本發(fā)明涉及一種通過對母體血清DNA測序來預測胎兒單基因遺傳變異的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種基于母體血清DNA測序而非侵入性地預測胎兒單基因遺傳變異及其導致的單基因疾病的方法。
背景技術：
：最近，由于畸形胎兒出生率的增加和各種產(chǎn)前診斷設備的開發(fā)，人們對產(chǎn)前診斷的關心與日俱增。特別地，推薦這樣的孕婦接受產(chǎn)前診斷：其年齡在35歲以上、其分娩過染色體異常的胎兒、其出生時具有染色體結構異?；蚱涮菏桥c具有染色體結構異常的男性所懷的、其具有家族遺傳疾病史、其具有神經(jīng)管缺陷的風險、或其在母體血清篩查和超聲波檢查中被懷疑具有胎兒畸形。產(chǎn)前診斷方法可大致分為侵入性診斷方法和非侵入性診斷方法。由于侵入性診斷方法在診斷過程中對胎兒施加影響而有可能引起流產(chǎn)、疾病或畸形等，因此，已開發(fā)了非侵入性診斷方法作為替代方法來克服此類問題。在母體血漿的游離DNA(cfDNA)中的游離胎兒DNA(cffDNA)的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)非侵入性的產(chǎn)前遺傳診斷方法提供了強有力的工具。大規(guī)模平行測序(也稱為新一代測序)的引入進一步促進了cffDNA在產(chǎn)前診斷中的應用。此外，一些研究通過全基因組測序(WGS)和cffDNA目標富集后的測序證實了胎兒和母體DNA在整個基因組上是均勻分布的(LoYMetal.，ScienceTranslationalMedicine2010；2：61ra91；LiaoGJetal.，ClinicalChemistry2011；57：92-101；KitzmanJOetal.，ScienceTranslationalMedicine2012；4：137ra76)。這些結果提供了可將檢測擴展至單基因疾病的基礎，單基因疾病比染色體非整倍性更為常見。然而，相對于非整倍性檢測在臨床實踐中的便利的應用，應用于單基因疾病還有很多復雜的障礙要克服。cffDNA在母體血漿中的含量很低而且其在不同母體血漿中的含量變化較大，因而很難在單核苷酸的水平上可靠地檢測出胎兒變體。技術實現(xiàn)要素：技術問題本發(fā)明旨在提供一種通過使用母體血清DNA測序而簡便地檢驗、檢測或診斷胎兒的單基因變異的方法，或預測或診斷與所述單基因變異相關的單基因疾病的方法、或提供與所述單基因變異相關的單基因疾病的預測/診斷信息的方法。技術方案本發(fā)明涉及一種通過母體血清DNA測序來預測胎兒單基因遺傳變異的方法。更具體地，本發(fā)明涉及一種通過母體血清DNA測序來非侵入性地預測、檢測或診斷胎兒單基因遺傳變異及其導致的單基因疾病的方法。本發(fā)明的一個實施方案涉及一種使用母體血清RNA檢測胎兒遺傳變異的方法，所述方法包括：通過母體血清DNA的測序分析，在母體單基因中定義基因缺失或重復型遺傳突變類型和遺傳變異區(qū)域，并在具有所述遺傳變異的母體血清DNA的變異區(qū)域中使用雜合SNP的等位基因頻率來確定胎兒是否在單基因疾病相關的單基因中具有基因缺失或重復型遺傳變異的步驟。本發(fā)明的另一個實施方案涉及一種使用母體血清RNA來檢測胎兒遺傳變異的方法，所述方法包括：通過母體血清DNA的測序分析，在母體單基因中定義基因缺失或重復型遺傳突變類型和遺傳變異區(qū)域，并使用通過新一代測序法分析具有所述遺傳變異的母體的血清DNA和血球(corpuscle)DNA而獲得的讀碼深度比(readdepthratio)(血清讀碼深度/血球讀碼深度)，并應用該讀碼深度比來確定胎兒是否在單基因疾病相關的單基因中具有基因缺失或重復型遺傳變異的步驟。隨著DNA測序技術的發(fā)展，可解讀大量的遺傳信息，并且基于新一代測序(NGS)技術的基因組分析方法被應用于產(chǎn)前分析領域中。特別地，基于母體血液包含一定水平的胎兒基因組這一事實，母體血液樣品可用于分析胎兒基因組信息。