專利名稱：一種分離mRNA的纖維素磁性微米材料的制備及應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及雙功能融合蛋白CBD-SA的制備，纖維素磁性微米材料的生物活化，以及生物 活化后纖維素磁性材料在細胞或組織樣品中mRNA的分離，屬于生物技術領域。
背景技術：
磁性微球是具有磁響應性的高分子微球。纖維素磁性微米材料是采用纖維 素為主材制備的微米級別的具有超順磁性的生物活性材料。由于其具有超順磁性，且成本 低廉、材質優(yōu)良和生物相容性高，在生物醫(yī)學領域已經被廣泛應用。
磁性微米材料的活化是實現磁性微球生物學特性的重要手段。早期的活化方法主要包 括物理吸附和化學偶聯的方法。物理法結合效率低、非特異性強，且抗體易泄漏。目前， 用于mRNA分離的磁性微珠已有報道，表面活化基團包括鏈霉親和素(SA)和羧基等， 但是其活化方法均采用化學偶聯法，這種有機化學試劑的引入，增加了工藝的危險性，并 且化學試劑會使得偶聯的蛋白質的活性降低或失活；同時化學直接偶聯必然導致活性基團 臂長短、密度大，使得即使在蛋白質活性不受影響的情況下，由于其空間位阻的存在，也 降低了目的物的分離效果。因此本研究致力于研究一種操作簡單、安全可靠、高效穩(wěn)定的 配體生物偶聯方法，從而拓展磁性微米材料在生物醫(yī)學領域的發(fā)展空間。
纖維素結合域(CBD)是纖維素酶和半纖維素酶基因的組成部分，與纖維素具有高親 和力，以此作為橋聯劑將SA固定于纖維素磁性微米材料表面，由于CBD的存在，可有 效減小空間位阻，并且該偶聯為生物特異性偶聯，不易脫落，也不會引入有機試劑，能更 好的保證SA的生物活性。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的是開辟一條簡易、安全、可靠的生物活性材料致敏途徑，涉 及微米級纖維素磁性材料的制備，鏈霉親和素基因的克隆，雙功能融合蛋白纖維素結合域 -鏈霉親和素(CBD-SA)的克隆和表達，纖維素磁性微米材料的生物特異性活化，以及上 述生物活化的纖維素磁性微米材料在mRNA分離、提取等領域的應用。
本發(fā)明首先提供了一種具有生物素結合活性的鏈霉親和素蛋白，其堿基序列如序列表 1所示。
本發(fā)明同時提供了一種纖維素結合域-鏈霉親和素雙功能融合蛋白CBD-SA，是通過 基因工程方法獲得的具有生物素結合活性和纖維素結合活性的雙功能融合蛋白CBD-SA， 具體步驟如下采用微波法提取淡紫灰鏈霉菌ZG0429基因組DNA，然后采用根據GeneBank收錄的阿維丁鏈霉菌的SA基因序列(序列號為X03591 )，設計含有Wcol和￡coRI 酶切位點的上游和下游引物對鏈霉親和素(SA)基因的PCR擴增，隨后分別采用限制性 內切酶iVcol和雙酶切SA的基因PCR擴增產物，及帶有CBD標簽的pET35b(+)載 體，再采用DNA回收試劑盒回收目的片段，T4連接酶連接后轉入五.c:o/Z BL21菌株的感 受態(tài)細胞，重組質粒經PCR和雙酶切鑒定，獲得含有CBD-SA融合基因的重組質粒 pCBD-SA的五.co/z'BL21原核表達系統(tǒng)。最后，將得到的重組菌株在IPTG誘導下發(fā)酵， 收集的菌體，采用PBS緩沖液重懸，超聲波破碎處理，獲得的裂解產物進行10%的 SDS-PAGE分析和Western blot，驗證融合蛋白CBD的分子量及SA的活性。并將將上述 表達產物加入到纖維素磁性微米材料中，4"C吸附2小時，以PBS充分洗滌，隨后加入生 物素化的HRP (Biotin-HRP)，于室溫反應15min， PBS充分洗滌后加入OPD反應底物， 觀察液體顏色變化，從而確認CBD的結合活性，并再次確認SA的生物活性。
