用于生成生物分子和核酸的結合信息的標記物及其制備方法，利用上述標記物的生物分 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于生成在由生物分子組成的生物試樣中的生物分子和分析單鏈核酸的結合信息的基準物質(zhì)及核酸芯片，其制備方法及利用它們的生物分子分析方法，基準物質(zhì)及核酸芯片能夠使用于分析生物分子的生物學意義。并且，本發(fā)明涉及用于生成生物分子與配體之間的結合信息的外部標記物和生物芯片的制備方法及利用它們的生物分子分析方法。本發(fā)明的外部標記物及生物芯片能夠使用于分析生物分子的生物學意義的領域。
【專利說明】
用于生成生物分子和核酸的結合信息的標記物及其制備方 法，利用上述標記物的生物分子分析方法及裝置
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及預測在由生物分子組成的生物試樣中的生物分子的生物學意義的基 準物質(zhì)及核酸芯片，它們的制備方法及利用它們的生物分子分析方法及裝置，并且，涉及用 于生成生物分子與配體之間的結合信息的外部標記物及生物芯片的制備方法及利用它們 的生物分子分析方法。
【背景技術】
[0002] 生產(chǎn)組成生物試樣的許多生物分子(蛋白質(zhì)及碳水化合物）的實驗方案的技術隨 著物理學、生物化學及生物信息學的發(fā)展而廣泛開發(fā)，但由于對現(xiàn)有方法或設備的使用及 維護費、容易性、準確度、敏感度、檢查時間及過程的自動化等問題，對有效的新方法及裝置 的必要性非常高。
[0003] 在包括生物分子的生物試樣中，綜合它們的生物分子的定量狀態(tài)的信息，即，生產(chǎn) 生物分子的實驗方案(profile)的方法，其本身不是最終目標，而是用于實現(xiàn)目標的一種手 段，但是由于能夠有用地使用于微生物、細胞及組織等，因此廣泛地應用于醫(yī)學、獸醫(yī)學、環(huán) 境工程學、食品工程學及農(nóng)業(yè)等。
[0004] 用于對利用生物試樣中的生物分子的實驗方案的生物學意義進行分析的臨床決 策支持系統(tǒng)(Clinical Decision Support System)為用于支持醫(yī)生在患者診療過程中對 診斷和治療做決定的(Decision Making)過程的系統(tǒng)。臨床決策支持系統(tǒng)分為基于機器學 習的案例推理系統(tǒng)（Case Based Machine Learning Inference System)和專家系統(tǒng) (Expert System)兩大類?；跈C器學習的案例推理系統(tǒng)在收集判定出疾病的患者們的臨 床信息(Clinical Informat ion)及生物學信息，即生物分子實驗方案數(shù)據(jù)之后，能夠利用 機器學習，通過現(xiàn)有的臨床信息和生物學信息等來推理或辨別疾病的系統(tǒng)。專家系統(tǒng)為醫(yī) 學專家使用事先設定的規(guī)則(Rule)來診斷疾病的系統(tǒng)。
[0005] 核酸為核苷酸以共價鍵合方式相連接的線性多聚體，核苷酸作為小的有機化合 物，是磷酸、糖及嘌呤(腺嘌呤或鳥嘌呤）或嘧啶(胞嘧啶、胸苷及尿嘧啶）。核酸以單鏈或雙 鏈的形式存在，單鏈核酸在特定的物理條件下通過核苷酸之間的氫鍵及相互作用來結合， 并生成獨特的立體結構，而這種立體結構由單鏈的堿基序列決定。
[0006] -般來說，脫氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)之類的核酸雖然為用于發(fā)現(xiàn)具有 細胞結構及酶等活性的蛋白質(zhì)的信息的儲存體，但是自從1982年有報告指出核糖核酸生成 特定的結構，從而具有酶的活性之后，有很多關于核酸的結構上的特性和對其特定功能的 報告。
[0007] 核酸由四個堿反復組成，來維持高的多樣性，并生成很多立體結構，而這種立體結 構通過與特定物質(zhì)相互作用，來生成復合物并實現(xiàn)穩(wěn)定化。
[0008 ]核酸能夠作為一種單鏈核酸（1 i gan d)來作用于包含蛋白質(zhì)的分子，按多種堿基順 序排列的單鏈核酸從組合的庫中通過規(guī)定的篩選過程和堿基序列決定來篩選以高的結合 力和特殊性與特定物質(zhì)相結合的核酸。
[0009] 篩選與特定物質(zhì)相結合的核酸的方法被稱為指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術 (SELEX,Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)，篩選的核酉愛被 稱為所謂的適配體（aptamer)(Tuerk C.and Gold L.;Science，249，pp505_510，1990)〇
[0010] 通過這種指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術來篩選能夠在自然狀態(tài)下與核酸相結合 的蛋白質(zhì)或能夠以非常高的親和力與包含未與核酸相結合的蛋白質(zhì)的多種生物分子相結 合的核酸(適配體）。
[0011] 但是，通過現(xiàn)有的指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術的核酸篩選方法作為在篩選與特 定物質(zhì)(例如，蛋白質(zhì))特別地相結合的核酸之前，大量生產(chǎn)相關蛋白質(zhì)(特定物質(zhì)），并在實 施純化之后，使單鏈核酸庫與所生產(chǎn)的蛋白質(zhì)發(fā)生反應，并通過反復實施選擇和擴增來選 定結合力強的核酸(適配體)的方法，必須確保用于篩選核酸的優(yōu)先特定物質(zhì)。因此，通過現(xiàn) 有的指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進化技術的核酸篩選方法完全沒有認識到從包含于生物試樣的 許多未知的生物分子組體中篩選并利用作為具有意義的組體的核酸的技術思想。生物分 子-單鏈核酸的選擇能夠以多種方法進行，具有通過固定生物分子來收獲并清洗復合物的 方法及毛細管電泳方法等。
[0012] 包含組成生物試樣的組織、細胞塊、細胞及微生物等未知分子的生物分子的實驗 方案通過利用物理、化學性質(zhì)來，以多種方法制成，一般通過利用生物分子的分子量或pi值 等進行電泳，從而在生物試樣中確認生物分子的定量狀態(tài)的生物分子的實驗方案。
[0013] 并且，執(zhí)行通過分析實驗方案來決定生物分子并對此進行分離之后，通過基質(zhì)輔 助激光解吸電離飛行時間（MALDI_T0F，Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight)等來確認這些組成成分的方法等。最近，根據(jù)表面增強激光解離飛行時間 質(zhì)譜技術（SELDI-TOFMS，Surface-enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry)進行針對蛋白質(zhì)實驗方案的很多研究(Adam et al.，Cancer Research,62,3609-3614.2002；Li et al.,Clinical Chemistry,48,1296-1304.2002；and Petricoin et al.，The Lancet，359,572_577.2002)〇
[0014] 并且，最近通過對蛋白質(zhì)組的高通量篩選技術(High Throughput Screening)來 開發(fā)并使用蛋白質(zhì)芯片(Protein chip)或適配體芯片(Aptamer chip)(Smith et al.，Mol Cell Protomics,11-18.2003；and McCauley et al.,Anal Biochem,319(2),244-250.2003)。使用于這種高通量篩選技術的載體具有載玻片、生物傳感器的檢測表面、微珠 及納米粒子等。
[0015] 由于蛋白質(zhì)芯片了解抗體的排列狀態(tài)，因此可以對特定物質(zhì)的區(qū)分及定量進行探 索及分析。蛋白質(zhì)芯片的制備方法具有利用微陳列（Microarrayer)來對抗體進行點樣 (spotting)來固定的方法。蛋白質(zhì)芯片檢測技術應由蛋白質(zhì)芯片作為一個芯片，能夠檢測 在各種抗體以高密度堆積于用于通過一種芯片盡可能提供很多信息的窄的面積的狀態(tài)下 所發(fā)生的非常弱的信號。并且，隨著對蛋白質(zhì)的生物體信息增加，其堆積度也以更高的趨勢 發(fā)展，因此需要能夠以定量性的方式對此進行迅速且準確的檢測的新方法。
[0016] 到目前為止，檢測方法主要使用激光感生熒光法（laser induced fluorescence)，并正在開發(fā)電化學檢測方法等。通過如上所述的多種過程，雖然正在開發(fā) 在利用蛋白質(zhì)芯片的生物試樣中分析特定蛋白質(zhì)的實驗方案的方法，但由于使用高價的設 備及試劑，因而存在需執(zhí)行復雜的過程等問題，并且具有僅限于對制備抗體的分子進行制 備的界限。
[0017] 適配體芯片在將適配體(核酸)使用于蛋白質(zhì)芯片來代替使用抗體，在這一方面不 同，而在除此之外的其他要素方面非常類似。
[0018] 如上所述，雖然正在開發(fā)在利用蛋白質(zhì)芯片及適配體芯片的生物試樣中生產(chǎn)生物 分子的定量狀態(tài)，即，實驗方案的方法，但存在使用高價的設備及試劑，且需執(zhí)行復雜的過 程等問題。尤其，到目前為止的蛋白質(zhì)芯片或適配體芯片僅限于對能夠制備抗體或適配體 的已知的蛋白質(zhì)進行有限的制備。
[0019] 已知，生物試樣由數(shù)百萬個蛋白質(zhì)組成，但當前公認的的蛋白質(zhì)的數(shù)僅為數(shù)萬個， 因此，非常需要在生物試樣中生產(chǎn)未知的蛋白質(zhì)等未知的生物分子的定量狀態(tài)，即，實驗方 案的技術。
[0020] 本發(fā)明人雖然提出了生產(chǎn)對蛋白質(zhì)組的實驗方案的顛倒-指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進 化技術(reverse-SELEX)(參照韓國特許登錄10-0670799號）、基于適配體核酸芯片(參照韓 國特許登錄第10-0464225)及利用基于適配體核酸芯片的生物學意義分析技術(參照韓國 特許登錄第10-0923048號)等，但由于在進行生產(chǎn)蛋白質(zhì)組實驗方案的高通量篩選技術時， 無法提出適當?shù)幕鶞饰镔|(zhì)及質(zhì)量控制（qua 1 ity contro 1)方案，因而存在無法可能無法對 實驗方案生產(chǎn)及分析進行適當?shù)馁|(zhì)量控制的問題，而本發(fā)明為了解決此現(xiàn)象而提出。
[0021] 總體分析生物試樣的生物分子的研究能夠通過分析在醫(yī)學方面與疾病相關的生 物分子的實驗方案，來用于查明能夠診斷疾病的生物分子、能夠分析治療性的生物分子、對 疾病的發(fā)病及進行起到重要作用的生物分子、與疾病的感受性相關的生物分子及新藥開發(fā) 的靶分子。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0022] 技術問題
[0023] 本發(fā)明的目的在于，提供既能進行內(nèi)部質(zhì)量控制，又能用于與由兩種或兩種以上 生物分子組成的生物試樣中的生物分子生成分析單鏈核酸的結合信息的基準物質(zhì)、核酸芯 片、它們的提供方法及利用它們的生物分子分析方法及裝置，并且從利用它們來有效地生 成的結合信息中分析包括相關生物分子的疾病信息的各種生物學意義。
[0024] 并且，本發(fā)明的另一目的在于，提供能夠生成包含于生物試樣的生物分子與配體 之間的結合信息的外部標記物及生物芯片，從而從利用它們來有效地生成的結合信息中分 析包括相關生物分子的疾病信息的各種生物學意義。
[0025] 技術方案
[0026] 所要實現(xiàn)這些目的的本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，在通過核酸分 析方法對與生物試樣中的生物分子相結合的分析單鏈核酸進行分析的同時，通過核算分析 方法對與質(zhì)量控制用的外部基準物質(zhì)相結合的單鏈核酸進行分析，從而實現(xiàn)內(nèi)部質(zhì)量控 制；其中，上述生物試樣包含從由隨機堿基序列組成的隨機單鏈核酸所構成的核酸庫中選 定的兩種或兩種以上的生物分子。
[0027]并且，本發(fā)明提供核酸芯片，其特征在于，使用本發(fā)明的結合單鏈核酸及質(zhì)量控制 單鏈核酸的堿基序列來合成的捕獲探針固定于載體，并生成用于選定分析單鏈核酸的結合 單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸的結合信息。
[0028] 并且，本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，通過使用上述本發(fā)明的分析單 鏈核酸來使用用于分析上述生物試樣中的生物分子的上述質(zhì)量控制基準物質(zhì)，并通過核酸 分析方法來分析上述質(zhì)量控制單鏈核酸，并進行內(nèi)部質(zhì)量控制。
[0029] 并且，本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，利用以混合分析靶探針和比較 靶探針的方式制備的靶探針來分析上述核酸芯片，上述分析靶探針以使生物試樣中的生物 分子與分析單鏈核酸發(fā)生反應的方式制備，上述比較靶探針以使對照組生物試樣中的生物 分子與上述分析單鏈核酸發(fā)生反應的方式制備。
[0030] 并且，本發(fā)明提供核酸芯片，其特征在于，組成為使用分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控 制單鏈核酸的堿基序列來制備的捕獲探針固定于載體的結構，并使用于生成用于分析上述 生物試樣中的生物分子的生物學意義的上述生物分子和上述分析單鏈核酸的結合信息。
[0031] 并且，本發(fā)明提供基準物質(zhì)，其特征在于，由不包含于生物試樣的外源分子組成， 使用在用于通過上述分析單鏈核酸來分析上述生物試樣中的生物分子的生物學意義的分 析過程的質(zhì)量控制及包含于生物試樣的生物分子的定量分析。
[0032] 并且，本發(fā)明提供生物分子分析試劑盒，其特征在于，使用用于分析上述生物試樣 中的生物分子的生物學意義的上述分析單鏈核酸及上述基準物質(zhì)。
[0033] 并且，本發(fā)明提供生物分子分析裝置，其特征在于，通過利用分析單鏈核酸及上述 基準物質(zhì)的生物分子分析方法來分析上述生物分子，并包括試樣處理裝置和擴增裝置的分 析生物分子的系統(tǒng)，上述試樣處理裝置用于準備上述生物試樣中的生物分子，上述擴增裝 置由制備上述生物分子-單鏈核酸復合物，并擴增上述生物分子-單鏈核酸復合物的模塊及 對上述擴增的產(chǎn)物進行分析的模塊組成。
[0034] 有益效果
[0035] 根據(jù)上述所述的本發(fā)明的基準物質(zhì)、核酸芯片及由利用它們的兩種或兩種以上生 物分子組成的生物試樣中的生物分子分析方法，能夠利用高通量篩選技術的非常簡單且低 廉并有效的方法及裝置來生產(chǎn)包含微生物、細胞及蛋白質(zhì)的生物試樣所包含的生物分子的 實驗方案，因此，能夠期待作為分析生物分子的生物學意義的工具來應用于醫(yī)學、獸醫(yī)學、 環(huán)境工程學、食品工程學及農(nóng)業(yè)等廣泛的領域。
[0036] 并且，根據(jù)本發(fā)明的外部標記物、生物芯片及利用它們的生物分子分析方法，能夠 利用高通量篩選技術的非常簡單且低廉并有效的方法來生產(chǎn)包含微生物、細胞及蛋白質(zhì)的 生物試樣所包含的生物分子的實驗方案，因此，能夠期待作為分析生物分子的生物學意義 的工具來應用于醫(yī)學、獸醫(yī)學、環(huán)境工程學、食品工程學及農(nóng)業(yè)等廣泛的領域。
[0037] 并且，根據(jù)本發(fā)明的外部標記物、生物芯片及利用它們的生物分子分析方法，能夠 在分析生物分子的生物學意義的過程中，不僅掌握未知的生物分子的生物學作用，決定并 查明其結構，而且能夠篩選特殊性地與生物分子相結合的特定單鏈核酸，并提供能夠作為 利用所篩選的靶單鏈核酸來掌握更加精巧的生物分子的作用的工具的環(huán)境。
[0038] 并且，根據(jù)利用本發(fā)明的外部標記物及生物芯片的生物分子分析方法，通過分析 在醫(yī)學方面與疾病相關的生物分子的實驗方案，能夠以非常低廉且簡便的方法有效地查明 能夠診斷疾病的生物分子、能夠分析治療性的生物分子、對疾病的發(fā)病及進行起到重要作 用的生物分子、與疾病的感受性相關的生物分子及新藥開發(fā)的祀分子等。
【附圖說明】
[0039] 圖1為示出基于從由上述兩種或兩種以上生物分子組成的生物試樣中的生物分子 及基準物質(zhì)決定生物分子結合單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸的單鏈核酸的堿基序列，將上 述制備的核酸芯片使用于分析單鏈核酸決定，利用通過分析單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸 來制備的核酸芯片，分析生物試樣中的生物分子的生物學意義的一系列過程的圖。
[0040] 圖2為示出利用上述生物分子結合單鏈核酸和質(zhì)量控制單鏈核酸來制備核酸芯 片，并決定上述分析單鏈核酸的一系列過程的圖。
[0041] 圖3為示出利用上述分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸來制備在生物試樣中 分析生物分子的生物學意義的核酸芯片，從而生成在生物試樣中的生物分子和上述分析單 鏈核酸的結合實驗方案的一系列過程的圖。
[0042]圖4為示出在通過使用由分析單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸來制備的核酸芯片， 來分析包含于生物試樣中的生物分子的生物學意義的過程中，利用基準物質(zhì)I進行質(zhì)量控 制的一系列過程的圖。
[0043]圖5為示出在通過使用由分析單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸來制備的核酸芯片， 來分析包含于生物試樣中的生物分子的生物學意義的過程中，利用基準物質(zhì)II進行質(zhì)量控 制的一系列過程的圖。
[0044] 圖6為示出與相應于基準物質(zhì)的質(zhì)量控制單鏈核酸相應的點的圖。
[0045] 圖7為示出通過利用由本發(fā)明的核酸芯片生成的人類血清蛋白質(zhì)實驗方案的數(shù)據(jù) 庫及人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法的程序，來診斷疾病的過程的圖。
[0046] 圖8為示出通過利用本發(fā)明的基準物質(zhì)及核酸芯片來生成的人類血清蛋白質(zhì)實驗 方案的數(shù)據(jù)庫及人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法的程序，來診斷心血管疾病的結果的圖。
[0047] 圖9為示出通過利用本發(fā)明的基準物質(zhì)及核酸芯片來生成的人類血清蛋白質(zhì)實驗 方案的數(shù)據(jù)庫及人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法的程序，來診斷肝癌的結果的圖。