該方法簡便，對母體或胎兒沒有影響，并可用作早期預測胎兒遺傳變異的產(chǎn)前診斷方法。有益效果本發(fā)明的方法能夠以非侵入性的方式，通過對攜帶者(carrier)母體的血清DNA測序而在胎兒出生前(從懷孕后6周以后)預測胎兒單基因遺傳變異，該方法有效且簡便，因而能夠代替?zhèn)鹘y(tǒng)的非侵入性方法(如絨毛膜絨毛取樣和羊膜穿刺術)而應用于產(chǎn)前診斷。附圖說明圖1示出了從本發(fā)明具體實施方式中獲得的等位基因頻率相對胎兒DNA分數(shù)的圖，其中上面的線是指在單基因中具有突變的胎兒的等位基因頻率，下面的線是指在單基因中不具有突變的胎兒的等位基因頻率。圖2示出了從本發(fā)明具體實施方式中獲得的單基因中變異和非變異區(qū)域中的血清讀碼深度與血球讀碼深度的比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度，γ)，其中X軸為X-染色體上的核苷酸位置，Y軸表示變異區(qū)域(實心圓)和非變異區(qū)域(空心圓)的相對讀碼深度比(γ)和各區(qū)域的代表值(虛線)。具體實施方式在下文中，將更詳細地描述本發(fā)明。本發(fā)明涉及一種通過母體血清DNA測序來檢驗、檢測或診斷胎兒單基因遺傳變異的方法。本方法簡便，因為它不需要父系或雄性系DNA。具體地，使用母體血清DNA檢測胎兒單基因遺傳變異的方法包括：根據(jù)母體血清DNA的測序分析數(shù)據(jù)，在單基因疾病相關聯(lián)的母體單基因中定義基因缺失或重復型遺傳突變類型及變異發(fā)生的區(qū)域(步驟A)，使用具有遺傳變異的母體血清DNA，依據(jù)所述變異區(qū)域或非變異區(qū)域(正常區(qū)域)中的胎兒遺傳變異來分析有區(qū)別的遺傳性狀(步驟B)，以及確定胎兒是否在單基因疾病相關的單基因中具有基因缺失或重復型遺傳變異(步驟C)。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述使用具有遺傳變異的母體血清DNA來分析有區(qū)別的遺傳性狀的步驟B可通過兩種方式進行。第一種，對具有遺傳變異的母體血清DNA測量變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率，得到等位基因頻率的測量分布。通過使用母體血清DNA中胎兒DNA分數(shù)(f)和孟德爾定律來計算并獲得對于存在及不存在胎兒遺傳變異的單基因的變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率的預測值。然后，使用所述測量分布和預測值來確定胎兒是否具有遺傳突變。第二種，通過新一代測序法來分析母體血清DNA和母體血球DNA(母體基因組DNA)的序列信息，從各母體血清DNA和母體血球DNA中獲得變異區(qū)域和非變異區(qū)域中的讀碼深度，并通過獲取并比較血清讀碼深度與血球讀碼深度的比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)，來確定是否存在胎兒遺傳突變。在本發(fā)明的一些實施方案中，使用遺傳變異區(qū)域中的雜合SNP的等位基因頻率的方法可如下進行：分析母體血清DNA以獲得母體測序數(shù)據(jù)；通過使用所述測序數(shù)據(jù)來定義在母體單基因疾病相關聯(lián)的單基因中的缺失或重復型遺傳突變及變異區(qū)域；通過在具有所述遺傳變異的母體血清DNA中測量變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率，而得到等位基因頻率的測量分布；獲得母體血清DNA中的胎兒DNA分數(shù)(f)并使用孟德爾定律來計算單基因的變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率的預測值，當胎兒具有單基因的遺傳變異時將其作為第一預測值(θexp|aff)，當胎兒不具有單基因的遺傳變異時將其作為第二預測值(θexp|unaff)；以及基于所述第一預測值(θexp|aff)和第二預測值(θexp|unaff)是否落入等位基因頻率的測量分布的統(tǒng)計學顯著區(qū)間來確定胎兒是否在單基因疾病相關的單基因上具有基因缺失或重復型遺傳突變。