本發(fā)明還提供了一種纖維素結合域-鏈霉親和素雙功能融合蛋白CBD-SA重組菌株 pCBD-SA/￡. co/z'BL21，即表達載體pCBD-SA轉化的E co//BL21菌株。該菌株能夠在IPTG 誘導下表達雙功能融合蛋白CBD-SA。
本發(fā)明采用基因工程技術將淡紫灰鏈霉菌"/re; to/^ce:y/flve"甴/fle)鏈霉親和素(簡 稱SA)具有和生物素基因片段，定向克隆至含有纖維素結合域(簡稱CBD)的pET35b(+) 載體，構建了同時具有生物素結合活性和纖維素結合活性的雙功能融合蛋白CBD-SA的載 體，并轉入co// BL21感受態(tài)菌株，經IPTG低溫誘導表達，獲得高含量的CBD-SA融 合表達蛋白。
本發(fā)明所提供的鏈霉親和素生物活化的纖維素磁性微米材料的制備方法的步驟是 第一、取l 3g磁流體，加入到15 25mL纖維素黃膠液中，充分攪拌后采用勻漿機 在3000~24000 rpm條件下勻漿1~3 min;向上述液體中加入3~8倍體積的有機相，有機相 的組分體積比為9: 2的氯苯和四氯化碳，內含1~4%體積的司班-80，在3000~24000 rpm 再充分勻漿1~3 min;
第二、將上述勻漿液轉入300-500 mL上步所述的有機相中，300~500 rpm機械攪拌， 以50'C熱水水浴加熱，并加熱至8(TC，保溫2~4小時；
第三、棄去有機相，用無水乙醇淋洗6~8次，再用無水乙醇和水交替淋洗，最后用 水充分淋洗，獲得粒徑為3~60 pm纖維素磁性微米材料；
第四、取第三步制備的纖維素磁性微米材料1 mL，室溫下直接加入5 mL內含0.015~15 mg纖維素結合域-鏈霉親和素融合蛋白(CBD-SA)的重組pCBD-SA/五.co/f BL21 菌株的發(fā)酵菌體裂解液中，室溫振蕩反應1 3小時，或4'C過夜，然后用PBS緩沖液充分 淋洗；
本發(fā)明第一步中纖維素黃膠液的勻漿速度在3000~24000 rpm，最佳轉數為19000 rpm， 在最佳條件下能夠制得粒徑大小在5~10 pm的磁性纖維素微米材料，能獲得最佳的鏈霉親 和素偶聯效率。
第一步中乳化劑司班-80的最佳加入量為2%。
本發(fā)明方法制備的鏈霉親和素生物活化的纖維素磁性微米材料可應用于細胞或組織 中mRNA的磁性分離和提取。 mRNA的分離純化
1000rpm離心收集培養(yǎng)的雜交瘤細胞035-E61或采集動物組織，PBS反復洗漆后加入 細胞或組織裂解液使之充分裂解，隨后將用于特異性分離mRNA的biotin-olige (dT)經 緩沖液稀釋后加入到細胞裂解液中反應，使olige (dT)與mRNA末端的polyA充分結合。 將上述制備的纖維素磁性微米材料加入到細胞裂解液中，輕微振蕩使生物素與SA充分結 合，隨后通過磁性分離裝置分離磁性微米材料，并以0.5xSSC充分洗滌，最后加入到 Nuclease-Free Water進行洗脫，獲得mRNA溶液，-70°0保存?zhèn)溆没蛑苯舆M行RT-PCR鑒定。
本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果本發(fā)明利用生物橋聯劑CBD-SA直接偶聯致敏纖維素磁性 微米材料，操作簡單，方便快捷，短時間內便可獲得活化的磁性微米材料，大大簡化了活 化步驟；同時，與化學活化方法相比，生物偶聯方法有效避免了有害化學試劑的引入，降 低了工藝操作的危險性，最大程度的保證了鏈霉親和素的生物學活性，并降低了成本，提 高了工作效率。本發(fā)明可望替代傳統(tǒng)的磁性微米材料的活化方法，成為一種簡便、安全、 高效的纖維素微米材料配體偶聯新技術。通過生物特異性偶聯方法制備的纖維素磁性微米 材料可以應用于mRNA等目的核酸的分離純化。
圖1是CBD-SA的SDS-PAGE電泳和免疫印跡分析，其中