[0048] 圖10為示出通過利用本發(fā)明的基準物質(zhì)及核酸芯片來生成的人類血清蛋白質(zhì)實 驗方案的數(shù)據(jù)庫及人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法的程序，來診斷肝癌的轉(zhuǎn)移性的結果的圖。
[0049] 圖11為示出通過利用本發(fā)明的基準物質(zhì)及核酸芯片來生成的人類血清蛋白質(zhì)實 驗方案的數(shù)據(jù)庫中，決定特殊性地存在于心肌梗塞患者的血清的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的過 程的順序的圖。
[0050] 圖12為在利用本發(fā)明的基準物質(zhì)及核酸芯片來生成的人類血清蛋白質(zhì)實驗方案 的數(shù)據(jù)庫中，決定特殊性地存在于心肌梗塞患者的血清的蛋白質(zhì)的氨基酸序列的圖。
[0051] 圖13為示出單鏈核酸與小細胞肺癌細胞株相結合的結果的圖，上述單鏈核酸通過 生產(chǎn)及分析來確保利用本發(fā)明的核算芯片來生成的小細胞肺癌細胞株的表面生物分子。
[0052] 圖14為示出生物分子結合單鏈核酸的特殊性的圖，上述生物分子結合單鏈核酸通 過生產(chǎn)及分析利用本發(fā)明的核酸芯片的大腸菌KCTC12006及沙門氏菌（Salmonella typhimurium ATCC13311)的表面生物分子實驗方案來確保。
[0053] 圖15為示出通過利用以特殊性的方式與利用本發(fā)明的核酸芯片來選定的大腸菌 相結合的生物分子結合單鏈核酸和納米金粒子，來在唄大腸菌污染的食物中測定污染程度 的結果的圖。
[0054] 圖16為示出通過利用本發(fā)明的外部標記物及生物芯片，來生成生物學意義的過程 的簡圖。
[0055] 圖17為示出決定與本發(fā)明的生物芯片的制備方法相關的生物分子結合單鏈核酸 的過程的簡圖。
【具體實施方式】
[0056] 本發(fā)明提供用于生成配體和生物分子的結合信息的外部標記物及生物芯片的制 備方法及利用它們的生物分子分析方法，本發(fā)明的外部標記物及生物芯片能夠用于分析包 含于生物試樣的生物分子的生物學意義。
[0057] 使用于本發(fā)明的術語的定義如下。即外部標記物作為不包含于所要分析的生物試 樣中的物質(zhì)的外源分子，能夠使用于生物芯片的質(zhì)量控制及定量分析。
[0058]捕獲探針為具有與生物分子及外部標記物相結合的配體信息，并固定于生物芯片 的分子。
[0059]靶探針作為與捕獲探針相結合的分子，能夠組成為分析靶探針和比較靶探針的混 合形態(tài)或由分析靶探針組成。分析靶探針可以為與在分析生物試樣的生物分子相結合的配 體來源的分析靶探針，比較靶探針可以為與在比較生物試樣的生物分子相結合的配體來源 或人為的來源或在與生物分子及外部標記物相結合的配體中人為地制備的比較靶探針。優(yōu) 選地，靶探針由分析靶探針和比較靶探針組成。
[0060] 標記物靶探針與標記物分子相應的捕獲探針相結合，并作為來源于與外部標記物 相結合的配體的分子，根據(jù)使用目的，能夠分為分析標記物靶探針和比較標記物靶探針。
[0061] 結合信息意味著由點組成的實驗方案或各個點的熒光程度，上述點與組成生物芯 片的捕獲探針相應。
[0062] 本發(fā)明的外部標記物及生物芯片的制備方法包括:第一步驟，決定不包含于所要 分析的生物試樣的生物分子，并利用所決定的外源生物分子來制備外部標記物;第二步驟， 決定與生物分子及外部標記物相結合的配體;第三步驟，決定用于分析生物學意義的配體； 以及第四步驟，通過對使用所決定的上述配體信息來組成的捕獲探針進行合成，將上述捕 獲探針固定于基板。
[0063] 本發(fā)明的外部標記物的制備方法如下。在通過生物芯片來檢查生物試樣的情況 下，對轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組等的檢查為代表性的例。在分析轉(zhuǎn)錄組的情況下，作為內(nèi)部標記物 的甘油酸 _3_磷酸脫氫酶(GAPDH，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)或肌動蛋 白信使核糖核酸(Actin mRNA)等使用于質(zhì)量控制，但沒有以突出的定量分析為目的的內(nèi)部 標記物。并且，在分析蛋白質(zhì)組的情況下，沒有有用的內(nèi)部標記物。因此，在分析蛋白質(zhì)組的 情況下，對質(zhì)量控制及定量分析有很多困難。因此，本發(fā)明要提出當通過使用外部標記物來 分析生物試樣時，能夠有用地使用的質(zhì)量控制及定量分析方法。
[0064] 在通過不包含于所要分析的生物試樣的物質(zhì)（或分子)來分析人類來源生物試樣 的情況下，外部標記物能夠使用例如植物特殊生物分子作為不包含于人類來源生物試樣的 生物分子。目前已結束了作為人類基因組項目及作為植物之一的擬南芥（Arabidopsis thaliana)基因組項目，并報告植物特異蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中分析人類來源生物試樣的情況 下，能夠使用植物特異蛋白質(zhì)作為外部標記物。
[0065] 并且，本發(fā)明的與生物分子相結合的配體如下。
[0066] 與生物分子及外部標記物相結合的配體具有抗體、肽、單鏈核酸及適配體等。
[0067] 當使用適配體(與生物分子以三級結構相結合的單鏈核酸)作為與包含于生物試 樣的生物分子相結合的配體的情況下，決定生物分子結合單鏈核酸的方法使包含生物分子 的生物試樣與具有隨機堿基序列的隨機單鏈核酸發(fā)生反應，來決定與上述生物分子相結合 的生物分子結合單鏈核酸的反轉(zhuǎn)指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進化技術(REVERSE-SELEX)(參照 韓國特許登錄第10-0923048號），與外部標記物相結合的配體能夠通過指數(shù)式富集的配體 系統(tǒng)進化(SELEX)來決定。在本發(fā)明中，適配體唄稱為分析單鏈核酸或生物分子結合單鏈核 酸等。
[0068] 并且，用于分析本發(fā)明的生物學意義的生物芯片的制備方法能夠包括以下步驟來 制備，即，通過使用被決定的生物分子結合單鏈核酸、外部標記物結合單鏈核酸的堿基序列 及選自它們中的互補的堿基序列中的至少一種堿基序列來合成的捕獲探針固定于基板。
[0069] 本發(fā)明的利用生物芯片決定具有生物學意義的配體的方法包括:準備生物芯片的 步驟;使生物分子結合單鏈核酸與生物試樣中的生物分子發(fā)生反應，來組成生物分子-單鏈 核酸復合物并分離上述生物分子-單鏈核酸復合物的步驟;從所分離的上述生物分子-單鏈 核酸復合物中分離、擴增及標記單鏈核酸，來制備分析靶探針的步驟;使標記的分析靶探針 和比較靶探針的混合靶探針與生物芯片的捕獲探針發(fā)生反應，通過上述標記來獲得結合信 息的步驟；以及通過比較所獲得的實驗方案和已確保的結合信息數(shù)據(jù)來分析上述生物分子 的生物學意義的步驟。
[0070] 將利用本發(fā)明的外部標記物及生物芯片來生成生物學意義的過程的示意圖示出 于圖16中。
[0071]若說明利用本發(fā)明的外部標記物、生物芯片及利用它們的生物分子分析方法的基 本原理，則將包含與生物分子及外部標記物相結合的單鏈核酸的堿基序列信息的捕獲探針 固定于生物芯片，使得作為實驗對象的生物分子和與此相結合的單鏈核酸發(fā)生反應，來組 成生物分子-單鏈核酸復合物之后，使得從上述復合物中制備的分析靶探針和與比較靶探 針相混合的靶探針發(fā)生反應，來獲得生物芯片的捕獲探針的結合實驗方案，并分析其特性， 從而最終分析與生物分子相結合的單鏈核酸的結合實驗方案特性。因此，若作為生物芯片 的捕獲探針捕獲互補地結合具有生物分子結合單鏈核酸的信息的靶探針，則當分析生物分 子時，通過擴增從生物分子-單鏈核酸復合物分離的單鏈核酸的過程來制備的分析靶探針 也以內(nèi)涵有與復合物的單鏈核酸的實驗方案信息相同或類似的信息的狀態(tài)生成，因此作為 本發(fā)明的生物芯片的捕獲探針分析靶探針也能夠達到預期目的。
[0072] 并且，獲得能夠了解上述生物分子的信息的結合信息的步驟能夠通過將組成上述 外部標記物的外源分子分別以不同的量添加于生物試樣中，來準備分析靶探針，或者，將具 有與組成上述外部標記物的外部分子相結合的配體信息的分析標記物靶探針分別以不同 的量與上述分析靶探針相混合并準備上述靶探針，來生成結合信息。比較靶探針能夠在池 中制備并使用，上述池由與生物分子相結合的配體和與外部標記物相結合的配體組成。
[0073] 若利用本發(fā)明的生物芯片來分析生物分子，則積累相關結合信息數(shù)據(jù)，由此，對生 物分子的生物學意義的分析做貢獻的特異的單鏈核酸自然顯現(xiàn)，從而能夠發(fā)掘?qū)Ψ治錾?分子具有意義的單鏈核酸。
[0074] 能夠適用本發(fā)明的生物芯片的上述生物試樣包含細菌、真菌類、病毒、細胞株及組 織等，作為能夠通過本發(fā)明的生物芯片來分析其生物學意義的生物分子為選自由蛋白質(zhì)、 碳水化合物、脂質(zhì)、多糖體、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體、酶及核酸(nuc 1 eotide)組成的 組中的一種以上的生物分子。
[0075] 本發(fā)明的生物芯片制備方法的第一步驟為使包含生物分子的生物試樣與具有隨 機堿基序列的單鏈核酸（以下稱為'隨機單鏈核酸'）發(fā)生反應，從而決定與未知的生物分子 相結合的靶單鏈核酸的步驟。
[0076] 優(yōu)選地，選定與包含于上述生物試樣的生物分子相結合的單鏈核酸的步驟包括： 使生物試樣的生物分子與單鏈核酸隨機發(fā)生反應，來制備生物分子-單鏈核酸復合物，在清 洗上述復合物之后，通過基于生物分子與單鏈核酸間的結合力的大小，來選擇規(guī)定結合力 以上的生物分子-單鏈核酸復合物，從所選擇的上述復合物中分離并擴增單鏈核酸的步驟； 以及將擴增的單鏈核酸插入于克隆用載體來確保單克隆，并決定其堿基序列，從而決定生 物分子結合單鏈核酸的步驟。
[0077] 上述生物分子_單鏈核酸復合物的選擇及擴增能夠反復執(zhí)行多次，但包含未知的 生物分子的生物試樣由許多生物分子組成，且它們的定量差異非常多樣，因此優(yōu)選地，與反 復執(zhí)行與生物分子相結合的單鏈核酸的選擇和擴增的環(huán)形方法相比，應利用執(zhí)行一次選擇 和擴增并強化清洗過程的線性方法制備上述生物分子結合單鏈核酸。
[0078] 具有上述隨機堿基序列的隨機單鏈核酸能夠在利用具有如下的隨機堿基序列的 單鏈脫氧核糖核酸寡核苷酸來制備雙鏈的脫氧核糖核酸之后，通過體外轉(zhuǎn)錄（in vitro transcription)來制備核糖核酸隨機單鏈核酸。
[0079] 5，-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N40 CATAACCCAGAGGTCGA TGGATCCCCCC-3 '
[0080] 其中，帶下劃線的堿基排列為核酸庫為固定部分，N40意味著A、G、T及C等堿基以相 同的濃度存在于各個位置。
[0081] 利用于聚合酶鏈式反應（PCR，Polymerase Chain Reaction)的FW引物（5'_ GGGGGAATTCTAATACGA CTCACTATAGGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGG-3 '）能夠與上述堿基排列的帶 劃下劃線的堿基的5'末端進行堿基結合，并包括用于噬菌體T7的核糖核酸聚合酶的啟動子 堿基序列。
[0082] 聚合酶鏈式反應的RE引物（5 ' -GGGGGGATCCATCGACCTCTGGGTTATG-3 '）能夠與上述 堿基排列的帶劃下劃線的堿基的3'末端進行堿基結合。
[0083]優(yōu)選地，在本發(fā)明的生物芯片制備方法中，生物分子結合單鏈核酸為包含2'-F_置 換嘧啶的核糖核酸單鏈核酸，通過體外轉(zhuǎn)錄來合成，并通過純化來準備。
[0084]所合成的隨機單鏈核酸能夠以例如以1015堿基序列/L的濃度處理于生物試樣，并 能與生物分子發(fā)生30分鐘的反應。
[0085] 上述祀單鏈核酸能夠?qū)⑼ㄟ^反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR，Reverse Transcription-PCR)來獲得的產(chǎn)物插入于克隆用載體，來確保大腸菌克隆并決定其堿基序 列。
[0086]此時，理想的反應溫度低于指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化執(zhí)行溫度，優(yōu)選地，在20°C至37 °C的溫度下執(zhí)行反應。
[0087]通常，防止過量處理蛋白質(zhì)及單鏈核酸來與生物分子相結合的單鏈核酸的非特異 性的結合，優(yōu)選地，可使用酵母轉(zhuǎn)運核糖核酸(yeast tRNA)、鮭魚精脫氧核糖核酸（salmon sperm DNA)或人類胎盤脫氧核糖核酸(human placental DNA)。
[0088] 在用于選定本發(fā)明的具有生物學意義的生物分子結合單鏈核酸的生物芯片的制 備方法中，第二步驟使用在第一步驟中決定的單鏈核酸及上述外部標記物結合單鏈核酸的 堿基序列和選自它們的互補的堿基序列中的至少一種堿基序列，來合成捕獲探針，通過將 所合成的捕獲探針固定于基板上，來制備本發(fā)明的生物芯片。
[0089] 由于捕獲探針為對雜交程度起非常大的影響的核心要素，因此其堿基序列結構的 決定非常重要。固定于本發(fā)明的生物芯片的各個捕獲探針由特殊的堿基組成，捕捉單鏈核 酸和革E單鏈核酸的結合物應維持適當?shù)慕怄湝囟?Tm)值。由此，結合物的雜交程度能夠借 助標記有熒光的靶探針來維持未被污染的自身的信號值。
[0090] 因此，捕獲探針的堿基序列能夠基于在上述第一步驟中從核酸庫的隨機單鏈核酸 篩選的生物分子結合單鏈核酸及外部標記物結合單鏈核酸的堿基序列來決定。具體地，捕 獲探針使用與核酸庫的隨機部分相關的40個核苷酸或其一部分，在使用一部分的情況下， 能夠追加人為的堿基序列。優(yōu)選地，捕獲探針為具有l(wèi)〇bp至20bp的堿基序列的寡核苷酸的 單鏈核酸。
[0091] 在利用生物芯片來分析生物試樣的情況下，使用雙重靶探針或單一靶探針作為靶 探針。通常，在分析轉(zhuǎn)錄組的情況下，將疾病部分來源生物試樣作為分析生物試樣，將正常 部分作為比較生物試樣，在前者制備分析靶探針，在后者制備比較靶探針，并在混合它們之 后使用為靶探針。但在沒有適當?shù)谋容^生物試樣的情況下，使用從分析生物試樣來源的單 一靶探針作為靶探針。
[0092]并且，本發(fā)明的比較靶探針可以為通過與捕獲探針互補的堿基序列核酸與生物分 子相結合的配體和從與外部標記物相結合的配體池合成的單鏈核酸。優(yōu)選地，比較靶探針 可以為具有80bp至140bp的堿基序列的寡核苷酸的單鏈核酸。
[0093] 標記物靶探針來源于與組成外部標記物的外源分子相結合的配體，根據(jù)用途，可 區(qū)分為分析標記物靶探針和比較標記物靶探針。在將外部標記物混合于生物試樣來準備分 析標記物靶探針的情況下，在制備分析靶探針的過程中一同制備，或者在不將外部標記物 與生物試樣相混合而使用的情況下，可通過制備能夠與外部標記物的捕獲探針相結合的分 析標記物靶探針，來混合于上述分析靶探針并使用。比較分析物靶探針可以在與生物分子 相結合的配體及與外部標記物相結合的配體池制備并使用。
[0094] 優(yōu)選地，本發(fā)明的靶探針可通過混合包含標記物靶探針的分析靶探針及包含標記 物靶探針的比較靶探針來使用。
[0095] 并且，在本發(fā)明的生物芯片制備方法中，可使用由玻璃、硅等無機物或丙烯酸類或 聚對苯二甲酸乙二醇酯（PET，poly ethyl ene terephta late)、聚碳酸酯（poly carbonate)、 聚苯乙稀(polystyrene)、聚丙稀(polypropylene)等高分子物質(zhì)制備的基板，優(yōu)選地，基板 為由玻璃制備的載玻片。此時，可使用被胺或醛基等涂敷的的基板。例如，使用作為涂敷有 氨基丙基硅烷(GAPS，Gamma Amino Propyl Si lane)的載玻片的UltraGAPSTM包被玻片 (Coated Slide)(康寧公司（Corning))來使上述捕獲探針以規(guī)定規(guī)則排列并固定，由此制 備生物芯片。
[0096]本發(fā)明的生物芯片的制備可使用微陳列系統(tǒng)(Microarrayer system)，將各個捕 獲探針溶解于緩沖液來調(diào)整濃度，此時，陳列內(nèi)的濕度保持在70 %至80 %來執(zhí)行點樣。點樣 的載玻片放置于加濕腔室(humidified chamber)之后，在紫外線鏈結箱(UV crosslinker) 執(zhí)行烘烤(baking)過程。
[0097]如上所述，本發(fā)明的生物芯片通過在相關技術領域中眾所周知的方法，在將捕獲 探針固定于載玻片之后，使載玻片直接離心分離并干燥之后，以阻隔光的狀態(tài)保管，直到使 用之前為止。
[0098] 可通過以往公知的多種方法（M ? schena ; DNA mi croarray ; a prac t i ca 1 approach，Oxford，1999)來制備捕獲探針規(guī)則排列的生物芯片。
[0099] 若本發(fā)明的生物芯片能夠通過相同或類似的程度的精密度來分析未知的生物分 子的生物學意義，則減少固定于生物芯片的捕獲探針的數(shù)量在生物芯片的制備費用及分析 的效率性方面更為優(yōu)選。
[0100] 由于這種理由，還可以包括分析各個捕獲探針對生物分子的生物學意義分析的貢 獻度，在能夠分析生物分子的生物學意義的范圍內(nèi)，基于分析的貢獻度來篩選捕獲探針，從 而減少固定于本發(fā)明的生物芯片的捕獲探針的數(shù)量的步驟。
[0101] 進而，本發(fā)明提供用于生成生物分子和分析單鏈核酸的結合信息的基準物質(zhì)、核 酸芯片，它們的制備方法及利用它們的生物分子分析方法和裝置，上述生物分子管理內(nèi)部 程度并在由兩種或兩種以上的生物分子組成的生物試樣中，本發(fā)明的基準物質(zhì)及核酸芯片 為了分析包含于生物試樣的生物分子的生物學意義而使用。
[0102] 上述核酸芯片用于同時分析一種或一種以上的物質(zhì)，是指固定有由核酸制備的探 針的載體。優(yōu)選地，載體可以為固體玻璃或尼龍基板。核酸芯片以制備于固體玻璃或尼龍基 板上的二維探針基質(zhì)的形態(tài)制備。優(yōu)選地，能夠在單一核酸芯片執(zhí)行盡可能多的特征的分 析，這是因為需要在單一基板中增加相當多的探針的密度及探針的數(shù)量。通常，具有小于 500nm的探針固定位置的（即，密度大于每一平方厘米400探針)微陳列為高密度微陳列，其 余的為"低密度"微陳列。通常，核酸芯片使用于將具有數(shù)百個至數(shù)十萬個的非常多的堿基 序列的核酸排列于小的空間，并通過被固定的已知的核酸與未知的核酸試樣之間的雜交 (hybridization)來得知對未知的試樣內(nèi)的核酸信息。核酸微陳列具有能夠通過代替現(xiàn)有 的印記雜交（Southern blot)、諾瑟雜交(Norther blot)、突然變異檢索等，能夠在最快的 時間內(nèi)同時檢索最少數(shù)百個以上的堿基序列部分的優(yōu)點。
[0103]通常，基準物質(zhì)作為用于實施定性定量分析、各種試驗、檢查時的比較的內(nèi)部質(zhì)量 控制物質(zhì)，本發(fā)明通過使用分析單鏈核酸來分析所要分析的由兩種或兩種以上的生物分子 組成的生物試樣中的生物分子，而這種定性及定量分析意味著用于進行內(nèi)部質(zhì)量控制的物 質(zhì)。理想地，上述基準物質(zhì)為始終以規(guī)定量存在于所要分析的試樣中的物質(zhì)，但在不是的情 況下，能夠使用作為不包含于試樣的物質(zhì)的外源物質(zhì)，優(yōu)選地，當所要分析的試樣為生物試 樣的情況下，能夠由不包含于上述生物試樣的外源生物分子組成。質(zhì)量控制意味著不使如 管理用試樣之類的外部基準，而對能夠通過每次的測定來獲得的一組檢查結果進行分析， 來管理測定值的精密度的內(nèi)部質(zhì)量控制。