在下文中將分步對本發(fā)明的檢測方法分進行更詳細的說明。(步驟A)此步驟為通過使用母體血清DNA的測序分析數(shù)據(jù)來定義在單基因疾病相關的母體單基因中的基因缺失或重復型遺傳突變及所述遺傳變異發(fā)生區(qū)域的步驟。由于本發(fā)明的方法基于對母體血清中X染色體連鎖(X-linked)疾病即由單基因遺傳變異引起的疾病的等位基因頻率的分析，本領域技術人員可容易地理解本發(fā)明的方法可用于X染色體連鎖的隱性疾病或常染色體的隱性疾病。所述由單基因遺傳變異引起的疾病的實例可以是單基因疾病，包括但不限于杜氏肌營養(yǎng)不良、佩利措伊斯-梅茨巴赫病、肌管性肌病、眼腦腎綜合征、門克斯綜合征、X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、Hoyeraal-Hreidarsson綜合征、脊髓性肌肉萎縮癥、異染性腦白質(zhì)病變和克拉伯病。在本發(fā)明的方法中，術語“攜帶者母體”或“目標母體”是指在X染色體中具有本發(fā)明的方法所要確認的單基因遺傳突變的母體，并且由于所述攜帶者母體僅在其兩條X(XX)染色體中的一條中具有隱性單基因突變(X’)，所以其不出現(xiàn)所述單基因疾病。在本發(fā)明中，攜帶者母體是懷有胎兒的母體，優(yōu)選懷孕6周以上的母體。所述攜帶者母體的游離DNA包含游離胎兒DNA?？赏ㄟ^調(diào)查相應單基因疾病的家族史或對基因組DNA測序并將序列與參照DNA序列比對來確定所述攜帶者母體是否為攜帶者，所述參照DNA序列是正常DNA序列或具有相應的單基因突變。本身為攜帶者并且可在其懷孕期間獲得游離DNA的母體是本發(fā)明的實驗對象?？赏ㄟ^新一代測序方法進行所述血清DNA的測序，該方法的實例包括但不限于目標富集和大規(guī)模平行測序。可使用許多熟知的結構變異檢測程序來獲知所述遺傳突變的類型(插入或缺失)和區(qū)域。這些結構變異檢測程序的實例包括但不限于Delly、Pindell、BreakDancer、GASV、Hydra和CNVnator。在一個具體的實施方案中，優(yōu)選可通過以下的步驟來確定所述遺傳突變的類型和區(qū)域：大規(guī)模平行測序后，對窗口尺寸為10kb讀碼點的重疊滑動窗(overlappingslidingwindow)計算讀碼深度的移動平均值；以及應用CBS(循環(huán)二元分割)算法。例如，單基因中基因缺失或重復型遺傳突變及變異區(qū)域的確定可如下進行：通過新一代測序法分析母體血清DNA而獲得的讀碼深度來計算移動平均值，并應用CBS(循環(huán)二元分割)算法。任選地，所述方法還可包括以下步驟：使用已知方法預先消除讀碼深度數(shù)據(jù)中由基因區(qū)域的GC含量差異而導致的變異。(步驟B和步驟C)步驟B利用母體血清DNA的遺傳變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率，包含使用SNP等位基因頻率的方法(B-1)和使用單基因的變異和非變異區(qū)域的血清讀碼深度與血球讀碼深度的比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)的方法(B-2)。在一個實施方案中，用于獲得等位基因頻率的測量分布和預測值的等位基因是相同的。例如，可在獲得等位基因頻率的測量分布以及獲得所述等位基因頻率的預測值的兩個步驟中都使用等位基因頻率小于0.5的次要等位基因或等位基因頻率大于0.5的主要等位基因。