A圖為SDS-PAGE電泳分析，B圖為免疫印跡分析；各泳道條件分別為M:標準 分子量蛋白；1:含pET35 (b+)空載體的五.co/z'BL21蛋白裂解液；2和5: co//BL21 菌體蛋白；3禾B4 : co//BL21表達CBD-SA蛋白裂解液。圖2是纖維素磁性微球的環(huán)境掃描電鏡照片(x5588)。 圖3是磁性微米材料的粒徑與勻漿速度關系曲線。 圖4是CBD結合纖維素磁性微米材料的能力分析。 圖5是鏈霉親和素的最佳加入量分析。
圖6是不同方法致敏的纖維素磁性微米材料的生物素結合能力分析。
生物活化；化學活化 圖7是目的基因的RT-PCR分析。
M::標準分子量DNADL2000，從上至下分別為2000 bp， 1000 bp， 750 bp， 500 bp， 250 bp，和100 bp; 1:以生物活化的磁性微米材料從胰島組織中分離mRNA后擴增的 GLP-1受體基因；2:以生物活化的磁性微米材料從胰島組織中分離mRNA后擴增的 GAPDH基因；3:以化學活化的磁性微米材料從胰島組織中分離mRNA后擴增的GAPDH 基因；4:以生物活化的磁性微米材料從035-E61細胞系中分離mRNA后擴增的抗體輕鏈 基因；5:以生物活化的磁性微米材料從035-E61細胞系中分離mRNA后擴增的抗體重鏈 基因；6:以生物活化的磁性微米材料從035-E61細胞系中分離mRNA后擴增的P-actin 基因；7:以化學活化的磁性微米材料從035-E61細胞系中分離mRNA后擴增的P-actin 基因
具體實施方式
實施例l、 CBD-SA雙功能融合蛋白的制備
1. 淡紫灰鏈霉菌ZG0429基因組DNA的提取
采用微波法于600W微波爐中處理懸浮于100 pL裂解液(50 mmol/LTris， pH8， 25 mmol/LEDTA， 3%SDS(m/v)， 1.2% PVP (m/v))中的淡紫灰鏈霉菌ZG0429 ，時間2min， 加入400(aL65。C預熱的抽提液(10mmol/LTris， pH8， 1 mmol/LEDTA， 0.3mol/LNaAc， 1.2%PVP (m/v))，于65'C溫育20min后加入等體積的苯酚氯仿異戊醇(25: 24: 1) 及氯仿異戊醇(24: 1)抽提，以去除蛋白質，最后加入2倍體積的-20。C預冷無水乙醇， 于-20'C放置l小時后12000 rpm離心收集DNA，溶于50 ^iL滅菌水中-2(TC保存?zhèn)溆谩?br>
2. 鏈霉親和素(SA)基因的PCR擴增
根據GeneBank收錄的阿維丁鏈霉菌的SA基因序列(序列號為X03591 )，設計含有iVcoI 和五coRI酶切位點的上游和下游引物
Pl: 5' CGCCCATGGACCCGTCGAAGGAATCGAA 3'，P2: 5' GCGGAATTCTTACTGCTGGACGGCGTCGAG 3'
以上步提取的淡紫灰鏈霉菌ZG0429的基因組DNA作為模板，PCR擴增SA基因。PCR 反應條件為95'C預變性5分鐘；94°C lmin， 54°C 1 min， 72°C 1 min,共30個循環(huán)；72°C 延伸10min，對上述PCR擴增產物經序列分析，其結果與NCBI數據庫中收錄的阿維丁鏈霉 菌SA基因序列進行比對分析，同源性為93.1%。
3. 基于大腸桿菌BL21菌株的CBD-SA融合表達系統(tǒng)的構建
分別采用限制性內切酶iVcoI和五co及I雙酶切第2步得到的SA的基因PCR擴增產物，及帶 有CBD標簽的pET35b(+)載體。采用DNA回收試劑盒回收目的片段，T4連接酶連接后轉入 ￡.co" BL21菌株的感受態(tài)細胞，重組質粒經PCR和雙酶切鑒定，獲得含有CBD-SA融合基 因的重組質粒pCBD-SA的五.co/z'BL21原核表達系統(tǒng)。
4. CBD-SA融合蛋白的表達和鑒定
