEQIDNo:9的信息(i)序列特征(Y)長度18bp(Z)類型核酸(AA)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M5E2上游引物(xii)GATGAGTCCTGAGTAATASEQIDNo:10SEQIDNo:10的信息(i)序列特征(BB)長度18bp(CC)類型核酸(DD)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M5E2下游引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAAAGSEQIDNo:11SEQIDNo:11的信息(i)序列特征(EE)長度18bp(FF)類型核酸(GG)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M6E1上游引物(xii)GATGAGTCCTGAGTAATCSEQIDNo:12SEQIDNo:12的信息(i)序列特征(HH)長度:18bp(II)類型核酸(JJ)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M6E1下游引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAAACSEQIDNo:13SEQIDNo:13的信息(i)序列特征(KK)長度18bp(LL)類型核酸(匪)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述M3E2上游引物(xii)GATGAGTCCTGAGTAAAGSEQIDNo:14SEQIDNo:14的信息(i)序列特征(NN)長度:18bp(00)類型核酸(PP)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述M3E2下游引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAAAGSEQIDNo:15SEQIDNo:15的信息(1)序列特征(QQ)長度18bp(RR)類型核酸(SS)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M5E1上游引物(xii)GATGAGTCCTGAGTAATASEQIDNo:16SEQIDNo:16的信息(i)序列特征(TT)長度18bp(UU)類型核酸(VV)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M5E1下游引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAAACSEQIDNo:17SEQIDNo:17的信息(i)序列特征(麗)長度18bp(XX)類型核酸(YY)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M6E2上游引物(xii)GATGAGTCCTGAGTAATCSEQIDNo:18SEQIDNo:18的信息(i)序列特征(ZZ)長度18bp(AAA)類型核酸(BBB)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M6E2下游引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAAAGSEQIDNo:19SEQIDNo:19的信息(i)序列特征(CCC)長度:18bp(DDD)類型核酸(EEE)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M4E7上游引物(xii)GATGAGTCCTGAGTAAATSEQIDNo:20SEQIDNo:20的信息(i)序列特征(FFF)長度:18bp(GGG)類型核酸(HHH)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M4E7下游引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAAGCSEQIDNo:21SEQIDNo:21的信息(i)序列特征(III)長度:18bp(JJJ)類型核酸(KKK)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M1E2上游引物(xii)GATGAGTCCTGAGTAAAASEQIDNo:22SEQIDNo:22的信息(i)序列特征(LLL)長度:18bp(MMM)類型核酸(NNN)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M1E2下游引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAAAGSEQIDNo:23SEQIDNo:23的信息(i)序列特征(000)長度:18bp(PPP)類型核酸(QQQ)鏈型單鏈拓撲結構線性(ii)分子型DNA(xi)序列描述:M8E3上游引物(xii)GATGAGTCCTGAGTAAATSEQIDNo:24SEQIDNo:24的信息(1)序列特征(RRR)長度:18bp(SSS)類型核酸(TTT)鏈型單鏈拓撲結構線性18(ii)分子型DNA(xi)序列描述M8E3下游引物(xii)FAM-GATGAGTCCTGAGTAAGC權利要求一種動植物描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)的制備方法，其特征是包括以下步驟1)、對采用單一或多種分子標記技術獲得的動植物材料的單態(tài)性或多態(tài)性條帶數據進行采集，形成標記集合，作為區(qū)別物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株的分子標記集合；2)、對上述動植物材料獲得的分子標記集合，采用二維條碼技術，將其名稱、分子標記中所用引物、單態(tài)性或多態(tài)性標記及其分析結果進行轉換和儲存，以條形碼的形式表達。2.根據權利要求1所述的動植物描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)的制備方法，其特征是所述動植物材料為物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株。3.利用權利要求1或2所述制備方法獲得的分子條碼系統(tǒng)的用途用于物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株的鑒定、甄別、標識或審定；或者將上述數據通過計算機、網絡等形式儲存和更新。全文摘要本發(fā)明公開了一種動植物描述和甄別的分子條碼系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟1)對采用單一或多種分子標記技術獲得的動植物材料的單態(tài)性或多態(tài)性條帶數據進行采集，形成標記集合，作為區(qū)別物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株的分子標記集合；2)對上述動植物材料獲得的分子標記集合，采用二維條碼技術，將其名稱、分子標記中所用引物、單態(tài)性或多態(tài)性標記及其分析結果進行轉換和儲存，以條形碼的形式表達。本發(fā)明還同時公開了利用上述制備方法獲得的分子條碼系統(tǒng)的用途用于物種、亞種、變種、品種、自交系或變異單株的鑒定、甄別、標識或審定；或者將上述數據通過計算機、網絡等形式儲存和更新。文檔編號G06F17/30GK101694696SQ20091015351公開日2010年4月14日申請日期2009年9月30日優(yōu)先權日2009年9月30日發(fā)明者曹家樹,朱熠鵬,趙曉楓,黃鸝申請人:浙江大學;