當將次要等位基因和主要等位基因一起使用來獲得等位基因頻率的測量分布和預測值時，不論是否存在胎兒遺傳變異，測量分布和預測值都集中在0.5，因此，這不但使基于假設的差異變小，而且還使預測值的計算復雜化。適于使用SNP等位基因頻率的步驟B的第一子步驟(B-1)可包含如下步驟：(B-11)通過測量具有遺傳變異的母體血清DNA在變異區(qū)域中的雜合單核苷酸多態(tài)性(SNP)的等位基因頻率，以得到等位基因頻率的測量分布，(B-12)獲得母體血清DNA中的胎兒DNA分數(shù)(f)并使用孟德爾定律來計算單基因的變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率的預測值，當胎兒在單基因中具有遺傳變異時，將其作為第一預測值(θexp|aff)，當胎兒在單基因中不具有遺傳變異時，將其作為第二預測值(θexp|unaff)，以及(B-13)基于第一預測值(θexp|aff)和第二預測值(θexp|unaff)是否落入等位基因頻率的測量分布的統(tǒng)計學顯著區(qū)間的事實，來確定胎兒是否在單基因疾病相關的單基因上具有基因缺失或重復型遺傳突變。任選地，所述子步驟B-11還可包括使用已知方法消除等位基因頻率值中的異常值的步驟。所述子步驟B-11被設計為從母體血清DNA測序數(shù)據(jù)中測量具有單基因遺傳變異(重復/缺失遺傳變異)的DNA區(qū)域中雜合SNP的平均等位基因頻率(θobs)?？墒褂萌鏢amtools的常規(guī)程序通過對新一代測序數(shù)據(jù)中各等位基因的數(shù)目進行計數(shù)來計算等位基因頻率。在所述子步驟B-12中，獲得攜帶者母體的血清DNA中的胎兒DNA分數(shù)(f)，并可使用多種常規(guī)方法之一來測定所述胎兒DNA分數(shù)。例如，可如下獲得所述母體血清DNA中的男性胎兒DNA分數(shù)(f)：采用捕獲探針捕獲ZFX和ZFY基因，所述捕獲探針可分別捕獲X連鎖的鋅指(Zfx)基因區(qū)域和Y連鎖的鋅指(Zfy)基因區(qū)域。對于男性胎兒，更詳細地，可使用靶向ZFX(X連鎖的鋅指蛋白)和ZFY(Y連鎖的鋅指蛋白)基因區(qū)域的常見捕獲探針來捕獲ZFX和ZFY基因，然后根據(jù)以下方程計算：胎兒DNA分數(shù)：其中，ZFX′和ZFY′是總的匹配的讀碼數(shù)目除以探針數(shù)目的商。可使用在非變異區(qū)域中的中位值為0.1、范圍為0.02至0.3的等位基因頻率上形成的SNP等位基因頻率的分布來獲得所述母體血清DNA中的女性胎兒DNA分數(shù)(f)。在所述子步驟B-12中，獲得母體血清DNA中的胎兒DNA分數(shù)(f)并應用孟德爾定律來獲得所述單基因的變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率的預測值，當胎兒在單基因中具有遺傳變異時，將其作為第一預測值(θexp|aff)，當胎兒在單基因中不具有遺傳變異時，將其作為第二預測值(θexp|unaff)?？筛鶕?jù)染色體的類型(如常染色體和異染色體)、孟德爾氏遺傳的類型以及在異染色體的情況下根據(jù)胎兒的性別，并在母體為攜帶者的假設下，建立方程，根據(jù)該方程計算所述第一預測值和第二預測值。例如，當胎兒是具有X染色體連鎖的隱性疾病的男性時，可根據(jù)以下方程1和2來計算第一預測值(θexp|aff)和第二預測值(θexp|unaff)：<方程1>θexp|aff＝2/(3-f)<方程2>θexp|unaff＝2(1-f)/3-2f所述子步驟B-13被設計為使用第一預測值(θexp|aff)和第二預測值(θexp|unaff)是否落入等位基因頻率的測量分布的統(tǒng)計學顯著區(qū)間內(nèi)，來確定胎兒是否在單基因疾病的單基因中具有基因缺失或重復的遺傳突變。例如，當測得的平均等位基因頻率(θobs)更接近具有單基因遺傳變異的胎兒的等位基因頻率的預測值(θexp|aff)時，預測攜帶者母體中的胎兒具有單基因遺傳變異。