[0104]在本發(fā)明中，將以單鏈核酸的堿基序列來預測穩(wěn)定的二維結構的單鏈核酸為結合 單鏈核酸，實施單鏈核酸的堿基序列通過使由兩種或兩種以上的生物分子組成的生物試樣 中的生物分子與作為由隨機堿基序列組成的隨機單鏈核酸的核酸庫發(fā)生反應來確保并決 定，并將選定為為了通過基于上述結合單鏈核酸來制備的核酸芯片來分析生物學意義而確 保的實驗方案的單鏈核酸命名為分析單鏈核酸。并且，將通過與上述基準物質(zhì)相結合的單 鏈核酸，以上述質(zhì)量控制為目的來決定的單鏈核酸稱為質(zhì)量控制單鏈核酸。這種單鏈核酸 都是適配體的一種。
[0105]本發(fā)明中，術語適配體(aptamer)意味著從低分子化合物至蛋白質(zhì)為止，具有能夠 以高的親和性和特殊性與多種受體相結合的特性的小的（20~60核苷酸)單鏈核酸(DNA或 RNA)碎片。適配體的開發(fā)通過被稱為指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化(SELEX)的方法在試管中實現(xiàn)。 指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化作為'Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment ' 的縮寫，于 1990年第一次被開發(fā)（Tuerk，C? and Gold，L?，1990，Systematic evolution of ligands by exponential enrichment：RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase.Science 249(4968)?505-510；Ellington?A.D.and Szostak?J.ff.? 1990?In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 346(6287)，818-822)，通過利用此方法獲得在特定分子具有高的結合力的核酸適配體。適 配體在對受體具有納米-皮米水準的高的結合力和選擇性的方面，被視為具有與抗體類似 的特性的核酸分子。適配體通過指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化在試管篩選。指數(shù)富集配基系統(tǒng)進 化的中心原理與以下的進化的概念相似，即，在多數(shù)以隨機方式存在的個體中，只有具有特 定形質(zhì)的個體生存，這樣生存的個體在其組體內(nèi)所占的比重逐漸變高，從而最終與支配組 體。但是在指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化中的個體為單鏈核酸，選擇壓力成為對特定受體的結合 力。因此，首先制備具有多數(shù)的隨機(random)序列的核酸庫，需要能夠挑出對被認為存在于 實施核酸庫內(nèi)的的特定受體具有高的結合力的個體的分劃過程，并以通過擴增挑出的適配 體來增加在核酸池內(nèi)的比率，接著需進行下一回合的選擇的方式需要進行擴增步驟。對于 適配體的指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化的具體方法及試劑/材料等已被公知(Marshal 1，K. A. and Ellington,A.D.,2000,In vitro selection of RNA aptamers.Methods Enzymol 318， 193-214；Fitzwater,T.and Polisky，B.，1996，A SELEX primer.Methods Enzymol267, 275-301)。并且，本發(fā)明人提出了通過使生物分子與核酸庫發(fā)生反應，來選定以特殊方式與 各個生物分子相結合的單鏈核酸的方法，實施生物與分子存在于由兩種或兩種以上的生物 分子組成的生物試樣中，實施隨機單鏈核酸由隨機堿基序列組成（韓國特許登錄第10-0923048號）。
[0106] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，在通過核酸分析方法對與生物試樣 中的生物分子相結合的分析單鏈核酸進行分析的同時，通過核算分析方法對與質(zhì)量控制用 的外部基準物質(zhì)相結合的單鏈核酸進行分析，從而實現(xiàn)內(nèi)部質(zhì)量控制;其中，上述生物試樣 包含從由隨機堿基序列組成的隨機單鏈核酸所構成的核酸庫中選定的兩種或兩種以上的 生物分子。
[0107] 并且，本發(fā)明人提出了通過核酸分析方法來分析通過使上述生物試樣中的生物分 子與適配體發(fā)生反應來生成的生物分子-適配體復合物中的適配體，從而分析作為受體的 生物分子的方法(韓國特許登錄第10-0670799號）。分析上述生物試樣中的生物分子和適配 體復合物中的適配體的核酸分析方法可以為聚合酶鏈式反應（PCR，polymeras chain reaction)、連接酶鏈式反應(LCR，ligase chain reaction)、鏈替代擴增反應(SDA，strand displacement amp lification)、車專錄介導擴增（TMA，transcription-mediated amplification)、支鏈脫氧核糖核酸(bDNA，branched DNA)、侵入方法及及滾環(huán)擴增(RCA， rolling circle amplification)等。優(yōu)選地，能夠追加分析以上述生物分子-單鏈核酸復 合物中的單鏈核酸為模板實施聚合酶鏈式反應來生成的擴增產(chǎn)物。
[0108] 并且，本發(fā)明提供生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，上述質(zhì)量控制基 準物質(zhì)為不包含于上述生物試樣中的生物分子。
[0109] 觀察圖1，可知是通過使上述生物試樣中的生物分子及基準物質(zhì)與由隨機堿基序 列組成的隨機單鏈核酸發(fā)生反應，來決定上述結合單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸之 后，基于上述結合單鏈核酸的堿基序列，將上述制備的核酸芯片使用于分析單鏈核酸的決 定，并且，執(zhí)行通過由上述分析單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸的堿基序列制備的上述核酸 芯片來分析生物試樣中的生物分子的生物學意義的步驟的這種一系列過程。
[0110] 通過上述核酸芯片來檢查的生物試樣的代表性的例為轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組等。在分 析轉(zhuǎn)錄組的情況下，作為基準物質(zhì)而在所有的組織中幾乎以規(guī)定的量表達的甘油醛-3-磷 酸脫氫酶(GAPDH，Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)或肌動蛋白信使核糖 核酸(0-actin mRNA)等用于進行內(nèi)部質(zhì)量控制，但由于沒有以明確的定量分析為目的來使 用的基準物質(zhì)，因而依賴于外部質(zhì)量控制。
[0111] 并且，在由兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)組成的生物試樣中選定與蛋白質(zhì)相結合的配 體的方法具有由本發(fā)明人提出的顛倒-指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化（韓國特許登錄第10-0923048號）。還有基于細胞的指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化（Cell-selex) (Homann，M. and Goringer，H.U.，1999，Nucleic Acids Res 27(9)，2006-2014)。本發(fā)明的目的在于，提供質(zhì) 量控制目的基準物質(zhì)，上述質(zhì)量控制目的基準物質(zhì)用于通過上述顛倒-指數(shù)富集配基系統(tǒng) 進化，來有效地選定與具有兩種或兩種以上的生物分子的生物試樣中的生物分子相結合的 配體。
[0112] 并且，當前的實情為，在分析蛋白質(zhì)組的情況下，沒有能夠用于定量及定性分析的 有用的基準物質(zhì)，因而在分析蛋白質(zhì)組的質(zhì)量控制及定量分析方面存在很多困難。因此，本 發(fā)明提出用于通過使用基準物質(zhì)來分析上述試樣的有用的內(nèi)部質(zhì)量控制及定量分析方法。
[0113] 優(yōu)選地，在本發(fā)明的基準物質(zhì)以與先前記述的外部標記物類似的方式分析人類來 源生物試樣的情況下，能夠使用植物特異生物分子作為不包含于人類來源生物試樣中的生 物分子。目前，人類基因組項目及作為植物的一種的擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因 組項目已結束，因此，報告出植物特異蛋白質(zhì)。在本發(fā)明中，能夠使用植物特異蛋白質(zhì)作為 用于分析人類來源生物試樣的基準物質(zhì)。
[0114] 與包含于上述生物試樣中的生物分子及基準物質(zhì)相結合的物質(zhì)具有抗體、肽及單 鏈核酸等，優(yōu)選地，可以為單鏈核酸。
[0115] 本發(fā)明提供選定生物分子分析單鏈核酸的方法，包括:決定不包含于生物試樣中 的生物分子，從決定的外源生物分子制備質(zhì)量控制單鏈核酸的步驟，從包含于上述生物試 樣中的生物分子制備上述結合單鏈核酸的步驟，以及使用上述質(zhì)量控制單鏈核酸及上述結 合單鏈核酸的堿基序列，來制備固定有合成的捕獲探針的載體的步驟;使用用于選定分析 生物分子的生物學意義的分析單鏈核酸、上述生物試樣、上述基準物質(zhì)、上述結合單鏈核 酸、上述質(zhì)量控制單鏈核酸及上述核酸芯片，從而生成生物分子和結合單鏈核酸的結合實 驗方案。
[0116]觀察圖2，可知為選定在上述生物試樣中的生物分子的結合單鏈核酸和質(zhì)量控制 單鏈核酸，來制備核酸芯片，并決定分析上述生物試樣中的生物分子的生物學意義的上述 分析單鏈核酸的一系列過程。
[0117]本發(fā)明的決定在與上述基準物質(zhì)相結合的單鏈核酸中決定的質(zhì)量控制單鏈核酸 的方法能夠由標準指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進化(Tuerk C.and Gold L.，1990，Science， 249;505-510)等組成，上述標準指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進化使基準物質(zhì)與具有隨機堿基序 列的隨機單鏈核酸發(fā)生反應，使基準物質(zhì)與單鏈核酸相分離，并反復執(zhí)行這種一系列的選 擇和擴增，來選定與基準物質(zhì)相結合的單鏈核酸。
[0118] 并且，本發(fā)明的選定與由兩種或兩種以上的生物分子組成的生物試樣中的生物分 子相結合的單鏈核酸的方法，能夠使用反轉(zhuǎn)指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進化技術(韓國特許登 錄第10-0923048號），上述反轉(zhuǎn)指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進化技術使包含生物分子的生物試 樣與具有隨機堿基序列的隨機單鏈核酸發(fā)生反應，來決定與上述生物分子相結合的生物分 子結合單鏈核酸。
[0119] 本發(fā)明所提供的制備上述結合單鏈核酸的方法與先前選定與包含于生物試樣中 的生物分子相結合的單鏈核酸的方法相同，能夠包括以下步驟來選定生物分子分析單鏈核 酸:首先在通過使上述生物分子與具有上述隨機堿基序列的單鏈核酸發(fā)生反應來獲得的反 應溶液中選擇生物分子-單鏈核酸復合物的步驟;從上述復合物分離并擴增單鏈核酸，來制 備單鏈核酸脫氧核糖核酸的步驟；以及上述單鏈核酸脫氧核糖核酸插入于克隆用載體，來 確保單克隆并決定上述單鏈核酸的堿基序列，從而制備上述結合單鏈核酸的步驟。
[0120] 本發(fā)明的選擇上述生物分子-單鏈核酸復合物的方法提供生物分子分析單鏈核酸 選定方法，其特征在于，清洗在上述反應溶液中的上述生成的生物分子-單鏈核酸復合物， 基于上述生物分子與上述單鏈核酸間的結合力的大小，選擇規(guī)定結合力以上的上述生物分 子-單鏈核酸復合物。
[0121] 本發(fā)明的選擇上述生物分子-單鏈核酸復合物的方法提供生物分子分析單鏈核酸 選定方法，其特征在于，通過對上述反應溶液進行毛細管電泳處理，來選擇上述生物分子-單鏈核酸復合物。
[0122] 本發(fā)明的選擇上述生物分子-單鏈核酸復合物的方法提供生物分子分析單鏈核酸 選定方法，其特征在于，用上述反應溶液來對由硝酸纖維素及尼龍組成的結構體進行處理， 來選擇生物分子-單鏈核酸復合物。
[0123] 本發(fā)明提供生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，反復執(zhí)行多次上述生 物分子-單鏈核酸復合物的選擇及擴增。
[0124] 在本發(fā)明中，上述生物分子-單鏈核酸復合物的選擇可以通過以下方法進行:清洗 上述生成的生物分子-單鏈核酸復合物，基于上述生物分子與上述單鏈核酸間的結合力的 大小來選擇規(guī)定結合力以上的上述生物分子-單鏈核酸復合物的方法;通過毛細管電泳上 述反應溶液，來選擇上述生物分子-單鏈核酸復合物的方法或者用上述反應溶液來對由硝 酸纖維素及尼龍組成的結構體進行處理，來選擇生物分子-單鏈核酸復合物的方法。
[0125] 從上述生物分子-單鏈核酸分離的單鏈核酸能夠?qū)⑼ㄟ^反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應 (RT-PCR，Reverse Transcription-PCR)來獲得的產(chǎn)物插入于克隆用載體，從而確保大腸菌 克隆，并決定其堿基序列。
[0126] 本發(fā)明提供生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，固定有上述捕獲探針 的載體包括載玻片、生物傳感器的檢測表面、微珠、納米粒子等。
[0127] 本發(fā)明提供生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，上述捕獲探針由選自 上述結合單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸的堿基序列和它們的互補的堿基序列中至少一種 堿基序列組成并合成。
[0128] 本發(fā)明提供生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，生成在由上述兩種或 兩種以上的生物分子組成的生物分子中的生物分子和結合單鏈核酸的結合實驗方案的方 法包括:從上述基準物質(zhì)、上述生物試樣、上述質(zhì)量控制單鏈核酸及上述結合單鏈核酸制備 具有標記物質(zhì)的分析靶探針的步驟;混合及擴增上述捕獲探針相應的上述結合單鏈核酸及 上述質(zhì)量控制單鏈核酸，來制備具有標記物質(zhì)的比較靶探針的步驟;混合上述分析靶探針 和上述比較靶探針，來制備上述靶探針的步驟；以及使上述靶探針和上述載體上的上述捕 獲探針發(fā)生雜交反應，來生成結合實驗方案的步驟。
[0129] 本發(fā)明提供生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，制備上述分析靶探針 的方法包括:準備向上述生物試樣添加分別以不同的量包含上述基準物質(zhì)的基準物質(zhì)I的 分析試樣的步驟;分離使上述分析試樣和由上述結合單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸組 成的單鏈核酸發(fā)生反應來所生成的生物分子-單鏈核酸復合物及基準物質(zhì)-單鏈核酸復合 物的步驟;以及從上述復合物分離、擴增及標記單鏈核酸，來制備分析靶探針的步驟。
[0130] 本發(fā)明提供生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，制備上述分析靶探針 的方法包括:從使上述生物試樣和上述結合單鏈核酸發(fā)生反應來所生成的生物分子-單鏈 核酸復合物中分離單鏈核酸的步驟；以及混合所分離的單鏈核酸和分別以不同的量組成質(zhì) 量控制單鏈核酸的基準物質(zhì)II，來以擴增及標記方式制備上述分析靶探針的步驟。
[0131] 本發(fā)明提供生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，還包括用于分析上述 生物分子的生物學意義的分析單鏈核酸的篩選基于上述捕獲探針的貢獻度，在能夠分析上 述生物分子的生物學意義的范圍內(nèi)，篩選上述捕獲探針，從而減少固定于上述載體的上述 捕獲探針的個數(shù)的步驟。
[0132] 本發(fā)明提供核酸芯片，其特征在于，使用上述結合單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸 的堿基序列來合成的捕獲探針固定于載體，從而生成上述分析單鏈核酸和上述結合單鏈核 酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸之間的結合信息。
[0133] 在本發(fā)明的選定利用上述核酸芯片的分析單鏈核酸的方法中，捕獲探針由選自通 過固定于載體的分子來與生物分子及基準物質(zhì)相結合的單鏈核酸或具有它們的信息的物 質(zhì)中的至少一種物質(zhì)組成。
[0134] 上述生物試樣中的生物分子和單鏈核酸的結合信息是指借助在生物分子結合單 鏈核酸制備的靶探針和捕獲探針的互補的結合來發(fā)生的信號，優(yōu)選地，由與組成載體的捕 獲探針相應的點組成的實驗方案，是與分別組成點的捕獲探針相結合的靶探針的結合單鏈 核酸的標記物質(zhì)所發(fā)生的信號，優(yōu)選地，意味著熒光程度。上述結合信息為靶探針的分析靶 探針及比較分析探針的信號的組合，最終，在生物試樣中呈現(xiàn)生物分子結合單鏈核酸的分 布狀態(tài)，由此能夠推論與單鏈核酸相結合的生物分子的分布狀態(tài)。
[0135] 并且，本發(fā)明的用于在生物試樣中選定分析生物分子的生物學意義的分析單鏈核 酸的制備核酸芯片的方法，能夠使用選自決定的分析單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸的堿基 序列和上述它們的互補的堿基序列中的至少一種堿基序列，或者使用與生物分子結合單鏈 核酸的堿基序列以完全互補的方式結合的堿基序列所組成的捕獲探針來合成的捕獲探針 固定于載體。
[0136] 并且，在本發(fā)明中，能夠固定有捕獲探針的載體能夠選自載玻片、生物傳感器的檢 測表面、微珠、納米粒子等，優(yōu)選地，載體為載玻片。
[0137] 根據(jù)上述載體的種類，能夠選擇分析與捕獲探針相結合的擴增產(chǎn)物的信號的方 法。
[0138] 像這樣，本發(fā)明的核酸芯片通過在相關技術領域眾所周知的方法，在將捕獲探針 固定于載玻片之后，將載玻片直接離心分離并干燥，之后以阻隔光狀態(tài)保管置，直到使用之 前為止。