將第3步得到的重組菌株接種于5mL含有卡那霉素50 ng/mL的LB培養(yǎng)液中，37°C 振蕩培養(yǎng)至OD6oo達0.6時，采用終濃度為1 mmol/L的IPTG于25C誘導24小時。離心 收集的菌體，采用PBS緩沖液重懸，超聲波破碎處理5min，使菌體充分裂解，裂解產物 進行10%的SDS-PAGE分析，并進行Western blot鑒定SA的活性。即采用半干式轉印法 將SDS-PAGE分離的蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，以1%BSA (m/v)封閉后，加入2000 倍稀釋的辣根過氧化物酶標記生物素，并以二氨基聯苯胺(DAB)作為顯色底物。結果如 圖l所示，SDS-PAGE (A)和Western-blot (B)分析顯示構建的重組菌株pCBD-ProA/￡. co/z'BL21表達一個約38kDa的目的蛋白(泳道3，泳道4)，并具有SA的生物素結合活性 (泳道4)。
將上述表達產物加入到纖維素磁性微米材料中，4"C吸附2小時，以PBS充分洗滌， 隨后加入生物素化的HRP (Biotin-HRP)，于室溫反應15min, PBS充分洗滌后加入OPD 反應底物，觀察液體顏色變化，從而確認CBD的結合活性，并再次確認SA的生物活性。
實施例2、纖維素磁性微米材料的制備
取2 g磁流體，加入到20 mL纖維素黃膠液中，充分攪拌后采用勻漿機在24000、 19000、 16000、 12000、 6000和3000 rpm和條件下勻漿2 min，隨后加入100mL有機相(氯苯和 四氯化碳按照9: 2體積比混合，含2%司班-80 (v/v))，以相同轉數充分勻漿2 min。隨 后轉入400mL有機相中，400rpm機械攪拌。以50'C熱水水浴加熱，并升溫至8(TC，保溫2.5小時。棄去有機相，用無水乙醇淋洗8次，再用無水乙醇和水交替淋洗，最后用水 充分淋洗，分別獲得平均粒徑為MS1: 3.46、 MS2: 5.82、 MS3: 9.93、 MS4: 14.03、 MS5: 38.04和MS6: 61.86 pm的纖維素磁性微米材料，其中粒徑為5.82阿的MS2的電鏡照片 如圖2，呈現良好的表征，粒徑與勻漿轉速關系如圖3。
實施例3、不同粒徑的纖維素磁性微米材料的蛋白偶聯效率
分別取實施例2中制備的六種粒徑的纖維素磁性微米材料各100 pL，將其加入含有 CBD-EGFP的發(fā)酵裂解液中，室溫振蕩。在30 min時用熒光檢測儀測定原發(fā)酵裂解液的 熒光發(fā)射強度，同時測定上述纖維素磁性微米材料吸附30 min后發(fā)酵裂解液的熒光發(fā)射 強度，計算纖維素磁性材料所消耗的熒光發(fā)射強度，即偶聯效率。如圖4所示，偶聯效率 最高的纖維素磁性材料的粒徑為5.82 pm，確定最佳制備勻漿速度為19000 rpm。
實施例4、纖維素磁性微米材料的生物致敏效率
取上述實施例2中制備的粒徑為5.82 pm的纖維素磁性材料1 mL，室溫下直接與5 mL (含CBD-SA0.015、 0.05、 0.15、 0.5、 1.5、 5和15 mg)重組pCBD-SA/￡. co//BL21菌株 的發(fā)酵菌體裂解液振蕩反應2小時后用PBS緩沖液反復淋洗8次，分別取100 活化的 材料加入500倍稀釋的生物素化的HRP100nL，室溫反應30min， PBST充分洗滌后加入 OPD顯色，測定490 nm吸光度。如圖5所示，該纖維素磁性材料的SA的最佳偶聯量為 0.71 mg/mL。
實施例5、纖維素磁性微米材料化學致敏