另一方面，當測得的平均等位基因頻率(θobs)更接近不具有單基因遺傳變異的胎兒的等位基因頻率的預測值(θexp|unaff)時，預測攜帶者母體中的胎兒不具有單基因遺傳變異。對于統(tǒng)計學顯著性，測得的等位基因頻率(θobs)的顯著性區(qū)域是在其為二項式分布的假設下計算的。如果兩個預測值都在顯著性區(qū)域內(nèi)，則認為該預測不具有統(tǒng)計學顯著性。在本發(fā)明的另一些實施方案中，步驟B的第二子步驟B-2——其被設計為使用單基因的變異區(qū)域和非變異區(qū)域中的血清讀碼深度與血球讀碼深度的比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)——可如下進行：使用母體血清DNA的測序分析數(shù)據(jù)來定義母體單基因疾病相關的單基因中關于基因突變(缺失或重復)類型的遺傳變異及該遺傳變異發(fā)生的區(qū)域；從具有遺傳變異的母體的血清DNA測序數(shù)據(jù)中獲得單基因中變異區(qū)域和非變異區(qū)域中的各血清讀碼深度；從具有遺傳變異的母體的血球DNA測序數(shù)據(jù)中獲得單基因中變異區(qū)域和非變異區(qū)域中的各血球讀碼深度；計算單基因中變異區(qū)域中的血清讀碼深度與血球讀碼深度的第一比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)及單基因中非變異區(qū)域中血清讀碼深度與血球讀碼深度的第二比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)；以及將第一比率和第二比率進行比較，確定胎兒是否在單基因中具有單基因疾病相關的基因缺失或重復型遺傳突變。任選地，獲得所述第一和第二比率的子步驟還可包括使用已知方法消除讀碼深度數(shù)據(jù)中由基因區(qū)域的GC含量差異而導致的變異，并使用已知方法消除讀碼深度數(shù)據(jù)中等位基因頻率值的異常值。在使用母體血清DNA的測序分析數(shù)據(jù)來定義關于遺傳變異的類型和區(qū)域的步驟中，可通過分析母體血清DNA的測序信息并將其用于在單基因疾病相關的單基因中定義遺傳變異的類型(缺失或重復)及遺傳變異的區(qū)域。所述母體血清DNA的測序分析可通過獲得母體血清DNA并對所述血清DNA進行測序而進行?？墒褂门c步驟A中相同的方式進行所述血清DNA的測序分析及遺傳變異類型和區(qū)域的確定。使用新一代測序(NGS)技術來分析具有單基因遺傳變異的攜帶者母體的血清DNA和基因組DNA，以確定如上所描述的單基因遺傳變異的類型和區(qū)域。該方法可應用于重復和缺失型突變兩種類型?？刹捎门c步驟A中相同的方式處理步驟B-2中所使用的疾病、母體和單基因。詳細地，使用單基因的變異和非變異區(qū)域中血清讀碼深度與血球讀碼深度的比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)的方法可通過以下步驟來實施：(B-21)從具有遺傳變異的母體的血清DNA測序數(shù)據(jù)中獲得單基因中變異區(qū)域和非變異區(qū)域中的各血清讀碼深度；(B-22)從具有遺傳變異的母體的血球DNA測序數(shù)據(jù)中獲得單基因中變異區(qū)域和非變異區(qū)域中的各血球讀碼深度；(B-23)計算所述單基因變異區(qū)域中血清讀碼深度與血球讀碼深度的第一比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)以及所述單基因非變異區(qū)域中血清讀碼深度與血球讀碼深度的第二比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)；以及(B-24)將所述第一比率和第二比率進行比較，確定胎兒是否在單基因疾病相關的單基因中具有基因缺失或重復型遺傳突變。