[0139] 捕獲探針能夠通過以往公知的多種方法（M . schena ; DNA mi croarray ; a prac t i ca 1 approach，Oxf ord，1999)來以規(guī)則方式制備核酸芯片。
[0140] 在通過核酸芯片來分析生物試樣的情況下，通常，靶探針分析轉(zhuǎn)錄組的情況將疾 病部分來源生物試樣作為分析生物試樣，將正常部分作為比較生物試樣，在前者制備分析 靶探針，在后者制備比較靶探針，并在混合它們之后使用為靶探針。但在沒有適當?shù)谋容^生 物試樣的情況下，適用從分析生物試樣來源的單一靶探針作為靶探針。
[0141] 優(yōu)選地，靶探針可以為具有80bp至140bp的堿基序列的寡核苷酸的單鏈核酸。
[0142] 并且，在本發(fā)明中，分析靶探針能夠通過以下兩種方法來制備。分別以不同的量組 成基準物質(zhì)的基準物質(zhì)I混合于生物試樣中，從而準備分析靶探針的方法;在從上述生物分 子-單鏈核酸分離的單鏈核酸混合由質(zhì)量控制單鏈核酸分別以不同的量組成的基準物質(zhì) II，來準備分析靶探針的方法。
[0143] 比較靶探針可以為通過與捕獲探針互補的堿基序列的核酸來從單鏈核酸池中合 成的單鏈核酸，上述單鏈核酸由生物分子結合單鏈核酸和質(zhì)量控制單鏈核酸組成。
[0144] 基于如上所述的理由，分析對生物分子的生物學意義分析的各個捕獲探針的貢獻 度，在能夠分析生物分子的生物學意義的范圍內(nèi)，以分析的貢獻度為基礎，篩選捕獲探針， 由此能夠發(fā)掘?qū)Ψ治錾锓肿泳哂幸饬x的單鏈核酸。
[0145] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，通過使用上述分析單鏈核酸，來使用 用于分析在上述生物試樣中的生物分子的上述質(zhì)量控制基準物質(zhì)，通過核酸分析方法分析 上述質(zhì)量控制單鏈核酸來進行內(nèi)部質(zhì)量控制。
[0146] 并且，本發(fā)明提供生物分子分析方法，通過使用上述分析單鏈核酸來將上述生物 試樣中的生物分子分析作為核酸分析方法。
[0147] 觀察圖3,可知是利用上述分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸，在上述生物試 樣中制備用于分析生物分子的生物學意義的核酸芯片，從而生成在生物試樣中的生物分子 和上述分析單鏈核酸的結合實驗方案的一系列的過程。
[0148] 本發(fā)明人的在通過使上述生物試樣中的生物分子與適配體發(fā)生反應來生成的生 物分子-適配體復合物中，以核酸分析方法分析適配體，從而分析作為受體的生物分子的方 法記載在韓國特許登錄第10-0670799-0000。對上述生物試樣中的生物分子和在適配體復 合物中的適配體進行分析的核酸分析方法可以為聚合酶鏈式反應(PCR，polymeras chain reaction)、連接酶鏈式反應(LCR，ligase chain reaction)、鏈替代擴增反應(SDA，strand displacement amp lification)、車專錄介導擴增（TMA，transcription-mediated amplification)、支鏈脫氧核糖核酸(bDNA，branched DNA)、侵入物方法及滾環(huán)擴增(RCA， rolling circle amplification)等。優(yōu)選地，能夠追加分析以上述生物分子-單鏈核酸復 合物中的單鏈核酸為模板實施聚合酶鏈式反應來生成的擴增產(chǎn)物。
[0149] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，上述質(zhì)量控制基準物質(zhì)為不包含于 上述生物試樣中的生物分子。
[0150] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，包括:將使用上述分析單鏈核酸及上 述質(zhì)量控制單鏈核酸的堿基序列來合成的上述捕獲探針固定于載體的步驟;從上述基準物 質(zhì)、上述生物試樣、上述質(zhì)量控制單鏈核酸及上述結合單鏈核酸制備具有標記物質(zhì)的分析 靶探針的步驟;使上述靶探針和上述載體上的上述捕獲探針發(fā)生雜交反應，來獲得結合實 驗方案的步驟；以及比較所獲得的上述實驗方案和已確保的結合信息數(shù)據(jù)，來分析上述生 物分子的生物學意義的步驟。
[0151 ]并且，本發(fā)明提供生物分子分析方法，準備上述靶探針的方法包括:從上述基準物 質(zhì)、上述生物試樣、上述質(zhì)量控制單鏈核酸及上述結合單鏈核酸制備具有標記物質(zhì)的分析 靶探針的步驟;混合及擴增與上述捕獲探針相應的上述分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈 核酸來制備具有標記物質(zhì)的比較靶探針的步驟；以及制備由上述分析靶探針及上述比較靶 探針組成的靶探針的步驟。
[0152] 觀察圖4及圖5,可知是在利用上述分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸來制備 核酸芯片，來分析包含于上述生物試樣的生物分子的生物學意義的過程中，以質(zhì)量控制為 目的，利用基準物質(zhì)及質(zhì)量控制單鏈核酸來分析的一系列的過程。
[0153] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，固定有上述捕獲探針的載體包含載 玻片、生物傳感器的檢測表面、微珠、納米粒子等。
[0154] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，上述捕獲探針由與上述分析單鏈核 酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸的堿基序列以完全互補的方式結合的堿基序列組成。
[0155] 優(yōu)選地，上述捕獲探針能夠由與上述分析單鏈核酸互補結合的堿基序列組成，上 述分析單鏈核酸選自組成上述生物試樣的上述結合單鏈核酸中，用于分析在生物試樣中的 生物分子的生物意義而使用的適配體。因此，上述捕獲探針能夠與在將在上述復合物中的 上述分析單鏈核酸作為模板進行聚合酶鏈式反應來獲得的擴增產(chǎn)物中的上述特定分析單 鏈核酸的堿基序列相互補結合，因此，最終能夠分析在上述復合物中的分析單鏈核酸，利用 其結果來定量分析作為受體的蛋白質(zhì)。
[0156] 根據(jù)上述載體的種類，能夠選擇分析與捕獲探針相結合的擴增產(chǎn)物的信號的方 法。
[0157] 在本發(fā)明的進行內(nèi)部質(zhì)量控制并分析利用上述核酸芯片的生物分子的生物學意 義的方法中，捕獲探針由選自作為固定于載體的分子而與生物分子及基準物質(zhì)相結合的分 析單鏈核酸或具有它們的信息的物質(zhì)中的至少一種物質(zhì)組成。
[0158] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，使用用于標記及擴增從上述生物分 子-單鏈核酸復合物和上述基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物中分離的分析單鏈核酸的具有標記 物質(zhì)的引物。
[0159] 并且，在本發(fā)明中，能夠使用具有用于標記及擴增從生物分子-單鏈核酸復合物和 基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物分離的單鏈核酸的標記物質(zhì)的引物和具有指示特定單鏈核酸的 標記的引物。
[0160] "標記"是指在反應中用來確認多核苷酸和/或追蹤多核苷酸的來源的獨特的核苷 酸序列。標記序列可以處于引物的5末端或3末端。捕獲探針的堿基序列可以在大小及組成 成分上發(fā)生廣泛的變化。以下的參考資料提出用于選定適合于特定具體例的一系列捕獲探 針堿基序列的指南（美國專利第5,635,400號;Brenner et al，2000，PNAS. ,97:1665-1670; Shoemaker et al，1996，Nature Genetics，14:450-456;歐洲專利公開0799897A1;美國專 利第5，981，179號）。并且，在與此相似的上述特定具體例中，捕獲探針喊基序列能夠保留4 個至36個核苷酸，或者6個至30個核苷酸，或者8個至20個核苷酸范圍的長度。
[0161] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，由與指示上述分析單鏈核酸及上述 質(zhì)量控制單鏈核酸的標記的堿基序列以完全互補的方式結合的堿基序列組成上述捕獲探 針。
[0162] 上述捕獲探針能夠使用與標記互補的堿基序列來制備，這種捕獲探針能夠與標記 堿基序列以完全互補的方式結合，來分析聚合酶鏈式反應產(chǎn)物，上述標記堿基序列存在于 以上述復合物中的分析單鏈核酸作為模板進行聚合酶鏈式反應來生成，可通過分析上述捕 獲探針和聚合酶鏈式反應的產(chǎn)物生成的點的信號，來分析在上述復合物中的分析單鏈核 酸。
[0163] 上述比較靶探針可以為通過與上述捕獲探針相互補的堿基序列的核酸從單鏈核 酸池中合成的單鏈核酸，上述單鏈核酸由生物分子結合單鏈核酸和質(zhì)量控制單鏈核酸組 成。
[0164] 在通過核酸芯片分析轉(zhuǎn)錄組的情況下，靶探針將源自于疾病部分的生物試樣作為 實驗組的分析生物試樣，將源自于正常部分的生物試樣作為對照組的比較生物試樣，在前 者制備分析靶探針，在后者制備比較靶探針，并在混合它們之后使用為靶探針。但在沒有適 當?shù)谋容^生物試樣的情況下，能夠使用從分析生物試樣來源的單一靶探針作為靶探針。
[0165] 并且，在本發(fā)明中，分析靶探針能夠通過以下兩種方法制備:將由基準物質(zhì)分別以 不同的量組成的基準物質(zhì)I混合于生物試樣中，從而準備分析靶探針的方法;在從上述生物 分子-單鏈核酸分離的單鏈核酸混合由質(zhì)量控制單鏈核酸分別以不同的量組成的基準物質(zhì) II，來準備分析靶探針的方法。
[0166] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，制備上述分析靶探針的方法包括：向 上述生物試樣添加分別以不同的量包含上述基準物質(zhì)的基準物質(zhì)I，來準備分析試樣的步 驟;分離使上述分析試樣和由上述結合單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸組成的單鏈核酸 發(fā)生反應來所形成的生物分子-單鏈核酸復合物及基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物的步驟；以及 分離、擴增及標記上述復合物中的分析單鏈核酸，來準備分析靶探針的步驟。
[0167] 本發(fā)明提供生物分子分析方法，其特征在于，準備上述分析靶探針的方法包括:分 離使上述生物試樣和上述分析單鏈核酸發(fā)生反應來生成的生物分子-單鏈核酸復合物中分 離單鏈核酸的步驟；以及將分別以不同的量含有質(zhì)量控制單鏈核酸的基準物質(zhì)II混合、擴 增及標記于從分離的上述生物分子-單鏈核酸復合物中分離的分析單鏈核酸，來制備所標 記的上述分析靶探針的步驟。
[0168] 本發(fā)明提供生物分子分析方法及分析裝置，其特征在于，利用將作為實驗組的使 上述生物試樣中的生物分子和上述分析單鏈核酸發(fā)生反應來制備的分析靶探針和作為對 照組的使上述生物試樣中的生物分子和上述分析單鏈核酸發(fā)生反應來制備的比較靶探針 相混合而制備的靶探針來分析上述核酸芯片。
[0169] 將來源于與實驗組生物試樣中的生物分子相結合的分析單鏈核酸的靶探針稱為 分析靶探針，并將來源于與對照組生物試樣中的生物分子相結合的分析單鏈核酸或人為地 在與生物分子及基準物質(zhì)相結合的分析單鏈核酸池中制備的靶探針稱為比較靶探針。優(yōu)選 地，靶探針為分析靶探針和比較靶探針。
[0170] 上述靶探針作為與捕獲探針相結合的分子，能夠混合分析靶探針和比較靶探針或 僅由分析靶探針組成。
[0171] 本發(fā)明提供生物分子的分析方法及分析裝置，其特征在于，上述標記物質(zhì)使用選 自由生物素(Biotin)、Cy2、綠色熒光蛋白、Y0-PR0-UY0Y0-1、鈣黃綠素、異硫氰酸熒光素、 FlourX、ALEXA 488、羅丹明 110、ABI 5-FAM、俄勒岡綠500、俄勒岡綠488、RiboGreen、羅丹明 綠、羅丹明123、鎂綠、鈣綠、!'0-?如-1、1'01'0-1^811(^、氟硼二吡咯530/550、011、氟硼二吡 咯TMR、氟硼二吡咯558/568、氟硼二吡咯564/570、Alexa 546、四甲基異硫氰酸羅丹明、鎂 橙、藻紅蛋白R&B、羅丹明標記的鬼筆環(huán)肽、鈣橙、派洛寧Y、羅丹明B、ABI TAMRA、玫瑰紅、 Cy3.5、ABI R0X、鈣紅、Alexa 594、德克薩斯紅、尼羅紅、Y0-PR0-3、Y0Y0-3、紅藻藍素、C-藻 藍素、T0PR0-3、T0T0-3、DiD DilC(5)、氧雜羰花青、Cy5.5、Cy5及Cy3組成的組中的熒光染 料。
[0172]以使將分析單鏈核酸作為模板，利用具有上述標記物質(zhì)的引物，并進行聚合酶鏈 式反應來確保的擴增產(chǎn)物與上述捕獲探針發(fā)生反應，上述捕獲探針與具有標記物質(zhì)的擴增 產(chǎn)物的單鏈核酸進行互補結合來生成雙鏈核酸，上述分析單鏈核酸存在于由上述分析單鏈 核酸和上述生物試樣中的生物分子發(fā)生反應生成的復合物中。因此，若由上述捕獲探針組 成的點發(fā)生基于標記物質(zhì)的信號，則能夠通過該信號分析分析單鏈核酸，并能定量分析作 為上述分析單鏈核酸生成的復合物內(nèi)的受體的蛋白質(zhì)。因此，標記物質(zhì)可以在多個范圍內(nèi) 根據(jù)分析目的來選擇，優(yōu)選地，能夠使用Cy 3或Cy 5。
[0173] 本發(fā)明提供核酸芯片，通過使用上述分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸的堿 基序列來制備的上述捕獲探針固定于載體，用于分析包含于上述生物試樣中的生物分子的 生物學意義，用于生成上述生物分子和上述分析單鏈核酸的結合信息。
[0174] 并且，本發(fā)明的用于在生物試樣中分析生物分子的生物學意義的核酸芯片可以成 為由捕獲探針固定于載體的結構，上述捕獲探針使用選自所決定的分析單鏈核酸及質(zhì)量控 制單鏈核酸的堿基序列和上述它們的互補的堿基序列中的至少一種堿基序列，或者使用由 與指示生物分子結合單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸的標記的堿基序列相完全互補結合的 堿基序列組成的捕獲探針來合成。
[0175] 捕獲探針可通過以往公知的多種方法(M. schena;DNA microarray ;a practical approach，Oxf ord，1999)來以規(guī)則方式制備生物芯片。
[0176] 并且，本發(fā)明的在生物試樣中分析生物分子的生物學意義的核酸芯片由捕獲探針 固定于載體，上述捕獲探針使用上述分析單鏈核酸及質(zhì)量控制單鏈核酸的信息來合成。
[0177] 若本發(fā)明的核酸芯片能夠通過相同或類似的程度的精密度來分析未知的生物分 子的生物學意義，則減少固定于核酸芯片的捕獲探針的數(shù)量在生物芯片的制備費用及分析 的效率性方面更為優(yōu)選。
[0178] 上述結合信息是指借助制備于與生物分子相結合的分析單鏈核酸中的靶探針和 捕獲探針的互補的結合來發(fā)生的信號，優(yōu)選為由與組成載體的捕獲探針相應的點組成的實 驗方案，具體地，在通過與分別組成點的捕獲探針相結合的靶探針的結合單鏈核酸的標記 物質(zhì)所發(fā)生的信號，優(yōu)選地，意味著熒光程度。上述結合信息為靶探針的分析靶探針及比較 分析探針的信號的組合，最終，在生物試樣中表示生物分子結合單鏈核酸的分布狀態(tài)，由此 能夠推論與單鏈核酸相結合的生物分子的分布狀態(tài)。
[0179] 根據(jù)如上所述的理由，還可以包括分析各個捕獲探針對生物分子的生物學意義分 析的貢獻度，在能夠分析生物分子的生物學意義的范圍內(nèi)，基于分析的貢獻度來篩選捕獲 探針，從而減少固定于本發(fā)明的生物芯片的捕獲探針的數(shù)量的步驟。
[0180] 若利用本發(fā)明的生物芯片來分析生物分子，則積累相關結合信息數(shù)據(jù)，從而對生 物分子的生物學意義的分析做貢獻的特殊的單鏈核酸自然顯現(xiàn)，由此能夠發(fā)掘?qū)Ψ治錾?分子具有意義的生物標記物。
[0181 ]本發(fā)明提供基準物質(zhì)，其特征在于，上述基準物質(zhì)由不包含于生物試樣的外源分 子組成，使用于對用于通過上述分析單鏈核酸來分析上述生物試樣中的生物分子的生物學 意義的分析過程的質(zhì)量控制及包含于生物試樣的生物分子進行定量分析。
[0182] 本發(fā)明提供生物分子分析試劑盒，其特征在于，使用用于分析上述生物試樣中的 生物分子的生物學意義的上述分析單鏈核酸及上述基準物質(zhì)。
[0183] 本發(fā)明提供生物分子分析裝置，其特征在于，通過利用上述分析單鏈核酸及上述 基準物質(zhì)的生物分子分析方法來分析上述生物分子，包括準備在上述生物試樣中的生物分 子的試樣處理裝置以及由制備上述生物分子-單鏈核酸復合物并擴增上述生物分子-單鏈 核酸復合物模塊及分析上述擴增的產(chǎn)物的模塊組成的擴增裝置的生物分子的系統(tǒng)。
[0184] 為了更有效地試試本發(fā)明的生物分子分析方法，在包括試樣處理裝置和擴增裝置 的利用分析結合單鏈核酸及基準物質(zhì)的生物分子分析裝置中，本發(fā)明的系統(tǒng)能夠由混合腔 室、溶解腔室及反應腔室組成的試樣處理裝置及擴增裝置構成，并能以合并的方式運行，上 述試樣處理裝置在包含生物分子的試樣中分離生物分子，上述擴增裝置由制備上述生物分 子-分析單鏈核酸及基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物，并擴增上述生物分子-分析單鏈核酸及基 準物質(zhì)-單鏈核酸復合物的模塊及分析上述擴增的產(chǎn)物的模塊構成。
[0185] 被認為含有關注對象的生物分子的樣品的分析伴隨著一系列樣品準備步驟，并在 由混合腔室和溶解腔室構成的試樣處理裝置中組成。它們的步驟可包括過濾、細胞溶解、生 物分子、生物分子-單鏈核酸復合物制備及與試劑的混合。為了獲得對生物分子分析結果的 確信，對樣品準備過程的污染進行控制。提供調(diào)劑用于核酸擴增反應的樣品，并驗證樣品調(diào) 劑的有效性的方法。
[0186] 樣品被認為含有選自由細胞、孢子、微生物及病毒組成的組的靶實體，上述靶實體 包含至少一種靶生物分子。上述方法包括向具有樣品和與樣品調(diào)劑對照組相混合的混合腔 室的裝置導入樣品的步驟。樣品調(diào)劑對照組選自由細胞、孢子、微生物及病毒組成的組，上 述樣品調(diào)劑對照組包含質(zhì)量控制物質(zhì)。上述裝置包括溶解腔室和反應腔室。在混合腔室中， 樣品與樣品調(diào)劑對照組混合。
[0187] 上述方法包括:通過在溶解腔室中溶解處理存在于樣品調(diào)劑對照組及樣品內(nèi)的情 況下的靶實體，來純化生物分子的步驟;生成生物分子-單鏈核酸復合物的步驟;在反應腔 室內(nèi)，將溶解腔室內(nèi)的生物分子-單鏈核酸復合物露出于核酸擴增條件下的步驟；以及檢測 是否存在至少一種質(zhì)量控制物質(zhì)的步驟。質(zhì)量控制物質(zhì)的積極的檢測呈現(xiàn)對樣品調(diào)劑過程 的滿足，另一方面，若無法檢測質(zhì)量控制物質(zhì)，則呈現(xiàn)出樣品得到不適當?shù)恼{(diào)劑。