取上述實施例2中制備的粒徑為5.82 pm纖維素磁性材料，室溫下加入2 mL環(huán)氧氯 丙烷和4 mL 3 MNaOH振蕩3小時，隨后加入5%氨水4 mL室溫靜置6小時，然后加入 1%戊二醛反應2小時，之后加入含有與生物活化方法相同量的0.71 mg SA的 Na2C03-NaHC03溶液(0.01 M， pH9.6), 4。C反應12小時后以l M甘氨酸中和未完全反 應的戊二醛，最后用PBS緩沖液反復淋洗8次，即得到化學方法致敏的SA纖維素磁性材 料。
實施例6、纖維素磁性材料的SA活性分析
分別取實施例4和實施例5中以粒徑為5.82 pm的纖維素磁性材料致敏的磁性微球 0.3、 1、 3、 10、 30和100pL，加入500倍稀釋的生物素化的HRP100pL，室溫反應30min，PBST充分洗滌后加入OPD顯色，測定490nm吸光度，繪制曲線。結果如圖6顯示，兩 種活化方法均具有與生物素反應的活性，但生物活化致敏的效果明顯好于化學方法，即生 物偶聯方法能夠更好的保證SA的活性。
實施例7、利用生物致敏的纖維素磁性材料分離細胞中mRNA
取離心收集培養(yǎng)的雜交瘤細胞035-E611xl(^個細胞，用預冷滅菌的lxPBS清洗細胞 1次后，加入400 GTC Extraction/BME Buffer,使細胞懸浮后轉移到1.5 mL離心管中， 用1 mL注射器反復吹吸5次，使細胞完全裂解。加入800 Dilution/BME Buffer,顛倒 混勻后加入60 pM Oligo(dT) Probe，充分混勻，于70。C溫育5 min。隨后室溫12000 rpm 離心10min，小心收集上清。吸取200^L實施例4中最佳生物致敏的纖維素磁性材料懸 浮液于5mL離心管中，置于磁力架上，用SSC緩沖液清洗三次，最后懸浮于lmLSSC 緩沖液。將上述上清液與磁性微米材料混和使之均勻，于室溫靜置2min，然后采用磁力 架捕獲磁球，用SSC緩沖液清洗三次，最后一次清洗時盡量將SSC緩沖液吸凈。最后加 入200 Nuclease-Free Water懸浮以洗脫其吸附的mRNA，轉移此洗脫液至1.5 mL離心 管中，立即進行RT-PCR實驗或-70'C保存。
將分離的mRNA進行RT-PCR分別擴增(3-actin基因、單克隆抗體基因的重鏈與輕鏈 可變區(qū)和GLP-1受體基因，擴增引物分別為(actinl: 5'-TGA CAG GAT GCA GAA GGA GA-3'， actin2: 5'-GCTGGAAGGTGGACAGTGAG國3，； VL-1: 5，-ACC CAGTCT CCA GCA ATC -3， ， VL-2: 5，- CCC AAG CTT CTT GGT CCC TCC ACC G -3， ； VH1: 5，-CCG GAA TTC CTG CAG CAG TCA GGA CCT GAG CTG G-3， ， VH2: 5'-GCT TGA TAC TGT TAC TGT TGT TCC TTG TCC CCA TGC ACA GAA ATA GAC隱3，)，程序為94 3 min; 94。C 45 s， 54°C45s， 72'Clmin， 30個循環(huán)；72。C10min; 4°C+oo。隨后將擴增產物進行凝膠電泳 分析，10%瓊脂糖凝膠電泳如圖7泳道4、 5、 6所示，均可以擴增出目的基因。
與此同時，采用化學致敏的纖維素磁性微米材料采用相同的方法分離035-E61細胞系 的mRNA，并進行p-actin基因的RT-PCR，電泳分析結果如圖7泳道7所示，結果表明， 生物活化與化學活化的纖維素磁性微米材料在mRNA分離效果上幾乎一致，無顯著差異。
實施例8、利用生物致敏的纖維素磁性材料分離組織中的mRNA
將大鼠麻醉后解剖，取50mg胰島組織并切碎，置于裂解液(4M異硫氰酸胍，25 mM
檸檬酸鈉和1% p-巰基乙醇，pH 7.0)中勻漿使之粉碎，然后加入1 mL Dilution/BME Buffer,