為了用于子步驟B-21——從具有遺傳變異的母體的血清DNA測序數(shù)據(jù)中獲得母體血清DNA的單基因中變異區(qū)域和非變異區(qū)域中各血清讀碼深度——中，可使用如步驟A中所描述的新一代測序技術來獲得測序信息和讀碼深度。例如，可使用包括目標富集和大規(guī)模平行測序的新一代測序方法?？刹捎门c所述子步驟B-21相同的方式進行子步驟B-22的從具有遺傳變異的母體的血球DNA測序數(shù)據(jù)中獲得母體血球DNA的單基因中變異區(qū)域和非變異區(qū)域的各血球讀碼深度，不同之處是使用血球DNA代替血清DNA。例如，獲得母體血球DNA然后使用新一代測序方法分析其序列和讀碼深度?？赏ㄟ^將所述母體血液樣品分離為血清和血球并從所述血清和血球中分離出各自的DNA來獲得母體血清DNA和血球DNA?？赏ㄟ^將母體的血液樣品進行離心分離來獲得所述血球，但不限于此，并可通過溶解所述血球以提取基因組DNA?？墒褂帽绢I域熟知的常規(guī)方法進行DNA分離。將母體血液樣品分離為血清和血球使得能夠僅從母體取一次血液樣品就同時獲得血清和血球，因而本方法非常簡便。此外，本發(fā)明的方法具有不需要父系DNA且對于檢測胎兒遺傳變異具有高靈敏性和準確性的優(yōu)點。根據(jù)優(yōu)選的實施方案，可在相同的條件下使用新一代測序方法采用相同的常規(guī)捕獲探針來分析母體血清DNA和血球DNA，以使測量誤差降至最低。當確定了目標單基因時，可容易地選擇常規(guī)捕獲探針，因此不作特別限定。在子步驟B-23和B-24中，通過計算并比較所述單基因的變異區(qū)域中血清讀碼深度與血球讀碼深度的第一比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)和所述單基因的非變異區(qū)域中血清讀碼深度與血球讀碼深度的第二比率(血清讀碼深度/血球讀碼深度)，以確定胎兒是否在單基因疾病相關的單基因中具有基因缺失或重復型遺傳突變。詳細地，采用變異區(qū)域中的母體血清DNA讀碼深度除以母體基因組DNA的讀碼深度來計算相對血清DNA的讀碼深度。同樣地，采用在不非遺傳變異區(qū)域中的母體血清DNA的讀碼深度除以母體基因組DNA的讀碼深度來計算相對血清DNA讀碼深度。可使用如Samtools的常規(guī)程序來計算讀碼深度，并根據(jù)堿基序列位置計算相對讀碼深度。根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，所述第一比率可以是從單基因變異區(qū)域中的單個核苷酸中獲得的兩次或更多次測量的平均值或中位值，而所述第二比率可以是從單基因非變異區(qū)域中的單個核苷酸中獲得的兩次或更多次測量的平均值或中位值?；蛘?，所述第一比率可以是從單基因變異區(qū)域中的5至100,000個堿基的單個核苷酸庫(bin)中獲得的讀碼深度的移動平均值的兩次或更多次測量的平均值或中位值，而所述第二比率可以是從單基因非變異區(qū)域中的5至100,000個堿基的單個核苷酸庫中獲得的讀碼深度的移動平均值的兩次或更多次測量的平均值或中位值。為計算所述讀碼深度的移動平均值，可將所述核苷酸庫設定為重疊的或不重疊的。將所述第一比率和第二比率進行比較來確定胎兒是否在單基因疾病相關的單基因中具有基因缺失或重復型遺傳突變。對此，當所述母體遺傳變異是缺失型且變異區(qū)域的第一比率小于非變異區(qū)域的第二比率時，可確定胎兒在單基因中具有缺失型遺傳變異。另一方面，當所述母體遺傳變異是重復型且變異區(qū)域的第一比率大于非變異區(qū)域的第二比率時，可確定胎兒在單基因中具有重復型遺傳變異。例如，當具有單基因遺傳變異的婦女懷有男性胎兒時，血清DNA讀碼深度與基因組DNA讀碼深度的比率(相對讀碼深度：γ)隨胎兒是否具有單基因遺傳變異而不同，且隨胎兒單基因遺傳變異類型(如果存在)的不同而不同(參見表5)。從表5可見，當胎兒具有缺失型突變時，變異區(qū)域中的γ比正常區(qū)域中的小。當胎兒不具有缺失型突變時，變異區(qū)域中的γ比正常區(qū)域中的大。