[0188] 本發(fā)明提供擴增裝置，上述擴增裝置對用于核酸擴增反應的樣品進行調(diào)節(jié)，并驗 證其樣品調(diào)劑的有效性。樣品被認為含有選自由細胞、孢子、微生物及病毒組成的組的靶實 體，上述靶實體包含至少一種靶生物分子。上述裝置包括具有收容與樣品相混合的樣品調(diào) 劑對照組的第一腔室的本體。樣品調(diào)劑對照組選自細胞、孢子、微生物及病毒組成的組，上 述樣品調(diào)劑對照組包含質(zhì)量控制物質(zhì)。
[0189] 上述本體包括溶解腔室，上述溶解腔室對存在于樣品內(nèi)的情況下的靶實體及樣品 調(diào)劑對照組進行溶解處理，使得生物分子從此游離，并分離生物分子-單鏈核酸復合物。并 且包括使游離的生物分子和分析單鏈核酸發(fā)生反應，來生成生物分子-單鏈核酸復合物的 溶解腔室。并且，上述本體包括維持用于擴增及檢測的核酸的反應腔室。
[0190] 上述裝置還包括至少一種流量控制器，上述流量控制器用于引導生物分子從具有 與樣品調(diào)劑對照組相混合的樣品的第一腔室向溶解腔室內(nèi)流動，并引導在溶解腔室游離的 生物分子向反應腔室內(nèi)流動。
[0191] 在幾個實施例中，當樣品通過溶解腔室流動時，溶解腔室收容用于捕獲存在于樣 品內(nèi)的情況下的靶實體及樣品調(diào)劑對照組的酶、至少一種過濾器及固相物質(zhì)，上述裝置還 包括用于收容通過溶解腔室流的所使用的樣品流體的至少一種廢棄腔室，并且，上述至少 一種流量控制器能夠引導通過溶解腔室流的所使用的樣品流體向廢棄腔室流動。
[0192] 在幾個實施例中，上述裝置還包括與用于向溶解腔室提供超聲波的溶解腔室的壁 相結合的超聲換能器。在幾個實施例中，上述裝置在用于使樣品調(diào)劑對照組及靶實體破裂 的溶解腔室內(nèi)還包括的微珠。
[0193]根據(jù)本發(fā)明的另一實施方式，本發(fā)明提供用于決定溶解過程的有效性的方法。上 述方法包括與被認為含有選自由細胞、孢子、微生物及病毒組成的組的靶實體的樣品和樣 品調(diào)劑對照組相混合的步驟。靶實體包含至少一種質(zhì)量控制物質(zhì)。樣品調(diào)劑對照組選自由 細胞、孢子、微生物及病毒組成的組，上述樣品調(diào)劑對照組包含質(zhì)量控制物質(zhì)。存在于樣品 調(diào)劑對照組和樣品內(nèi)的情況下的靶實體的混合物將得到溶解處理。并且，上述方法還包括 檢測是否存在質(zhì)量控制物質(zhì)的步驟，以便在溶解處理中，生物分子從樣品調(diào)劑對照組游離。 質(zhì)量控制物質(zhì)的積極的檢測呈現(xiàn)對樣品調(diào)劑過程的滿足，另一方面，若無法檢測質(zhì)量控制 物質(zhì)，則呈現(xiàn)樣品被被適當?shù)恼{(diào)劑。
[0194] 在幾個實施例中，上述方法包括與樣品調(diào)劑對照組相混合的樣品通過收容固相物 質(zhì)的腔室來流動的步驟，上述樣品調(diào)制對照組用于在溶解處理之前，借助固相物質(zhì)來捕獲 存在于樣品調(diào)劑對照組及樣品內(nèi)的情況下的靶實體。
[0195] 在幾個實施例中，樣品能夠在混合樣品和樣品調(diào)劑對照組之前進行預先過濾。在 幾個實施例中，溶解處理包括將樣品調(diào)劑對照組及靶實體露出于超聲波能量。在幾個實施 例中，溶解處理還包括攪拌用于對樣品調(diào)劑對照組及靶實體進行破裂的微珠的步驟。在幾 個實施例中，樣品調(diào)劑對照組為孢子。在幾個實施例中，混合步驟包括對含有樣品調(diào)劑對照 組的干燥微珠進行分解。
[0196] 在幾個實施例中，溶解處理包括與化學溶解劑相接觸的步驟。在幾個實施例中，標 記物核酸序列使標記物核酸序列(例如，借助印制電路板(PCB，Printed Circuit Board)) 擴增，并通過檢測所擴增的標記物核酸序列來檢測。在幾個實施例中，標記物核酸序列決定 能夠與標記物核酸序列相結合的探針的信號是否超出限值來進行檢測。
[0197] 擴增裝置的反應容器的反應腔室內(nèi)的反應混合物露出于核酸擴增條件。利用反應 的核糖核酸或脫氧核糖核酸模板的擴增已公知于[美國專利第4683195號；美國專利第 4683202號；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications(Innis et.al.，， 1990)]。脫氧核糖核酸的核酸擴增使脫氧核糖核酸發(fā)生熱變形，并在與將要擴增的脫氧核 糖核酸分節(jié)相接的序列退火2個低核苷酸引物，且伴隨著通過利用脫氧核糖核酸聚合酶使 所退火的引物發(fā)生延長來組成的循環(huán)反復。引物與靶序列的相對應的線（strand)進行交 配，并被定向為基于聚合酶的脫氧核糖核酸合成經(jīng)過引物之間的區(qū)域來執(zhí)行，進而將脫氧 核糖核酸分節(jié)的量有效地提高了 2倍。并且，擴張產(chǎn)物具有補充性且能夠與引物相結合，因 此，實質(zhì)上各個連續(xù)的循環(huán)將在前一個循環(huán)中所合成的脫氧核糖核酸的量提高2倍。這以每 個循環(huán)2 n(這里n為循環(huán)輸）的比率帶來特定靶分節(jié)的指數(shù)積累。如擴增反應及連接酶鏈式 反應(LCR，ligase chain reaction)之類的方法能夠直接用于使核酸序列擴增。等溫擴增 反應也已被公開，且能夠根據(jù)本發(fā)明的方法來使用。
[0198] 優(yōu)選地，核酸擴增反應能夠使用使反應容器內(nèi)的反應混合物以擴增反應中所需的 溫度進行加熱和/或冷卻的熱處理裝置來執(zhí)行。上述熱處理裝置還包括一個以上的檢測機 構，上述檢測機構在樣品調(diào)劑對照組的標記核酸序列及樣品中檢測用于測試的一個以上的 靶核酸序列。可使用內(nèi)置有用于擴增及檢測反應容器內(nèi)的核酸序列的光學檢測儀的優(yōu)選的 熱處理裝置(美國專利第6369893號；美國專利第6391541號）。并且，具有用于控制反應混合 物的溫度，并在上述反應混合物中檢測核酸序列的適合本發(fā)明的許多其他公知的方法。
[0199] 并且，優(yōu)選地，用于在樣品調(diào)劑對照組的質(zhì)量控制物質(zhì)及樣品中進行測試的一個 以上的質(zhì)量控制物質(zhì)的檢測使用探針來執(zhí)行。優(yōu)選地，反應容器具備一個以上的透明或透 光性壁面，通過光學來檢測的探針的信號能夠通過上述壁面。優(yōu)選地，捕獲探針能夠使用于 檢測及量化核酸序列。使用核酸捕獲探針的分析法具有多種。這些捕獲探針中一部分在與 其他分子或一部分(moiety)進行相互作用的過程中，因變化而生成在熒光源的熒光發(fā)光中 具有變化的信號。
[0200] 作為用于擴增產(chǎn)物的檢測的其他優(yōu)選的方法，熒光探針由通過熒光報道染料 (fluorescent reporter dye)模塊來實現(xiàn)標記化的低核苷酸組成。捕獲探針的分裂引起報 道染料的熒光強度的增加。
[0201] 為了在樣品內(nèi)確認靶生物分子的檢測或者靶生物分子的缺乏，需要控制樣品調(diào)劑 的污染。這就是樣品調(diào)劑對照組需要接受與樣品內(nèi)的靶實體(例如，含有生物分子的靶細 胞、孢子、病毒或微生物）同樣的處理的理由。若樣品檢測出制造對照組的質(zhì)量控制物質(zhì)，則 視為滿足的樣品調(diào)劑。若不能夠檢測質(zhì)量控制物質(zhì)的存在，則視為不適當?shù)臉悠氛{(diào)劑，并將 對靶核酸序列的測試結果視為"未定"。優(yōu)選地，在質(zhì)量控制物質(zhì)的存在與否通過以下方式 來檢測:從能夠與靶探針相結合的捕獲探針的信號檢測限值，例如，以針對分析法視為有效 的方式?jīng)Q定是否超出需要滿足或超過的預先設定的熒光發(fā)光的限值。
[0202]流體控制裝置能夠根據(jù)需要的協(xié)議來由電腦來控制。若使用單閥，則可能只因一 個失敗要素而生成高制備收益率。流體控制及處理結構部件的組合能夠獲得緊湊的裝置 (例如，小型整塊式），且能容易地實現(xiàn)成形及組裝的自動化。如上所述，這些系統(tǒng)能夠有利 地包括稀釋及混合能力、中間清洗能力及強有力的加壓能力。系統(tǒng)內(nèi)的流體路徑通常被關 閉，以便最小化系統(tǒng)內(nèi)的流體的污染或容易收容及控制這些流體。反應容器能夠便利地分 離及更換，且能夠在幾個實施例中廢棄。
[0203] 本發(fā)明提供生物分子的分析方法及裝置，其特征在于，用于分析利用上述生物分 子和分析單鏈核酸的結合信息數(shù)據(jù)的生物學意義的結構包括:接收所輸入的患者組的上述 生物分子和分析單鏈核酸的結合信息和對照組的上述生物分子和分析單鏈核酸的結合信 息數(shù)據(jù)，并構建數(shù)據(jù)庫的模塊;利用所輸入的上述結合信息數(shù)據(jù)，來在分析系統(tǒng)中執(zhí)行預處 理的模塊;借助預處理的上述結果來生成患者模型的模塊;加載所生成的上述模型并適用 于住院患者來執(zhí)行盲測(Blind test)診斷的模塊；以及通過交叉驗證評價系統(tǒng)的性能的模 塊。
[0204] 在本發(fā)明中，利用上述生物分子和分析單鏈核酸的結合信息數(shù)據(jù)的生物學意義預 測系統(tǒng)僅為示例性的診斷，本發(fā)明并不局限于此。
[0205] 通過本發(fā)明生成的許多生物分子和分析單鏈核酸的結合信息數(shù)據(jù)作為具有高層 次特征的龐大數(shù)量的信息，可生成與細胞、組織或者疾病有關的多種信息。在利用所輸入的 上述數(shù)據(jù)在分析系統(tǒng)中執(zhí)行預處理的模塊找出對患者狀態(tài)產(chǎn)生影響的特征，而用于提高分 類性能的多變量分析方法是為了準確的治療和診斷而找出重要變數(shù)來縮小層次，或者通過 特性的變形來找出主要特質(zhì)的特征選擇(Feature Selection)程序。
[0206]具體地，特征抽取根據(jù)是否將類信息使用于學習來具有無監(jiān)督學習 (Unsupervised Learning)方式或監(jiān)督學習 （Supervised Learning)方式。主要使用于無監(jiān) 督學習方式中的主成分分析(PCA，Principal Component Analysis)或獨立成分分析(ICA， Independent Component Analysis)能夠考慮變數(shù)的特征來抽取特征。監(jiān)督方式為利用類 信息和變數(shù)之間的常規(guī)意義或變數(shù)之間的相互關系來選擇變數(shù)的方式。這個方式能夠在具 有的特質(zhì)集合中向前(Forward)或者向后(Backward)依次添加或刪除特質(zhì)，并通過適用于 分類器的功能來計算出主要特質(zhì)。
[0207]根據(jù)所預處理的上述結果來執(zhí)行學習，從而生成患者模型的模塊為將所選擇的特 質(zhì)通過適合的分類器(Classifier)按各等級進行分類的程序。
[0208] 本發(fā)明使用了人工神經(jīng)網(wǎng)絡(Artificial Neural Network)，但因為根據(jù)輸入和 輸出來決定動作的特性，應用于模式識別、函數(shù)逼近、分類技術等多種領域。人工神經(jīng)網(wǎng)絡 的結構由層(1 ay er )、節(jié)點(node s )、神經(jīng)網(wǎng)絡之間的連接加權值構成。本發(fā)明所使用的神經(jīng) 網(wǎng)絡層之間的連接方式為前饋(Feed-forward)方式。根據(jù)輸入模式，利用對各節(jié)點的神經(jīng) 網(wǎng)絡的連接加權值和激活函數(shù)來計算出輸出值。當通過所生成的結合信息來處理一件事 時，若推演的值和實際結果值不同，則將所計算出的值與實際結果值進行比較，并反復執(zhí)行 較少誤差的過程來找出。
[0209] 本發(fā)明提供生物分子分析方法及裝置，其特征在于，生成上述患者模型的方法選 自由線性模型（linear models)、支持向量機（support vector machines)、神經(jīng)網(wǎng)絡 (neural networks)、分類回歸樹（classification and regression trees)、集成學習法 (ensemble learning methods)、判別分析（discriminant analysis)、最鄰近法（nearest neighbor method)、貝葉斯網(wǎng)絡（Bayesian networks)、獨立成分分析（independent components analysis)組成的組中。
[0210] 對于未能證明準確而綜合性的原理(Mechanism)的大多數(shù)疾病而言，可以說基于 事例的診斷的重要性非常大。但是，基于特定機器學習技術來考慮的現(xiàn)有事例基礎機器學 習推理系統(tǒng)由于準確度低，因此持續(xù)地需要開發(fā)得到改善的系統(tǒng)。并且，現(xiàn)有的系統(tǒng)只開發(fā) 成利用所有已學習的臨床檢查項目的疾病鑒別器，且沒有提供能夠使用各疾病的臨床檢查 項目的重要度或優(yōu)先順序。
[0211]本發(fā)明涉及基于用來支援醫(yī)生的準確的疾病診斷的事例來利用機器學習推理的 疾病診斷及檢查項目選定系統(tǒng)，涉及通過疾病鑒別器來分析新患者的檢查信息，并判斷疾 病，選定用于對基于預防診斷的各疾病進行最終判別的最小的重要檢查項目，并提供的系 統(tǒng)，上述疾病鑒別器為通過患者的事例數(shù)據(jù)庫(Database)來訓練的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(Neural Network)進行的機器學習機。通過機器學習推理的疾病診斷技術單獨適用機器學習技術來 構成。生成上述患者的模型的方法具有線性模型（linear models)、支持向量機（support vector machines)、神經(jīng)網(wǎng)絡（neural networks)、分類回歸樹（classification and regression trees)、集成學習法（ensemble learning methods)、判別分析（discriminant analysis)、最鄰近法(nearest neighbor method)、貝葉斯網(wǎng)絡（Bayesian networks)、獨 立成分分析（independent components analysis)等。
[0212] 在本系統(tǒng)的結構及在業(yè)務中的應用可分成兩種結構，g卩，僅用于診斷的獨立 (stand a 1 one)形態(tài)的診斷系統(tǒng)和現(xiàn)有的醫(yī)院信息系統(tǒng)，即，能夠由與醫(yī)囑傳輸系統(tǒng)(0CS， Order Communication Syste)、醫(yī)學影像歸檔與通信系統(tǒng)（PACS，Picture Archiving and Communication Systems)、實驗室信息系統(tǒng)（LIS，Laboratory Information Management System)等相連接的聯(lián)合系統(tǒng)構成。為了與聯(lián)合系統(tǒng)的聯(lián)動，需要依據(jù)健康信息交換第七層 協(xié)議（HL7，Health Level Seven)及醫(yī)療數(shù)字影像傳輸協(xié)議（DIC0M，Digital Imaging and Communications in Medicine)的規(guī)章來構建系統(tǒng)。作為初期模型，本系統(tǒng)與病人監(jiān)護系統(tǒng) (PMS，Patient Monitoring System)聯(lián)動，來提高了診斷的準確度。并且，不僅是病人監(jiān)護 系統(tǒng)，而且還開發(fā)了與醫(yī)囑傳輸系統(tǒng)、電子病歷(EMR，Electronic Medical Record)、醫(yī)學 影像歸檔與通信系統(tǒng)等多種醫(yī)療信息系統(tǒng)相聯(lián)動的系統(tǒng)，從而能夠開發(fā)成包含有多種疾病 因子的更準確的診斷系統(tǒng)。
[0213] 本發(fā)明提供利用分析單鏈核酸及基準物質(zhì)的生物分子分析方法，其特征在于，上 述生物試樣選自由細菌、真菌類、病毒、細胞株及組織組成的組中，上述生物分子選自由蛋 白質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)、多糖體、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體及酶組成的組中的至少一 種。
[0214] 以下，參照附圖和實施例對本發(fā)明的基準物質(zhì)及生物芯片的制備方法、由利用它 們的兩個或者兩個以上的生物分子組成的生物試樣中的生物分子的分析方法進行詳細說 明。以下的具體例僅用于以例示性的方式說明本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明的范圍。
[0215] 實施例1.制備隨機堿基序列單鏈核酸
[0216] 利用具有如下的隨機的堿基序列的單鏈的脫氧核糖核酸寡核苷酸，通過聚合酶鏈 式反應(PCR，Polymerase Chain Reaction)來制備雙鏈的脫氧核糖核酸之后，通過體外轉(zhuǎn) 錄來制備了單鏈的核糖核酸庫(隨機單鏈核酸）。
[0217] 5，-GGGAGAGCGGAAGCGTGCTGGGCC N40 CATAACCCAGAGGTCGA TGGATCCCCCC-3'（其 中，帶下劃線的堿基排列為核酸庫的固定的部分，N40表示A、G、T及C等堿基以隨機方式存在 的序列部分。）
[0218]利用于聚合酶鏈式反應的FW引物能夠與上述堿基排列的帶下劃線的堿基的5'末 端進行堿基結合，并包含有用于噬菌體T7的核糖核酸聚合酶的啟動子堿基序列。
[0219]利用于聚合酶鏈式反應的RE引物能夠與上述堿基排列的帶下劃線的堿基的3'末 端相堿基結合。并且，F(xiàn)W引物和RE引物可分別可含有用于實現(xiàn)之后的克隆化的EcoRI和 BamHI等限制酶切斷堿基序列。
[0220] 與生物試樣發(fā)生反應的隨機單鏈核酸為包含2'-F_置換嘧啶的核糖核酸庫，以如 上所述的方式設置并制備脫氧核糖核酸核酸庫轉(zhuǎn)錄組及聚合酶鏈式反應引物，從而以聚合 酶鏈式反應及體外轉(zhuǎn)錄方法準備。
[0221] 聚合酶鏈式反應將lOOOpmoles單鏈核酸、2500pmoles聚合酶鏈式反應的引物對 (5P7)在50mM KCl、10mM Tris-Cl(pH 8.3)、3mM MgC12、0.5mM dNTP(dATP、dCTP、dGTP及 dTTP)、0.1U Taq DNA Polymerase(Perkin-Elmer，F(xiàn)oste;r City Calif.)中執(zhí)行聚合酶鏈 式反應之后，通過QIAquick-spin PCR純化柱（凱杰（QIAGEN Inc.，Chatsworth Calif.)公 司）來實施了純化。
[0222] 包含2'-F_置換嘧啶的隨機單鏈核酸通過體外轉(zhuǎn)錄來合成，并通過純化來準備。將 200pmoles雙鏈脫氧核糖核酸、40mM Tris-Cl(pH 8.0)、12mM MgC12、5mM DTT、lmM spermidine、0.002%Triton X-100、4%PEG 8000、5U T7RNA Polymerase、lmM ATP、GTP、 3mM 2'F-CTP及2'F-UTP在37°C溫度下進行6~12小時的反應之后，通過Bio-Spin 6柱色譜 (佰樂生命醫(yī)學產(chǎn)品公司（Bio-Rad Laboratories，Hercules Calif ?))純化之后，檢索了利 用UV分光儀純化的核酸的量及其純度。