顛倒混勻后加入80 pM Oligo(dT) Probe，充分混勻，于70。C溫育5 min。隨后室溫12000 rpm離心10min，小心收集上清。吸取100 實施例4中最佳生物致敏的纖維素磁性材料懸 浮液于5mL離心管中，置于磁力架上，用SSC緩沖液清洗三次，最后懸浮于lmLSSC 緩沖液。將上述上清液與磁性微米材料混和使之均勻，于室溫靜置2min,然后采用磁力 架捕獲磁球，用SSC緩沖液清洗三次，最后一次清洗時盡量將SSC緩沖液吸凈。最后加 入200 ^LNuclease-Free Water懸浮以洗脫其吸附的mRNA,轉移此洗脫液至1.5 mL離心 管中，立即進行RT-PCR實驗或-70'C保存。
將分離的mRNA進行RT-PCR分別擴增GAPDH基因和GLP-1受體基因，擴增分別 為引物分別為(GAPDH1: 5，- TGAAGG TCG GAG TCAACG GAT TTG GT - 3，， GAPDH2: 5，- CAT GTG GGC CAT GAG GTC CAC CAC - 3，； GLP-la: 5， - CTC AAG CTT ATG GCC GTC ACC CCC AGC CTG CTG CGC CTG- 3, ， GLP-lb: 5， - ACA CGA ATT CCC CTC ATA TTCCCTGTCCCCAG-3，)，程序為94 5 min; 94°C 1 min， 54°C 45 s， 72°C 1 min， 30 個循環(huán)；72'ClOmin; 4°C+oo。隨后將擴增產物進行凝膠電泳分析，10%瓊脂糖凝膠電泳 如圖7泳道1、 2所示，均可以擴增出目的基因。
與此同時，采用化學致敏的纖維素磁性微米材料采用相同的方法分離035-E61細胞系 的mRNA，并進行GAPDH基因的RT-PCR，電泳分析結果如圖7泳道3所示，結果表明， 生物活化與化學活化的纖維素磁性微米材料在mRNA分離效果上幾乎一致，無顯著差異。序列表
<110>南開大學
<120>—種分離mRNA的纖維素磁性微米材料的制備及應用
<160> 1
<210〉 1
<211>477
<212>DNA
<213>淡紫灰鏈霉菌(S鄉(xiāng)to，" /ave油/cre) <220> <221> CDS <222> (1)…(477)
<400>
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ggcascccgctcgscgccgtccagcag 47權利要求
1、一種鏈霉親和素生物活化的纖維素磁性微米材料的制備方法，其特征是它包括如下步驟第一、取1～3g磁流體，加入到15～25mL纖維素黃膠液中，充分攪拌后采用勻漿機在3000～24000rpm條件下勻漿1～3min；向上述液體中加入3～8倍體積的有機相，有機相的組分體積比為9∶2的氯苯和四氯化碳，內含1～4％體積的司班-80，在3000～24000rpm再充分勻漿1～3min；第二、將上述勻漿液轉入300～500mL上步所述的有機相中，300～500rpm機械攪拌，以50℃水浴加熱，并加熱至80℃，保溫2～4小時；第三、棄去有機相，用無水乙醇淋洗6～8次，再用無水乙醇和水交替淋洗，最后用水充分淋洗，獲得粒徑為3～60μm纖維素磁性微米材料；第四、取第三步制備的纖維素磁性微米材料1mL，室溫下直接加入5mL內含0.015～15mg纖維素結合域-鏈霉親和素融合蛋白CBD-SA的重組pCBD-SA/E.coli BL21菌株的發(fā)酵菌體裂解液中，室溫振蕩反應1～3小時，或4℃過夜，然后用PBS緩沖液充分淋洗；或者，將第三步制備的纖維素磁性微米材料1mL，室溫下直接與5mL內含0.015～15mg纖維素結合域-鏈霉親和素雙功能融合蛋白CBD-SA的溶液混合，室溫下振蕩反應1～3小時，或4℃過夜，將雙功融合蛋白CBD-SA結合在纖維素磁性微米材料的表面，即得到鏈霉親和素生物活化的磁性纖維素微米材料。