當胎兒具有重復型突變時，變異區(qū)域中的γ比正常區(qū)域中的大。另一方面，當胎兒不具有重復型突變時，變異區(qū)域中的γ比正常區(qū)域中的小。對于具有缺失型遺傳突變的母體，當變異區(qū)域的第一比率小于非變異區(qū)域的第二比率時，確定胎兒在單基因中具有缺失型遺傳突變。當母體具有重復型遺傳突變，并且變異區(qū)域的第一比率大于非變異區(qū)域的第二比率時，可確定胎兒在單基因中具有重復型遺傳突變。更詳細地，當將具有缺失型突變的母體的第一比率與第二比率進行比較時，可從單基因變異區(qū)域中的相對讀碼深度小于單基因非變異區(qū)域中的相對讀碼深度的比較結果，預測胎兒可能具有單基因遺傳變異。另一方面，可從單基因變異區(qū)域中相對讀碼深度大于單基因中非變異區(qū)域中的讀碼深度的比較結果，預測胎兒可能不具有單基因遺傳變異。對于具有重復型突變的母體，當將所述第一比率和第二比率進行比較時，可從單基因變異區(qū)域中的相對讀碼深度大于單基因非變異區(qū)域中的相對讀碼深度的比較結果，預測胎兒具有單基因遺傳變異。相反，可從單基因變異區(qū)域中相對讀碼深度小于單基因非變異區(qū)域中的相對讀碼深度的比較結果，預測胎兒不具有單基因遺傳變異。如上文所述，本發(fā)明的方法是通過確定母體是否具有單基因缺失或重復型突變之后，比較正常區(qū)域中的γ和變異區(qū)域中的γ進行的，從而可容易地確定所述單基因遺傳突變是否遺傳給胎兒，即確定胎兒是否具有單基因遺傳突變。如此以來，根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的方法被設計為通過使用新一代測序方法分析母體血清DNA和基因組DNA來精確地預測胎兒的單基因突變。因此，本發(fā)明可通過使用母體血清DNA確定胎兒在單基因中的缺失或重復型遺傳突變而提供有關胎兒單基因疾病的診斷信息。通過以下實施例可獲得對本發(fā)明更好的理解，提供以下實施例是為了舉例說明，不應理解為是對本發(fā)明的限制。實施例1：胎兒單基因遺傳變異的預測<1-1>母體血清DNA測序選擇X染色體連鎖的隱性疾病作為本實驗中處理的單基因疾病。假設懷孕中的母體血清DNA在某些區(qū)域具有會引起遺傳疾病的重復型突變。假設母體的目標測序覆蓋范圍約為95％，平均血清DNA讀碼深度約為100，平均基因組DNA讀碼深度約為100。<1-2>遺傳變異類型和區(qū)域的鑒定為鑒定單基因突變的類型和區(qū)域，使用CBS算法計算并處理讀碼深度的移動平均值。由此，確定區(qū)域并發(fā)現(xiàn)母體具有重復型突變。<1-3>胎兒DNA分數(shù)的測量如實施例<1-1>中所述測量母體DNA的胎兒DNA含量。為此，使用含有捕獲探針的AgilentSureSelectCustom試劑盒來捕獲ZFX和ZFY基因，所述捕獲探針靶向ZFX(X連鎖的鋅指蛋白)和ZFY(Y連鎖的鋅指蛋白)區(qū)域。胎兒DNA分數(shù)：其中，ZFX′和ZFY′是總的匹配讀碼的數(shù)目除以探針數(shù)目的商。使用ZFX和ZFY基因預測胎兒DNA分數(shù)(f)的結果示于下表1中。表1從表1可見，母體I-1的血清中的胎兒DNA分數(shù)是8.6％，母體I-2的血清中的胎兒DNA分數(shù)是6.4％。<1-4>雜合單核苷酸多態(tài)性的等位基因頻率的預測假設各母體為重復型突變攜帶者且懷有男性胎兒，可使用胎兒DNA分數(shù)f根據(jù)以下方程1獲得單基因變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率(θexp/aff)并根據(jù)以下方程2獲得單基因非變異區(qū)域中雜合SNP的等位基因頻率(θexp/unaff)：<方程1>θexp/aff＝2/(3-f)<方程2>θexp/unaff＝2(1-f)/(3-2f)圖1中繪制了等位基因頻率相對胎兒DNA分數(shù)的圖。上面的直線表示具有單基因突變的胎兒而下面的直線表示不具有單基因突變的胎兒。