[0223] 實施例2.制備與人類血清蛋白質(zhì)相結合的生物分子結合單鏈核酸
[0224] 2-1.生物分子-單鏈核酸復合物的確保
[0225] 2-1-U青洗方法
[0226] 在本發(fā)明中，由兩種或兩種以上的生物分子組成的生物試樣為人類血清蛋白質(zhì)。 將在實施例1中合成的隨機單鏈核酸的1〇15堿基序列/L的濃度溶液以200pmol/L的濃度在選 擇緩沖液(50mM的TrisCl(pH7 ? 4)、5mM的KC1、100mM的NaCl、ImM的MgCl2、0 ? 1 % 的NaN3)中，以 80°C的溫度加熱10分鐘之后，放置于冰中10分鐘。添加所使用的單鏈核酸的5倍的酵母轉(zhuǎn)運 核糖核酸（tRNA，Transfer Ribonucleic Acid) (yeast tRNA，Life Technologies公司）及 0.2%牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin，Merck公司），來準備了反應溶液。
[0227] 將包含有基準物質(zhì)的10iil的血清生物試樣添加于90yl的上述反應溶液中，并加入 硝酸纖維素膜盤(nitrocellulose membrane disc)搖晃30分鐘，從而實施了反應。從上述 準備的核糖核酸單鏈核酸處理于附著有血清生物試樣的盤中，并反應了30分鐘。
[0228] 在反應之后，通過如下所述的洗滌緩沖液反復進行清洗過程，從而通過一次的選 擇過程來去除了未結合的核糖核酸單鏈核酸，確保了與人類血清生物試樣的人類血清蛋白 質(zhì)相結合的單鏈核酸的制備所需的人類血清蛋白質(zhì)(生物分子)_單鏈核酸復合物。
[0229] 為了確保上述生物分子-單鏈核酸復合物，洗滌緩沖液使用0至lx的Selex緩沖液 或0至500mM的EDTA溶液。通過執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應，擴增制備了用于指示將所確保 的復合物與血清蛋白質(zhì)相結合的核糖核酸(生物分子結合單鏈核酸）的脫氧核糖核酸池。此 外，為了制備與外部基準物質(zhì)結合額單鏈核酸，能夠在確保人類血清蛋白質(zhì)-單鏈核酸復合 物的同時確保外部標準物質(zhì)-單鏈核酸結合復合物。
[0230] 并且，以通過將所確保的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的脫氧核糖核酸克隆于核外 遺傳基因來確保單克隆的過程，完成了生物分子結合-單鏈核酸的制備。與這些生物分子相 結合的單鏈核酸的堿基序列的決定通過分離核外遺傳基因來執(zhí)行。
[0231] 用于生成生物分子的實驗方案的本發(fā)明的生物芯片所使用的捕獲探針的堿基序 列，使用與人類血清蛋白質(zhì)（生物分子)相結合的上述單鏈核酸的堿基序列信息進行設計。 因此為了選定單鏈核酸以及制備捕獲探針，在使用對二維結構實施建模的MF0LD程序來確 認二維結構及結構體自由能之后，選定具有穩(wěn)定度最高的二維結構的單鏈核酸，并以此為 基礎設計捕獲探針。
[0232] 外部標準物質(zhì)選定五個植物特異蛋白質(zhì)，通過大腸菌表達系統(tǒng)使相應的蛋白質(zhì)表 達之后，分離蛋白質(zhì)，并通過指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進化方法確保了與外部標記物相結合 的單鏈核酸。通過它們的堿基序列來設計了與外部標準物質(zhì)相應的捕獲探針。
[0233] 2-1-2.毛細管電泳
[0234] 將以上合成的隨機單鏈核酸的1015堿基序列/L的濃度溶液以200pmol/L的濃度放 入反應溶液[lOOmM 1^8-11(：1化118.2)、2001111的似(：1及10111]\1的]\%(：12]，并在80°(：的溫度下加 熱10分鐘之后，放置于冰中10分鐘。添加所使用的單鏈核酸的5倍的酵母轉(zhuǎn)運核糖核酸 (tRNA，Transfer Ribonucleic Acid)(yeast tRNA，美國生命技術公司（Life Technologies))及0 ? 2%牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin，默克公司（Merck))， 來準備了反應溶液。
[0235] 將10iil的血清生物試樣添加于90iil的上述反應溶液，并反應了 30分鐘。將上述反 應混合溶液作為緩沖溶液(50mMTris-HCl，pH8.2)實施了毛細管電泳。本發(fā)明的利用毛細管 電泳的所有分析通過使用安裝有fused-silica capillary(美國貝克曼庫爾特公司 (Beckman Coulter);長 37cmX 內(nèi)徑 75m)的 P/ACE 5000CE-LIF system(美國貝克曼庫爾特 公司）來實施。通過LIF system內(nèi)的檢測器(detector)來捕集以附著于系統(tǒng)的488nm的3mW 氬離子激光器(Ar-ion)的方式激發(fā)（excitation)焚光物質(zhì)，并通過520nm的過濾器排放 (emission)的信號。
[0236] 利用0.2-um孔徑（pore size)過濾器來過濾使用于分析及毛細管處理的所有溶 液，毛細管在分別滴落1N的NaOH和蒸餾水5分鐘，并進行清洗之后使用，各個電泳之間利用 1N的NaOH、蒸餾水及緩沖溶液來分別清洗毛細管2分鐘。
[0237] 在此，通過10kV的電壓實施電泳并分析了其結果。以利用毛細管電泳來分析生物 分子-單鏈核酸的復合物生成的圖表，來確認了生物分子-單鏈核酸復合物以特異性的方式 生成并分離。
[0238] 通過對分離的復合物執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應，擴增制備了指示與血清蛋白質(zhì) 相結合的核糖核酸(生物分子結合單鏈核酸）的脫氧核糖核酸池。此時，能夠通過反復實施 多次上述的選擇和擴增過程，來制備生物分子結合單鏈核酸。
[0239] 2-1-3.硝酸纖維素和尼龍的結構體
[0240]將以上合成的隨機單鏈核酸的1015堿基序列/L的濃度溶液以200pmol/L的濃度放 入反應溶液[lOOmM 1^8-11(：1化118.2)、2001111的似(：1及10111]\1的]\%(：12]中，并在80°(：的溫度下 加熱10分鐘之后，放置于冰中10分鐘。添加所使用的單鏈核酸的5倍的酵母轉(zhuǎn)運核糖核酸 (tRNA，Transfer Ribonucleic Acid)(yeast tRNA，美國生命技術公司（Life Technologies))及0 ? 2%牛血清白蛋白（BSA，bovine serum albumin，默克公司（Merck))， 來準備了反應溶液。
[0241] 將lOyl的血清生物試樣添加于90yl的上述反應溶液之后，在上述準備的核糖核酸 單鏈核酸反應30分鐘，來生成生物分子-單鏈核酸復合物。
[0242] 在與人類血清生物試樣(生物分子)相結合的生物分子結合單鏈核酸的選定中，若 將上述反應混合溶液向由硝酸纖維素(nitrocellulose)和尼龍(nylon)組成的結構體處理 并施加壓力，則生物分子-單鏈核酸復合物位于硝酸纖維素過濾器上，而未結合的單鏈核酸 位于尼龍上。回收上述硝酸纖維素過濾器，并利用多種洗滌緩沖液反復實施清洗過程，從而 通過一次性選擇過程來去除了硝酸纖維素過濾器中的未結合的單鏈核酸，確保了人類血清 蛋白質(zhì)(生物分子)_單鏈核酸復合物。
[0243] 為了確保生物分子-單鏈核酸復合物，洗滌緩沖液使用0至lx的Selex緩沖液或0至 500mM的EDTA溶液。通過執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應，擴增制備了用于指示將所確保的復合 物與血清蛋白質(zhì)相結合的核糖核酸(生物分子結合單鏈核酸）的脫氧核糖核酸池。此時，也 能夠通過反復實施多次上述選擇和擴增過程來制備生物分子結合單鏈核酸。
[0244] 2-2.生物分子結合單鏈核酸的制備
[0245] 通過對通過上述步驟確保的復合物執(zhí)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應，擴增制備了指示 與血清蛋白質(zhì)相結合的核糖核酸(生物分子結合單鏈核酸）的脫氧核糖核酸池。此時，也能 夠通過反復實施多次上述選擇和擴增過程來制備生物分子結合單鏈核酸。
[0246] 以通過將所確保的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的脫氧核糖核酸克隆于核外遺傳 基因來確保單克隆的過程，完成了生物分子結合-單鏈核酸的制備。與這些生物分子相結合 的單鏈核酸的堿基序列的決定通過分離核外遺傳基因來執(zhí)行。
[0247] 用于生成生物分子的實驗方案的本發(fā)明的核酸芯片所使用的捕獲探針的堿基序 列，使用與人類血清蛋白質(zhì)（生物分子)相結合的上述單鏈核酸的堿基序列信息進行設計。 因此為了選定單鏈核酸以及制備捕獲探針，在使用對二維結構實施建模的MF0LD程序來確 認二維結構及結構體自由能之后，選定具有穩(wěn)定度最高的二維結構的單鏈核酸，并以此為 基礎設計捕獲探針。
[0248] 以通過將所確保的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應產(chǎn)物的脫氧核糖核酸克隆于核外遺傳 基因來確保單克隆的過程，完成了生物分子結合-單鏈核酸的制備。與這些生物分子相結合 的單鏈核酸的堿基序列的決定通過分離核外遺傳基因來執(zhí)行。
[0249] 用于生成生物分子的實驗方案的本發(fā)明的核酸芯片所使用的捕獲探針的堿基序 列，使用與人類血清蛋白質(zhì)（生物分子)相結合的上述單鏈核酸的堿基序列信息進行設計。 因此為了選定單鏈核酸以及制備捕獲探針，在使用對二維結構實施建模的MF0LD程序來確 認二維結構及結構體自由能之后，選定具有穩(wěn)定度最高的二維結構的單鏈核酸，并以此為 基礎設計捕獲探針。
[0250] 實施例3.質(zhì)量控制單鏈核酸的制備
[0251 ]基準物質(zhì)由從 http: //genomics .msu ? edu/plant_specific/中確保的A、B、C、D及E 等五個種類植物特異蛋白質(zhì)組成(參照表1)。
[0252]表 1
[0253]植物特異蛋白質(zhì)
[0255] 選定的五個植物特異蛋白質(zhì)在利用大腸桿菌表達系統(tǒng)使相應的蛋白質(zhì)表達后，分 離所表達的蛋白質(zhì)，并通過標準指數(shù)式富集的配體系統(tǒng)進化（Ellington，A.D. and J.ff.Szostak.1990.In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands.Nature 346:818-822;Gold，L.，P.Allen，J.Binkley，D.Brown，D.Schneider， S?R?Eddy，C?Tuerk，L?Green，S?Macdougal，and D.Tasset.1993.RNA：the shape of things to come ? pp.497-510.In：R.F.Gestelend and J.F.Atkins(eds.).The RNA World，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)來確保與基準物質(zhì)相結合 的單鏈核酸。將上述單鏈核酸命名為質(zhì)量控制單鏈核酸，通過它們的堿基序列來設計與質(zhì) 量控制單鏈核酸相應的捕獲探針。
[0256] 實施例4.生物芯片(核酸芯片)的制備
[0257] 作為固定于載玻片表面的捕獲探針，通過對與具有在實施例1中選定的堿基序列 的3000生物分子結合單鏈核酸相互補的堿基序列及具有與質(zhì)量控制單鏈核酸相互補的堿 基序列的單鏈核酸(寡核苷酸)進行有機合成（百奧尼公司（Bioneer Corporation))來準備 了捕獲探針。
[0258] 利用作為涂敷有y -氨基丙基硅烷(GAPS，Gamma Amino Propyl Silane)的玻璃載 玻片的UltraGAPSTM Coated Slide(康寧公司）來制備以規(guī)定規(guī)則粘著有捕獲探針的核酸 芯片。核酸芯片的制備使用了作為pin方式的微陳列系統(tǒng)(Microarrayer system，GenPak公 司），點距（spot spacing)使中心距（center-to-center)成為370um。將各個捕捉單鏈核酸 溶解于標準溶液來調(diào)節(jié)了濃度。此時，微陣列內(nèi)的濕度維持在70 %，并執(zhí)行了點樣 (spotting)。將所點樣的載玻片在加濕室（humidif ied chamber)中放置24~48小時之后， 在紫外線鏈結箱(UV crosslinker)中執(zhí)行烘烤(baking)過程。通過廣泛公知的方法，將捕 捉單鏈核酸固定于玻璃載玻片之后，直接對載玻片進行離心分離來進行干燥，之后在阻隔 光的情況下進行保管。
[0259] 實施例5.靶探針的制備
[0260] 以同等的量混合在實施例1中制備并使用于生物芯片(核酸芯片）的制備的單鏈核 酸所插入的核外遺傳基因和在實施例3中制備的質(zhì)量控制單鏈核酸所插入的核外遺傳基 因，來準備了核外遺傳基因池。并且，與人類血清蛋白質(zhì)等相結合的單鏈核酸池通過設計制 備上述核外遺傳基因池及聚合酶鏈式反應引物，以聚合酶鏈式反應及體外轉(zhuǎn)錄方法按照如 下步驟準備。
[0261] 在準備的核外遺傳基因池中將lpg核外遺傳基因作為轉(zhuǎn)錄組，在聚合酶鏈式反應 溶液、1 OOpM 5 ' -引物、1 OOpM 3 ' -引物及dNTP混合物（5mM的dATP、5mM的CTP、5mM的 dGTP、5mM 的dTTP)中通過標準聚合酶鏈式反應方法，以在94 °C溫度下30秒、在52 °C溫度下30秒及在72 °C溫度下20秒的條件反復執(zhí)行30次循環(huán)，從而合成雙鏈核酸，并利用QIAquick-spin PCR純 化柱(凱杰公司）來實施了純化。
[0262] 將包含2'-F_置換嘧啶的核糖核酸分子的單鏈核酸以體外轉(zhuǎn)錄的方式合成，并通 過純化來準備。
[0263] 將200pmoles雙鏈脫氧核糖核酸、40mM Tris-Cl(pH8.0)、12mM MgC12、5mM DTT、 ImM spermidine、0.002%Triton X-100、4%PEG 8000、5U T7RNA Polymerase、lmM ATP、 GTP、3mM 2 'F-CTP及2 'F-UTP在37°C溫度下進行6~12小時的反應之后，通過Bi〇-Spin6柱色 譜(佰樂生命醫(yī)學產(chǎn)品公司）來實施了純化。
[0264] 將分別以不同量包含基準物質(zhì)的基準物質(zhì)I添加于磷酸鹽緩沖溶液中。由作為基 準物質(zhì)的A、B、C、D及E等五個種類植物特異蛋白質(zhì)組成(參照表1)。由0.01pg/ml的外源生物 分子A、1.0pg/ml的外源生物分子B、100.0pg/ml的外源生物分子C、10.0ng/ml的外源生物分 子D及1.0ug/ml的外源生物分子E等組成了標準物質(zhì)I。
[0265] 使用于分析的人類血清為健康的人及具有穩(wěn)定型心絞痛的心血管疾病患者的血 清，將l〇yl的血清生物試樣添加于90iil的上述包含標準物質(zhì)I的溶液，并添加硝酸纖維素膜 (nitrocellulose membrane)盤搖晃并反應30分鐘來準備生物試樣。投入先前制備的100~ 400ng的單鏈核酸來反應30分鐘，從而生成生物分子-單鏈核酸復合物。
[0266] 將準備的單鏈核酸處理于附著有包含標準物質(zhì)I的血清生物試樣的盤，來反應了 30分鐘。選擇緩沖液或50mM的EDTA清洗三次，并以分離的方式收貨了附著有蛋白質(zhì)-單鏈核 酸的盤。
[0267] 將附著有上述所收獲的蛋白質(zhì)(生物分子)-單鏈核酸的盤或作為分析靶探針而附 著有外部標記物及蛋白質(zhì)（生物分子)_單鏈核酸的盤加入到反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應溶液， 來實現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄之后，通過標記有Cy-5的引物(5 '-Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3 '）執(zhí)行擴增反 應，從而準備了作為標記有Cy-5的單鏈核酸的分析靶探針。利用從通過對血清蛋白質(zhì)的核 外遺傳基因以及外部基準物質(zhì)的核外遺傳基因進行等量混合所得的上述核外遺傳基因池 制備的單鏈核酸，以與上述相同的方法來實施反轉(zhuǎn)錄，并通過標記有Cy-3的引物(5'-Cy3-CGGAAGCGTGCTGG GCC-3 '）來實施擴增反應，從而準備了標記有Cy-3的作為單鏈核酸的比較 靶探針。以同等量混合上述兩個溶液，來制備包含分析靶探針及比較靶探針的靶探針。
[0268] 實施例6.生物芯片(核酸芯片)和靶探針溶液的雜交反應
[0269] 將在上述實施例4中準備的靶探針溶液處理于本發(fā)明的生物芯片(核酸芯片）的捕 獲探針，并在60°C溫度下雜交4~12小時，在42°C溫度下用O.lx檸檬酸鈉緩沖溶液（SSC， Saline sodium citrate)進行清洗。此時，雜交溶液包含1M的氯化鈉、0.3M的朽1檬酸鈉 (sodium citrate)、0.5%十二烷基硫酸鈉（SDS，sodium dodecyl sulfate)或 100/ml的娃 魚精脫氧核糖核酸、〇. 2 %牛血清白蛋白或單鏈核酸。
[0270]向結束預雜交的載玻片處理在實施例3準備的靶探針溶液，并在42°C溫度下執(zhí)行 雜交(Hybridization)12小時之后，用清洗溶液清洗核酸芯片。此時，清洗溶液的組成依次 為例如，1XSSC+0 ? 2 % SDS、1XSSC+0 ? 2 % SDS、0 ? 5XSSC+0 ? 2 % SDS及0 ? 01XSSC+0 ? 2% SDS 的步 驟，各個步驟均在42 °C溫度下執(zhí)行了 30分鐘。
[0271] 實施例7.生物芯片(核酸芯片)的點探索及分析
[0272] 在上述實施例4的清洗結束之后，將載玻片通過離心分離干燥，之后利用具有用于 激發(fā)（excitation)所使用的焚光染料的適當?shù)牟ㄩL的激光（Cy5,635nm)的激光掃描器 (laser scanner，GenePix4000,奧松公司）來進行了探索。焚光圖像以多圖像標簽圖像文件 格式（multi image tagged image file，TIFF)存儲之后，通過適當?shù)膱D像分析（image analysis)軟件(GenePix Pro 3.0,奧松(Axon)公司）來分析。
[0273]每個點（spot)信號強度（signal intensity，單位:quanta)使用減去周圍背景的 基本信號的信號，此時，背景信號意味著由特定點的周圍中的四個點的周邊信號組成的局 部背景（local background)。點具有的像素(pixel)的90%以上示出超過背景信號+2標準 偏差（S.D. ;standard deviation)的信號強度時，包括在數(shù)據(jù)分析，若不滿足上述條件，貝lj 分類為不包括數(shù)據(jù)的點(bad spot)，一般不包括在分析。