2、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是第一步中纖維素黃膠液的勻漿速度的 最佳轉數為19000 rpm，該條件下能夠制得粒徑大小在5~10 的磁性纖維素微米材料， 能獲得最佳的鏈霉親和素偶聯效率。
3、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是第一步中乳化劑司班-80的最佳加入 量為2%。
4、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是第四步中所述的纖維素結合域-鏈霉親 和素雙功能融合蛋白CBD-SA中的鏈霉親和素基因的堿基序列如序列表1所示。
5、 根據權利要求l所述的制備方法，其特征是第四步中所述的纖維素結合域-鏈霉親 和素雙功能融合蛋白CBD-SA，是通過基因工程方法獲得的具有生物素結合活性和纖維素 結合活性的雙功能融合蛋白CBD-SA，具體步驟如下采用微波法提取淡紫灰鏈霉菌ZG0429基因組DNA，然后采用根據GeneBank收錄的阿 維丁鏈霉菌的SA基因序列，序列號為X03591，設計含有^VcoI和五coRI酶切位點的上游和下游引物對鏈霉親和素SA基因的PCR擴增，隨后分別采用限制性內切酶A^oI和五co及I雙酶切 SA的基因PCR擴增產物，及帶有CBD標簽的pET35b(+)載體，再采用DNA回收試劑盒回收 目的片段，14連接酶連接后轉入￡.0>//81^1菌株的感受態(tài)細胞，重組質粒經PCR和雙酶切 鑒定，獲得含有CBD-SA融合基因的重組質粒pCBD-SA的五.co/z'BL21原核表達系統(tǒng)。最后， 將得到的重組菌株在IPTG誘導下發(fā)酵，收集的菌體，采用PBS緩沖液重懸，超聲波破碎處 理，獲得的裂解產物進行10。/。的SDS-PAGE分析和Western blot，驗證融合蛋白CBD的分子 量及SA的活性；并將上述表達產物加入到纖維素磁性微米材料中，4'C吸附2小時，以PBS 充分洗滌，隨后加入生物素化的HRP,于室溫反應15 min， PBS充分洗滌后加入OPD反應 底物，觀察液體顏色變化，從而確認CBD的結合活性，并再次確認SA的生物活性。
6、 根據權利要求1所述的制備方法，其特征是第四步中所述的纖維素結合域-鏈霉親 和素雙功能融合蛋白CBD-SA表達菌株pCBD-SA/ co// BL21 ，能夠在IPTG誘導下表達 雙功能融合蛋白CBD-SA。
7、 一種權利要求1所述方法制備的鏈霉親和素生物活化的纖維素磁性微米材料的應 用，用于細胞或組織中mRNA的磁性分離和提取。
全文摘要
一種分離mRNA的纖維素磁性微米材料的制備及應用。本發(fā)明采用基因工程技術將淺紫灰鏈霉菌的鏈霉親和素基因定向克隆至含有纖維素結合域標簽的pET系列載體，構建了同時具有生物素結合活性和纖維素結合活性的雙功能融合蛋白CBD-SA的載體，并轉入E.coli BL21感受態(tài)菌株，經IPTG低溫誘導表達，獲得高含量的CBD-SA融合表達蛋白。利用CBD-SA作為生物橋聯劑，以生物特異性偶聯法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的物理吸附法和化學鍵合法，使纖維素磁性微米材料活化，活化后能夠高效率的結合生物素化的試劑，得到可用于蛋白或核酸分離的磁性微米材料。本發(fā)明提供的纖維素磁性微米材料可用于生物樣品中mRNA的分離提取等。
文檔編號H01F1/00GK101640085SQ20091006954
公開日2010年2月3日 申請日期2009年7月3日 優(yōu)先權日2009年7月3日
發(fā)明者奇 張, 宇 曹, 宇 湯, 龍 王, 芳 白, 鋼 白, 高智慧 申請人:南開大學