沿上面直線的灰色區(qū)域表示由變異區(qū)域中12個SNP的等位基因頻率而計算的置信區(qū)間和由連續(xù)的6和3個SNP的隨機樣品計算的100個循環(huán)(round)而獲得的標準誤差。將實施例1-3中計算的胎兒DNA分數(shù)代入方程，預測的等位基因頻率如下表2所示。表2項目母體I-1母體1-2胎兒DNA分數(shù)(f，％)8.604％6.484％θexp/aff(具有基因突變的胎兒)0.68635120.6813939θexp/unaff(不具有基因突變的胎兒)0.64638320.6516068＜1-5>具有單基因突變的DNA區(qū)域中雜合SNP的平均等位基因頻率(θobs)的測量可從母體血清DNA的新一代測序數(shù)據(jù)中，通過對各等位基因的數(shù)目進行計數(shù)來計算具有單基因突變的DNA區(qū)域中雜合SNP的平均等位基因頻率(θobs)。來自實施例的數(shù)據(jù)的計算結果示于下表3中。表3由于表3中計算的SNP的平均等位基因頻率(θobs)更接近表2中計算的突變區(qū)域的θexp/aff值，因而可預測所述母體懷有的胎兒具有單基因遺傳突變。實施例2：胎兒單基因遺傳變異的預測<2-1>母體血清DNA的測序假設母體具有會引起隱性遺傳疾病的缺失型突變且懷有男性胎兒。使用與實施例1-1中相同的方式，使用大規(guī)模平行測序(一種新一代測序)分析所述母體的血清DNA和基因組DNA。母體的目標測序覆蓋范圍為約97.7％，平均血清DNA讀碼深度為約465至約530，平均基因組DNA讀碼深度約為1210。<2-2>遺傳變異類型和區(qū)域的鑒定為鑒定單基因突變的類型和區(qū)域，計算讀碼深度的移動平均值并應用CBS算法。<2-3>胎兒DNA分數(shù)的測量根據(jù)記載于實施例<1-3>中的方法測量母體DNA的胎兒DNA含量。將所述測量結果示于下表4中。表4從表4可見，母體II-1的血清中的胎兒DNA分數(shù)是5.4％，母體II-2的血清中的胎兒DNA分數(shù)是7.3％。<2-4>正常(非變異)和變異區(qū)域中血清DNA和血球DNA(基因組DNA)之間的讀碼深度的比率假設各母體為單基因突變攜帶者且懷有男性胎兒，根據(jù)胎兒是否具有單基因突變，可預測血清DNA讀碼深度與基因組DNA讀碼深度的比率，如表5所示。表5f：胎兒DNA分數(shù)從表5可見，當胎兒具有缺失型突變時，變異區(qū)域中的γ比正常區(qū)域中的小。另一方面，當胎兒不具有缺失型突變時，變異區(qū)域中的γ比正常區(qū)域中的大。因此，當母體單基因突變是缺失型時，可通過比較正常區(qū)域和變異區(qū)域之間的γ來確定從母體至胎兒的單基因突變的遺傳性，即確定胎兒是否具有單基因突變。此外，當胎兒具有重復型突變時，變異區(qū)域中的γ比正常區(qū)域中的γ大。另一方面，胎兒不具有重復型突變時，變異區(qū)域中的γ比正常區(qū)域中的γ小。因此，當母體單基因突變是重復型時，可通過比較正常區(qū)域和變異區(qū)域之間的γ來確定從母體至胎兒的單基因突變的遺傳性，即確定胎兒是否具有單基因突變?；谒鲱A測，對正常和變異區(qū)域中血清DNA讀碼深度與血球DNA讀碼深度的比率進行了比較。實驗結果是，母體II-1的正常區(qū)域和變異區(qū)域中的相對讀碼深度(γ)分別是0.99632和1.06031。母體II-2的正常區(qū)域中的相對讀碼深度(γ)是0.99647，變異區(qū)域中的相對讀碼深度(γ)是1.07075。將母體II-2的相對讀碼深度(γ)示于圖2中。在圖2中，X軸表示X染色體上的核苷酸位置而Y軸表示相對讀碼深度(γ)。示出了變異區(qū)域(實心圓)和非變異區(qū)域(空心圓)中的讀碼深度比率，并給出了各區(qū)域的代表值(虛線)。對于具有缺失型突變的母體II-1，預測胎兒是正常的，因為變異區(qū)域中的相對讀碼深度比正常區(qū)域中的相對讀碼深度大。當前第1頁1 2 3