[0274] 根據(jù)標記效率（Labeling efficient)的偏差（variation)利用內(nèi)標準（internal standard，IS)的信號來平準化(舉例來說，歸一化強度(Normalized Intensity)=探針強 度(Probe Intensity)/內(nèi)部標準強度（IS intensity))，在單標記(monolabeling)的情況 下，通過Cy5信道的信號強度(signal intensity)來記錄其結果，在點樣(spotting)為兩倍 以上的情況下，使用平均值。在革G單鏈核酸的信號強度(signal intensity，S)中，對點具有 的像素（pixel)求出各個信號強度之后使用它們的中值(median)(像素的中值(median value of pixel-by-pixel))。信號強度(S)利用內(nèi)標準（IS)來平準化根據(jù)標記效率的偏 差。
[0275] S'（標準值(normalized value)) =S(Cy5_參考值(reference)) X (Cy5_內(nèi)標準）
[0276] 能夠通過以上方法查明像素密度的分析結果和實際生物試樣量之間的關系，來確 認其相關關系。能夠提供將核酸芯片熒光數(shù)據(jù)圖像化，并通過所有點的圖案在生物試樣中 確認生物分子實驗方案的方法，點的圖案能夠通過層次聚類(Hierarchical Clustering) 及人工神經(jīng)網(wǎng)絡(Artificial Neural Network)等方法分析并使用。點的焚光程度根據(jù)捕 獲探針和靶探針生成的雙鏈的性質(zhì)以多樣的方式呈現(xiàn)。根據(jù)組成點的分析靶探針及比較靶 探針的量決定點的熒光程度。
[0277] 首先，上述實施例的圖像如圖6所示，基準物質(zhì)由外源生物分子A、B、C、D及E等五個 種類植物特異蛋白質(zhì)組成。將0 . 〇lpg/ml的外源生物分子A、1.0pg/ml的外源生物分子B、 100.(^8/1111的外源生物分子(]、10.01^/1111的外源生物分子0及1.0呢/1111的外源生物分子￡加 入于血清試樣中進行分析。與基準物質(zhì)相應的點的熒光程度通過質(zhì)量控制比較靶探針和質(zhì) 量控制分析靶探針的量來決定。由于知道質(zhì)量控制比較靶探針的量，因此與基準物質(zhì)相應 的點的熒光程度根據(jù)在分析生物試樣中的基準物質(zhì)形成的質(zhì)量控制分析靶探針的量來決 定。即，與基準物質(zhì)相應的點的熒光程度與包含于分析生物試樣的基準物質(zhì)的量有關。因 此，能夠?qū)⑺鼈兊南嚓P關系制成標準曲線，利用所要的點的熒光程度來對所要的點進行定 量分析。
[0278] 在本實驗中，由于比較靶探針由規(guī)定的量組成，因而點的熒光程度表示分析靶探 針的量，分析靶探針的量表示人類血清蛋白質(zhì)-單鏈核酸復合物的量。并且，上述復合物的 量表示在生物試樣中的生物分子的量。因此，能夠從點的熒光程度與點相應的生物分子的 生物試樣中，確認特定生物分子的量。最終能夠分析所生成的點的熒光程度，確認核酸芯片 的所有點的圖案，從而在人類血清中確認血清蛋白質(zhì)的實驗方案。
[0279] 即，所生成的點呈現(xiàn)出藍色-黃色-紅色的色譜為標記有與捕獲探針相結合的Cy-3 的競爭性抑制劑和標記有Cy-5的靶探針的比率以多樣方式呈現(xiàn)的現(xiàn)象，特定點的色譜的程 度表示存在于組成人類血清的特定的血清生物試樣的特定的生物分子(蛋白質(zhì)）的量，示出 核酸芯片上的所有的點的色譜的圖像在特定的生物試樣中與生物分子實驗方案相對應。
[0280] 即，在本發(fā)明的生物分子分析方法中，用于在特定點中與捕獲探針相結合來生成 雙鏈的靶探針由標記有Cy-3的比較靶探針和標記有Cy-5的分析靶探針組成，前者以規(guī)定的 量存在，但后者在人類血清中以與相應的生物分子成正比的方式存在。由此，若后者以相對 少量存在，則特定的點為藍色，若以相似的方式存在，則特定的點為黃色，若以過量的方式 存在，則特定的點為紅色。
[0281] 在核酸芯片上，通過點的分析，熒光程度根據(jù)雙鏈內(nèi)分析靶探針數(shù)而不同，這與生 物分子的數(shù)量具有相關關系。因此，用于反映組成本發(fā)明的核酸芯片的所有點的色譜的圖 像為包含未知的生物分子的生物試樣的生物分子實驗方案。
[0282] 以上的試驗結果如圖6所示，而如圖所示，在附著有捕獲探針的載玻片中，作為基 于與血清蛋白質(zhì)相結合的單鏈核酸的捕獲探針所附著的部分的點生成多種熒光程度、藍 色-黃色-紅色的色譜。
[0283] 實施例8.利用微珠的溶液陣列的制備及實驗方案的生成
[0284] 微珠能夠選自由聚苯乙稀（polystyrene)、聚甲基丙稀酸甲酯（polymethyl methacrylate)、膠乳（latex)、娃石（silica)、聚乙?。╬olyvinyltoluene)、苯乙稀乙烯基 甲苯聚合物（8七5^6116￥；[11711：01116116)及苯乙稀丁二稀聚合物（8七5^6116-131^3(11611)組成的組 中的一種來使用。并且，對上述微微珠的大小沒有限制，能夠使用微珠的表面沒有被改性的 微珠和微珠的表面被改性為羧基的微珠。
[0285] 上述固定化步驟利用羧基對微珠的表面進行改制，并利用NHS/EDC反應來固定 ELP〇
[0286] 作為固定于微珠的表面的捕獲探針，通過對與具有在實施例1中選定的堿基序列 的3000生物分子結合單鏈核酸相互補的堿基序列及具有與質(zhì)量控制單鏈核酸相互補的堿 基序列的單鏈核酸(寡核苷酸)進行有機結合來準備(百奧尼公司）。
[0287] 8-1.微珠陣列的制備
[0288] 通過利用上述捕獲探針來分別準備的微珠 (xMAP carboxylated microspheres; Luminex Corp.Austin，TX)來將捕獲探針固定于微珠的工作來制備微珠陣列。
[0289] 使用先前在實施例4中制備的捕獲探針，分別以100uM溶解捕獲探針來準備。將所 要反應的微珠與各個編號相匹配地混合好之后，分出40ul來準備(根據(jù)各個探針準備分別 不同編號的微珠，混合好并為了與探針的反應而在混合好微珠的狀態(tài)下，將40ul通過吸移 管取出并分給新管來準備）?；旌烯? 1M的MES(pH4.5) 20ul，取出2ul的準備好的探針，并與微 珠混合。之后加入新制備的 lul 的 10ml/ml EDC( l-Ethyl-3-(3_dimethylaminopropyl) carbodiimide HC1、PIERCE)溶液并實施了反應。在暗的地方搖晃約30分鐘來實施了反應。 重新添加 lul的新制備的10ml/ml的EDC溶液，并繼續(xù)反應了約20分鐘。此后，在各個管內(nèi)放 入500ul的0.02%TWeen-20溶液并進行了混合。對各個管的微珠進行離心分離來去除上層 液，并再次混合500ul的0.1 %十二烷基硫酸鈉溶液。如8，通過對各個管的微珠進行離心分 離，來去除層液。此后在150ul的TE(pH8.0)緩沖液中溶解并混合之后，保管于4暗室。
[0290] 8-2 ?實驗方案的生成
[0291 ]如上述實施例5，準備分析靶探針，例外地，通過由生物素（Biotin)標記的引物 (5 ' -Cy5-CGGAAGCGTGCTGGGCC-3 '）來執(zhí)行擴增反應，從而準備由生物素標記的作為單鏈核 酸的分析靶探針。
[0292] 在實施例8-1中制備的雜交微珠與在上述準備的分析靶探針溶解于上述雜交溶液 之后，相互發(fā)生雜交反應。在95°C溫度下反應5分鐘之后，在40 °C溫度下反應30分鐘。在此， 利用96孔過濾板(96well Filter plate)來移動結束反應的反應物之后，利用上述清洗緩 沖液來清洗三次。在清洗之后，使用稀釋了500倍的鏈霉親和素藻紅蛋白（西格瑪奧德里奇 公司，S3402)的溶液100ul，在暗室攪拌了 15分鐘。
[0293] 利用以這種方式準備的雜交微珠樣品，在LuminexlOO機器中按不同的孔(well)， 分別讀取微珠(Bead) c^LuminexlOO利用兩個激光（lazer)，其中一個計算微珠編號，另一個 計算發(fā)生反應的藻紅蛋白的量，從而以數(shù)據(jù)顯示。讀取相應的微珠，并與各個捕獲探針相結 合的革G探針的量成為微珠的焚光數(shù)據(jù)(MFI，Mean fluorescent intensity)。
[0294] 實施例9.心血管患者的血清蛋白質(zhì)分析的反應
[0295] 從圖6的結果可以確認，利用基于與人類血清蛋白質(zhì)相結合的靶單鏈核酸的核酸 芯片，能夠從人類血清確認血清蛋白質(zhì)的實驗方案，并且，健康的人A及穩(wěn)定型心絞痛心血 管疾病患者B的血清內(nèi)生物分子的實驗方案不同。
[0296] 圖7為通過流程圖來示出對利用本發(fā)明的核酸芯片來從患者的血液生物試樣中生 成的實驗方案進行按不同的疾病組組成的數(shù)據(jù)庫化的過程的順序的圖。圖8為將所生產(chǎn)的 實驗方案作為由不同的疾病組組成的數(shù)據(jù)庫及利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡的程序，對特定人的血清 生產(chǎn)生物分子實驗方案，來診斷疾病的流程圖。
[0297] 如圖8所示，能夠通過生物信息學技術來分析由從很多生物試樣中生產(chǎn)的實驗方 案構建的數(shù)據(jù)庫，來確保有用的信息。
[0298] 用于構建心血管疾病診斷用數(shù)據(jù)庫的血清生物試樣的臨床材料如以下表2所示， 未健康的人37名、穩(wěn)定型心絞痛36名、不穩(wěn)定型心絞痛27名及心肌梗塞患者27名等總共127 名。利用健康的人、穩(wěn)定型心絞痛、不穩(wěn)定型心絞痛及心肌梗塞等心血管患者的血清實驗方 案數(shù)據(jù)庫來檢查被稱為Lee2-1 (99)的人的血清生物試樣的結果如圖9,且能夠通過72.5% 的十倍交叉驗證(lOfold cross validation)來預測為健康的人。
[0299] 表 2
[0300]心血管疾病患者的臨床信息
[0301]
[0302] 用于構建肝癌診斷用數(shù)據(jù)庫的血清生物試樣的臨床材料如表3所示，健康的人19 名、非轉(zhuǎn)移性肝癌患者72名及轉(zhuǎn)移性肝癌患者11名，故肝癌患者為83名，且生物試樣的總數(shù) 為102例。
[0303]從肝癌患者和健康的人的血清蛋白質(zhì)實驗方案的數(shù)據(jù)庫中組成肝癌患者和健康 的人的患者模型之后，在上述肝癌患者的數(shù)據(jù)庫中組成轉(zhuǎn)移性患者和非轉(zhuǎn)移性患者的患者 模型。
[0304] 首先，盲(Blind)患者能夠利用肝癌患者和健康的人的患者模型，通過利用人工神 經(jīng)網(wǎng)絡的程序來區(qū)分肝癌患者，并能連續(xù)地利用轉(zhuǎn)移性患者和非轉(zhuǎn)移性患者的患者模型來 將陽性肝癌患者作為追加的利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡的程序，來確認肝癌進行步驟的轉(zhuǎn)移性狀 態(tài)，而這不僅能夠檢查轉(zhuǎn)移性狀態(tài)等疾病的進行狀態(tài)，而且還能夠檢查預后及藥物反應性 等。
[0305]利用健康的人和肝癌的血清實驗方案數(shù)據(jù)庫來檢查叫做KM的人的血清生物試樣 的結果如圖10所示，能夠通過93.0%的十倍交叉驗證（10fold cross validation)來預測 為肝癌患者。
[0306] 追加地，利用用于檢查是否轉(zhuǎn)移的健康的人、非轉(zhuǎn)移性肝癌及轉(zhuǎn)移性肝癌的血清 蛋白質(zhì)實驗方案數(shù)據(jù)庫來檢查叫做KIM的人的血清生物試樣的結果如圖8所示，能夠通過 76.0%的十倍交叉驗證(lOfold cross validation)來預測為非轉(zhuǎn)移性肝癌患者。
[0307] 表 3
[0308] 肝癌的臨床信息
[0310]通過比較健康的人和心肌梗塞患者的血清實驗方案來決定以特異方式存在于心 肌梗塞患者的點，將生物素(biotin)附著于與上述點相對應的單鏈核酸，并與鏈霉親和素 (strep tavidin)進行反應之后，對與血清生物試樣進行反應，并分離復合物，之后分離通過 電泳生成的帶，從而鑒定生物分子的過程的順序的流程圖為圖11。通過分離與所選定的單 鏈核酸相結合的蛋白質(zhì)來利用串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜儀(MALDI-T0F-T0F)設備決定蛋白質(zhì)的氨 基酸序列的圖為圖12。
[0311]通過利用附著有單鏈核酸的本發(fā)明的核酸芯片，在特定的生物試樣中，探索及分 析了生物分子的實驗方案，上述單鏈核酸基于與通過上述方法來構成生物試樣的生物分子 相結合。。
[0312] 并且，通過生產(chǎn)在醫(yī)學方面有用的生物試樣的生物分子，來制備數(shù)據(jù)庫之后，生產(chǎn) 特定的人的血清實驗方案，并通過利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡算法制備的程序，來檢查是否具有心 血管疾病及其種類，是否具有肝癌發(fā)病及轉(zhuǎn)移性程度。
[0313] 提高對由不同疾病組組成的數(shù)據(jù)庫進行比較分析，來決定有用的點，并調(diào)劑與此 相應的單鏈核酸來分離相應的蛋白質(zhì)并進行了鑒定。
[0314] 實施例10.細胞株的表面生物分子的實驗方案的生成及應用
[0315] 10-1.生物芯片(核酸芯片）的制備
[0316] 在本發(fā)明中，由兩種或兩種以上的生物分子組成的生物試樣為細胞株的例示。
[0317] 通過上述實施例2至實施例4的方法，制備了用于生產(chǎn)作為生物試樣的非小細胞肺 癌細胞株的表面生物分子的實驗方案的本發(fā)明的生物芯片。使準備的隨機單鏈核酸與肺癌 細胞株發(fā)生反應之后，使用洗滌緩沖液來清洗細胞株(生物分子)_單鏈核酸復合物，根據(jù)非 結合單鏈核酸及結合程度，使單鏈核酸解離之后，反復處理以5000xg離心分離的過程，之后 通過離心分離方法分離細胞株-單鏈核酸復合物，制備與非小細胞肺癌細胞株的表面生物 分子相結合的單鏈核酸。
[0318] 從上述制備的單鏈核酸選定克隆，來決定并分析堿基序列，選定1000單鏈核酸。合 成由通過實施例2的方法選定的1000單鏈核酸的互補的堿基序列組成的捕獲探針，并使捕 獲探針附著于固體載體上，從而制備了本發(fā)明的核酸芯片。
[0319] 10-2.細胞株的表面生物分子實驗方案生成
[0320] 利用以上述實施例4的方法制備的核酸芯片，來生產(chǎn)了小細胞肺癌細胞株(SCLC) 的表面分子的實驗方案。使小細胞肺癌細胞株與單鏈核酸池發(fā)生反應之后，清洗及分離細 胞株(生物試樣)的生物分子-單鏈核酸復合物。通過實施例3的方法擴增及標記與上述復合 物相結合的單鏈核酸。通過實施例4的方法使捕獲探針與標記的靶探針發(fā)生反應。通過實施 例5的方法執(zhí)行標記于上述靶探針的物質(zhì)的測定，并確認了非小細胞肺癌細胞株的表面生 物分子的實驗方案。
[0321] 通過選定推定為與小細胞肺癌細胞株(SCLC，Small Cell Lung Cancer)強力結合 的單鏈核酸，來合成附著有異硫氰酸焚光素(FITC，F(xiàn)luorescein isothiocyanate isomer I)的單鏈核酸，從而在與小細胞肺癌細胞株、非小細胞肺癌細胞株(NSCLC，Non Small Cell Lung Cancer)、血癌細胞株(MRC-5及THP-1)發(fā)生反應之后進行熒光拍攝的圖像如圖13所 不。
[0322] 像這樣，能夠分析利用本發(fā)明的核酸芯片來生產(chǎn)的小細胞肺癌細胞株實驗方案， 來確認所選定的單鏈核酸與小細胞肺癌細胞株相結合。
[0323] 實施例11.大腸菌的表面生物分子的實驗方案的生成及應用
[0324] 11-1.生物芯片（核酸芯片）的制備
[0325] 通過作為生物試樣的大腸菌KCTC12006和上述實施例2至實施例4的方法，來制備 了本發(fā)明的核酸芯片。使準備的單鏈核酸與大腸菌發(fā)生反應之后，使用洗滌緩沖液來清洗 大腸菌(生物分子)_單鏈核酸復合物，根據(jù)非結合單鏈核酸及結合程度，使單鏈核酸解離之 后，反復處理以5000xg離心分離的過程，之后通過離心分離方法分離大腸菌-單鏈核酸復合 物，制備了與大腸菌的表面生物分子相結合的單鏈核酸。
[0326] 從上述制備的單鏈核酸選定克隆，來決定并分析堿基序列，從而選定了 1000單鏈 核酸。通過所選定的1000單鏈核酸的互補的堿基序列來合成捕獲探針，并使捕獲探針附著 于固體載體上，從而制備了本發(fā)明的核酸芯片。
[0327] 11-2.大腸菌的表面生物分子實驗方案的生成
[0328] 在本發(fā)明中，由兩種或兩種以上的生物分子組成的生物試樣為細菌的例示。
[0329] 利用通過上述實施例6的方法來制備的核酸芯片，生產(chǎn)出大腸菌KCTC12006的表面 分子的實驗方案。
[0330] 使大腸菌與單鏈核酸池發(fā)生反應之后，清洗及分離大腸菌-靶單鏈核酸復合物。通 過實施例3的方法擴增及標記與上述復合物相結合的單鏈核酸。通過實施例4的方法使捕獲 探針與標記的靶探針發(fā)生反應。通過實施例5的方法執(zhí)行上述標記于靶單鏈核酸的物質(zhì)的 測定，并確認大腸菌的表面生物分子的實驗方案。
[0331] 以與生產(chǎn)大腸菌KCTC12006的表面生物分子實驗方案相同的方法來生產(chǎn)鼠傷寒沙 門氏桿菌(Salmonella typhimurium ATCC13311)的表面生物分子實驗方案，從而在構建數(shù) 據(jù)庫之后，基于層次聚類方法，選定特異性地與大腸菌相結合的單鏈核酸。通過表面等離子 共振裝備（SPR，Surface Plasmon Resonance) (BIAcore公司）測定上述單鏈核酸的特殊性 的結果為如圖14所示，并確認了所選定的單鏈核酸與沙門氏菌相比，更加特異性地與大腸 菌相結合。
[0332] 作為利用與大腸菌相結合的單鏈核酸及納米金粒子來測定大腸菌的方法(例，參 照韓國特許申請編號10-2006-0072480)利用從上述選定的單鏈核酸來測定溶液中是否具 有大腸菌及食物中的大腸菌的污染程度的結果如圖15所示。確認了使單鏈核酸與清洗食物 的指數(shù)富集配基系統(tǒng)進化緩沖液發(fā)生反應，并在加入納米金粒子之后添加 NaCl溶液，而沒 有大腸菌的溶液為透明的接近無色的藍色，被大腸菌污染的溶液變?yōu)榧t色，其程度與被污 染的大腸菌數(shù)成正比。
[0333]到目前為止，以優(yōu)選的實施例為中心對本發(fā)明進行了觀察。本發(fā)明所屬技術領域 的普通技術人員能夠理解在不脫離本發(fā)明的本質(zhì)特性的范圍內(nèi)能夠以變形的形態(tài)體現(xiàn)。因 此，本發(fā)明中公開的實施例應在說明的觀點進行考慮，而非限定的觀點。要解釋的是，本發(fā) 明的范圍呈現(xiàn)于并非上述說明的發(fā)明要求保護范圍，而與發(fā)明要求包含范圍等同的范圍內(nèi) 的所有不同點包括在本發(fā)明中。
【主權項】
1. 一種利用基準物質(zhì)的生物芯片的制備方法，其特征在于，包括： 選擇以質(zhì)量控制為目的的物質(zhì)，并將上述物質(zhì)決定為基準物質(zhì)的步驟； 決定能夠與由兩種或兩種以上的生物分子組成的生物試樣中包含的生物分子和/或上 述基準物質(zhì)相結合的配體的步驟； 使用被決定的配體的信息來合成捕獲探針，并將合成的捕獲探針固定于基板的步驟； 以及 使用用于選定對生物分子的生物學意義進行分析的配體的基準物質(zhì)以及從分析對象 的生物試樣中包含的生物分子準備的靶探針，來從上述生物試樣中收集生物分子與配體之 間的結合信息的步驟。2. 根據(jù)權利要求1所述的利用基準物質(zhì)的生物芯片的制備方法，其特征在于，上述物質(zhì) 不包含在所要分析的生物試樣中。3. 根據(jù)權利要求1所述的利用基準物質(zhì)的生物芯片的制備方法，其特征在于，能夠與上 述生物試樣中包含的生物分子及基準物質(zhì)相結合的配體選自由抗體、肽、單鏈核酸及適配 體組成的組中。4. 根據(jù)權利要求1所述的利用基準物質(zhì)的生物芯片的制備方法，其特征在于，決定能夠 與生物試樣中包含的生物分子相結合的生物分子結合配體的步驟包括： 使隨機單鏈核酸與生物分子發(fā)生反應，來制備生物分子-單鏈核酸復合物的步驟； 清洗上述生物分子-單鏈核酸復合物，并測定上述生物分子與上述單鏈核酸間的結合 力的大小來選擇具有規(guī)定結合力以上的生物分子-單鏈核酸復合物的步驟； 從所選擇的上述生物分子-單鏈核酸復合物中分離并擴增單鏈核酸的步驟；以及 決定所擴增的單鏈核酸的堿基序列，來決定上述生物分子結合單鏈核酸的步驟。5. 根據(jù)權利要求1所述的利用基準物質(zhì)的生物芯片的制備方法，其特征在于，選定分析 生物分子的生物學意義的配體的步驟包括： 使生物試樣和生物分子結合單鏈核酸發(fā)生反應，來形成生物分子-單鏈核酸復合物，并 分離上述復合物的步驟； 在所分離的生物分子-單鏈核酸復合物中擴增及標記上述單鏈核酸，來制備分析靶探 針的步驟；以及 將所標記的分析靶探針作為靶探針，來從生物芯片中獲得捕獲探針的結合實驗方案的 步驟。6. 根據(jù)權利要求1所述的利用基準物質(zhì)的生物芯片的制備方法，其特征在于，合成上述 捕獲探針的步驟中，合成選自由與生物分子結合單鏈核酸、上述基準物質(zhì)相結合的單鏈核 酸的堿基序列及它們的互補的堿基序列組成的組中的堿基序列。7. 根據(jù)權利要求1所述的利用基準物質(zhì)的生物芯片的制備方法，其特征在于，包括： 上述靶探針從分別以不同的量添加組成基準物質(zhì)的外源分子的生物試樣中準備分析 靶探針，或者準備分別以不同的量添加與相應于組成上述基準物質(zhì)的外源分子的捕獲探針 相結合的分析標記靶探針的分析靶探針的步驟;以及 向上述分析靶探針添加與上述捕獲探針相結合的比較靶探針，來準備上述靶探針的步 驟。8. -種生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，包括： 準備生物芯片的步驟，上述生物芯片是使用與生物試樣中所含有的生物分子相結合的 配體及與組成基準物質(zhì)的分子相結合的配體的信息來合成的捕獲探針固定于基板而成的； 獲得以生物試樣為對象，利用從與生物分子相結合的配體、與組成基準物質(zhì)的外源分 子相結合的配體制備的靶探針及生物芯片來分析的結合實驗方案的步驟;以及 比較所獲得的結合信息和已確保的結合信息數(shù)據(jù)，來分析未知的生物分子的生物學意 義的步驟。9. 根據(jù)權利要求8所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，上述生物試樣 選自由細菌、真菌類、病毒、細胞株及組織組成的組中，上述生物分子為選自由蛋白質(zhì)、碳水 化合物、脂質(zhì)、多糖體、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體及酶組成的組中的一種以上。10. -種生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，使用質(zhì)量控制基準物質(zhì)，并通 過核酸分析方法分析質(zhì)量控制單鏈核酸，來進行內(nèi)部質(zhì)量控制，上述質(zhì)量控制基準物質(zhì)用 于在包含由隨機堿基序列組成的單鏈核酸的核酸庫中選定與由兩種或兩種以上的生物分 子組成的生物試樣中的生物分子相結合的結合單鏈核酸及分析單鏈核酸。11. 根據(jù)權利要求10所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，上述質(zhì)量控 制基準物質(zhì)為不包含于所要分析的生物試樣中的生物分子。12. 根據(jù)權利要求11所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于， 包括： 從上述基準物質(zhì)制備質(zhì)量控制單鏈核酸的步驟， 從上述生物試樣中的生物分子制備結合單鏈核酸的步驟，以及 使用上述質(zhì)量控制單鏈核酸及上述結合單鏈核酸的堿基序列，來制備固定有合成的捕 獲探針的載體的步驟； 用于選定分析生物分子的生物學意義的上述分析單鏈核酸的生物試樣、基準物質(zhì)、結 合單鏈核酸、質(zhì)量控制單鏈核酸及核酸芯片使用于生成上述生物分子和上述結合單鏈核酸 的結合實驗方案。13. 根據(jù)權利要求12所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，制備上述結 合單鏈核酸的方法包括： 使由生物試樣中的生物分子及上述基準物質(zhì)組成的試樣與具有上述隨機堿基序列的 單鏈核酸發(fā)生反應，來選擇生物分子-單鏈核酸復合物的步驟； 從上述生物分子-單鏈核酸復合物分離及擴增單鏈核酸，來制備單鏈核酸脫氧核糖核 酸的步驟;以及 通過決定上述單鏈核酸脫氧核糖核酸的堿基序列，來制備上述結合單鏈核酸的步驟。14. 根據(jù)權利要求13所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，在選擇上述 生物分子-單鏈核酸復合物的方法中，清洗反應溶液中的生物分子-單鏈核酸復合物，并測 定上述生物分子與上述單鏈核酸間的結合力，來選擇規(guī)定結合力以上的生物分子-單鏈核 酸復合物。15. 根據(jù)權利要求14所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，在選擇上述 生物分子-單鏈核酸復合物的方法中，對上述反應溶液進行毛細管電泳處理，來選擇生物分 子-單鏈核酸復合物，或者用上述反應溶液來對由硝酸纖維素及尼龍組成的結構體進行處 理，來選擇生物分子-單鏈核酸復合物。16. 根據(jù)權利要求12所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，固定有上述 捕獲探針的載體選自由載玻片、生物傳感器的檢測表面、微珠及納米粒子組成的組中。17. 根據(jù)權利要求12所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，上述捕獲探 針由選自結合單鏈核酸的堿基序列、質(zhì)量控制單鏈核酸的堿基序列及它們的互補的堿基序 列中的至少一種堿基序列合成。18. 根據(jù)權利要求12所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，生成上述生 物試樣中的生物分子和結合單鏈核酸的結合實驗方案的方法包括： 從上述基準物質(zhì)、生物試樣、質(zhì)量控制單鏈核酸及結合單鏈核酸制備具有標記物質(zhì)的 分析靶探針的步驟； 混合及擴增與捕獲探針相應的上述結合單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸，來制備具 有標記物質(zhì)的比較靶探針的步驟； 混合上述分析靶探針和上述比較靶探針，來制備靶探針的步驟；以及 使上述靶探針和載體上的捕獲探針發(fā)生雜交反應，來獲得結合實驗方案的步驟。19. 根據(jù)權利要求18所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，制備上述分 析革El探針的步驟包括： 準備向生物試樣添加分別以不同的量包含基準物質(zhì)的基準物質(zhì)I的分析試樣的步驟； 分離使上述分析試樣和由結合單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸組成的單鏈核酸發(fā) 生反應來所生成的生物分子-單鏈核酸復合物及基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物的步驟;以及 從上述生物分子-單鏈核酸復合物及基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物中分離、擴增及標記單 鏈核酸，來制備分析靶探針的步驟。20. 根據(jù)權利要求18所述的生物分子分析單鏈核酸選定方法，其特征在于，制備上述分 析靶探針的方法包括： 從使生物試樣和結合單鏈核酸發(fā)生反應來所生成的生物分子-單鏈核酸復合物中分離 單鏈核酸的步驟;以及 混合所分離的單鏈核酸和分別以不同的量組成質(zhì)量控制單鏈核酸的基準物質(zhì)II，來以 擴增及標記方式制備上述分析靶探針的步驟。21. -種利用基準物質(zhì)的生物芯片的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：以由兩種 或兩種以上的生物分子組成的生物試樣為對象，使用基準物質(zhì)來將兩種或兩種以上的生物 分子分析為上述分析單鏈核酸。22. -種生物分子分析方法，其特征在于，包括如下步驟:使用用于通過使用分析單鏈 核酸來分析生物試樣中的生物分子的質(zhì)量控制基準物質(zhì)，并通過核酸分析方法來分析上述 質(zhì)量控制單鏈核酸，從而進行內(nèi)部質(zhì)量控制。23. 根據(jù)權利要求22所述的生物分子分析方法，其特征在于，通過使用上述分析單鏈核 酸來分析上述生物試樣中的生物分子的步驟通過核酸分析方法來執(zhí)行。24. 根據(jù)權利要求22所述的生物分子分析方法，其特征在于，上述質(zhì)量控制基準物質(zhì)為 不包含在所要分析的生物試樣中的生物分子。25. 根據(jù)權利要求22所述的生物分子分析方法，其特征在于，包括： 將使用分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸的堿基序列來合成的捕獲探針固定于 載體的步驟； 從基準物質(zhì)、生物試樣、質(zhì)量控制單鏈核酸及分析單鏈核酸制備具有標記物質(zhì)的靶探 針的步驟； 使上述靶探針和載體上的捕獲探針發(fā)生雜交反應，來獲得結合信息的步驟；以及 比較所獲得的上述結合信息和已確保的結合信息數(shù)據(jù)，來分析上述生物分子的生物學 意義的步驟。26. 根據(jù)權利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，制備上述靶探針的步驟包 括： 從上述基準物質(zhì)、生物試樣、質(zhì)量控制單鏈核酸及分析單鏈核酸制備具有標記物質(zhì)的 分析靶探針的步驟； 混合及擴增與上述捕獲探針相應的上述分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸，來制 備具有標記物質(zhì)的比較靶探針的步驟;以及 制備由上述分析靶探針及上述比較靶探針組成的靶探針的步驟。27. 根據(jù)權利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，固定有上述捕獲探針的載 體包括載玻片、生物傳感器的檢測表面、微珠、納米粒子等。28. 根據(jù)權利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，上述捕獲探針由與分析單 鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸的堿基序列完全互補結合的堿基序列組成。29. 根據(jù)權利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，使用如下引物，上述引物 具有標記物質(zhì)、并由具有包含上述復合物中所含有的上述分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單 鏈核酸的特定堿基序列的區(qū)域和分別指示它們的堿基序列區(qū)域的標記組成，用于標記及擴 增從上述生物分子-單鏈核酸復合物和上述基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物中分離的分析單鏈 核酸。30. 根據(jù)權利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，制備上述分析靶探針的方 法包括： 向生物試樣添加分別以不同的量組成上述基準物質(zhì)的基準物質(zhì)I，來準備分析試樣的 步驟； 分離使準備的分析試樣和由上述分析單鏈核酸及上述質(zhì)量控制單鏈核酸組成的單鏈 核酸發(fā)生反應來所形成的生物分子-單鏈核酸復合物及基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物的步驟； 以及 分離、擴增及標記分離的上述生物分子-單鏈核酸復合物及基準物質(zhì)-單鏈核酸復合物 中的上述分析單鏈核酸，來準備分析靶探針的步驟。31. 根據(jù)權利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，準備上述分析靶探針的方 法包括： 分離使上述生物試樣和上述分析單鏈核酸發(fā)生反應來生成的生物分子-單鏈核酸復合 物的步驟;以及 將分別以不同的量含有質(zhì)量控制單鏈核酸的基準物質(zhì)II混合、擴增及標記于從分離的 上述生物分子-單鏈核酸復合物中分離的分析單鏈核酸，來制備所標記的上述分析靶探針 的步驟。32. 根據(jù)權利要求31所述的生物分子分析方法，其特征在于，在分離上述生物分子-單 鏈核酸復合物的方法中，對上述反應溶液進行毛細管電泳處理，來選擇生物分子-單鏈核酸 復合物，或者用上述反應溶液來對由硝酸纖維素及尼龍組成的結構體進行處理，來選擇生 物分子-單鏈核酸復合物。33. 根據(jù)權利要求25所述的生物分子分析方法，其特征在于，上述標記物質(zhì)使用選自由 生物素、Cy2、綠色熒光蛋白、YO-PRO-I、YOYO-I、鈣黃綠素、異硫氰酸熒光素、FlourX、 ALEXA488、羅丹明110、ABI 5-FAM、俄勒岡綠500、俄勒岡綠488、RiboGreen、羅丹明綠、羅丹 明 123、鎂綠、鈣綠、T0-PR0-1、T0T0-1、ABI J0E、氟硼二吡咯530/550、Dil、氟硼二吡咯TMR、 氟硼二吡咯558/568、氟硼二吡咯564/570、Alexa546、四甲基異硫氰酸羅丹明、鎂橙、藻紅蛋 白R&B、羅丹明標記鬼筆環(huán)肽、鈣橙、派洛寧Y、羅丹明B、ABI TAMRA、玫瑰紅、Cy3.5、ABI ROX、 鈣紅、Alexa594、德克薩斯紅、尼羅紅、Y0-PR0-3、Y0Y0-3、紅藻藍素、C-藻藍素、T0PR0-3、 T0T0-3、DiD DilC(5)、氧雜羰花青、Cy5.5、Cy5及Cy3組成的組中的熒光染料。34. 根據(jù)權利要求22所述的生物分子分析方法，其特征在于，還包括： 接收通過生物分子分析方法來生產(chǎn)的患者組的上述生物分子和分析單鏈核酸的結合 信息及對照組的生物分子和分析單鏈核酸的結合信息數(shù)據(jù)，并構建數(shù)據(jù)庫的步驟，上述生 物分子分析方法包含使用用于通過使用分析單鏈核酸來分析生物試樣中的生物分子的質(zhì) 量控制基準物質(zhì)，并通過核酸分析方法來分析上述質(zhì)量控制單鏈核酸，從而進行內(nèi)部質(zhì)量 控制的步驟； 利用所輸入的結合信息數(shù)據(jù)，來在分析系統(tǒng)中執(zhí)行預處理的步驟； 借助預處理的結果來生成患者模型的步驟； 加載所生成的模型并適用在入院的患者來執(zhí)行盲測診斷的步驟；以及 通過交叉驗證評價系統(tǒng)的性能的步驟。35. 根據(jù)權利要求34所述的生物分子分析方法，其特征在于，生成上述患者模型的方法 選自由線性模型、支持向量機、神經(jīng)網(wǎng)絡、分類回歸樹、集成學習法、判別分析、最鄰近法、貝 葉斯網(wǎng)絡及獨立成分分析構成的組中。36. -種生物分子分析裝置，其特征在于，包括準備生物試樣中的生物分子的試樣處理 裝置以及由制備生物分子-單鏈核酸復合物并分析上述復合物的單鏈核酸的模塊構成的核 酸分析裝置。37. 根據(jù)權利要求36所述的生物分子分析裝置，其特征在于，上述生物分子分析裝置還 包括： 接收所輸入的患者組的上述生物分子和分析單鏈核酸的結合信息及對照組的生物分 子和分析單鏈核酸的結合信息數(shù)據(jù)，并構建數(shù)據(jù)庫的模塊； 利用所輸入的結合信息數(shù)據(jù)，來在分析系統(tǒng)中執(zhí)行預處理的模塊； 借助預處理的結果來生成患者模型的模塊； 加載所生成的模型并適用入院患者來執(zhí)行盲測診斷的模塊；以及 通過交叉驗證評價系統(tǒng)的性能的模塊。38. 根據(jù)權利要求37所述的生物分子分析裝置，其特征在于，生成上述患者模型的方法 選自由線性模型、支持向量機、神經(jīng)網(wǎng)絡、分類回歸樹、集成學習法、判別分析、最鄰近法、貝 葉斯網(wǎng)絡及獨立成分分析構成的組中。39. 根據(jù)權利要求36所述的生物分子分析裝置，其特征在于，上述生物試樣選自由細 菌、真菌類、病毒、細胞株及組織組成的組中，上述生物分子為選自由蛋白質(zhì)、碳水化合物、 脂質(zhì)、多糖體、糖蛋白、激素、受體、抗原、抗體及酶組成的組中的一種以上。40. 根據(jù)權利要求37所述的生物分子分析裝置，其特征在于，還包括利用所生成的患者 模型來第一次確認患者的疾病的步驟、連續(xù)確認患者的疾病進展的步驟以及確認預后及藥 物反應性的步驟。41. 根據(jù)權利要求40所述的生物分子分析裝置，其特征在于，上述患者模型為肝癌患者 模型，上述疾病為肝癌，確認上述疾病進展的步驟用于確認轉(zhuǎn)移狀態(tài)。42. -種生物分子分析方法，其特征在于，包括： 以由兩種或兩種以上的生物分子組成的生物試樣為對象，使生物分子分析單鏈核酸和 兩種或兩種以上的生物分子發(fā)生反應，來形成生物分子-單鏈核酸復合物的步驟； 對上述反應溶液進行毛細管電泳處理，來選擇生物分子-單鏈核酸復合物，或者用上述 反應溶液來對由硝酸纖維素及尼龍組成的結構體進行處理，來選擇生物分子-單鏈核酸復 合物的步驟；以及 通過核酸分析技術分析所選擇的上述生物分子-單鏈核酸復合物的上述分析單鏈核酸 的步驟。43. -種生物分子分析方法，其特征在于，還包括： 接收所輸入的通過生物分子分析方法生產(chǎn)的患者組的上述生物分子和分析單鏈核酸 的結合信息及對照組的生物分子和分析單鏈核酸的結合信息數(shù)據(jù)，并構建數(shù)據(jù)庫的步驟， 上述生物分子分析方法包含使用用于通過使用分析單鏈核酸來分析生物試樣中的生物分 子的質(zhì)量控制基準物質(zhì)，并通過核酸分析方法分析上述質(zhì)量控制單鏈核酸，從而進行內(nèi)部 質(zhì)量控制的步驟； 利用所輸入的結合信息數(shù)據(jù)，來在分析系統(tǒng)中執(zhí)行預處理的步驟； 借助預處理的結果來生成患者模型的步驟； 加載所生成的模型并適用在入院的患者來執(zhí)行盲測診斷的步驟；以及 通過交叉驗證評價系統(tǒng)的性能的步驟。44. 根據(jù)權利要求43所述的生物分子分析方法，其特征在于，還包括： 利用所生成的患者模型來第一次確認患者的疾病的步驟；以及 連續(xù)確認患者的疾病進展、預后及藥物反應性的步驟。45. 根據(jù)權利要求44所述的生物分子分析方法，其特征在于，上述患者模型為肝癌患者 模型，上述疾病為肝癌，確認上述疾病進展的步驟用于確認轉(zhuǎn)移狀態(tài)。
【文檔編號】C12Q1/68GK105960644SQ201480070233
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2014年5月8日
【發(fā)明人】金圣千
【申請人】金圣千