專利名稱：：弗氏檸檬酸桿菌在微生物發(fā)電中的應(yīng)用及發(fā)電方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于環(huán)境與新能源
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說，涉及弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)在微生物發(fā)電方面的應(yīng)用及其發(fā)電方法。
背景技術(shù)：
：近年來，面對(duì)能源短缺和環(huán)境污染的雙重危機(jī)，微生物燃料電池(MicrobialFuelCell,MFC)以其獨(dú)特的性質(zhì)，顯示出極大的研究和應(yīng)用價(jià)值。微生物燃料電池是一種利用微生物作為催化劑，將燃料中的化學(xué)能直接轉(zhuǎn)化為電能的裝置。早在1911年，英國(guó)植物學(xué)家Potter就發(fā)現(xiàn)微生物可以產(chǎn)生電流。但隨后，有關(guān)微生物燃料電池的研究一直進(jìn)展緩慢，直到20世紀(jì)80年代，氧化還原介體的廣泛應(yīng)用使得MFC的輸出功率有了較大提高，由此推動(dòng)了MFC的發(fā)展。但是，氧化還原介體價(jià)格昂貴、部分有毒，制約了其進(jìn)一步發(fā)展。隨后，研究人員相繼發(fā)現(xiàn)某些微生物能在無介體的條件下直接將體內(nèi)產(chǎn)生的電子傳遞到電極。至此，MFC的研究獲得了突破性進(jìn)展。目前，MFC研究的主要內(nèi)容是無介體MFC產(chǎn)電性能的改善，及其在污水處理、產(chǎn)氫、生物傳感、生物修復(fù)等方面的應(yīng)用。產(chǎn)電菌是MFC產(chǎn)電的核心要素，是MFC研究的重要內(nèi)容。目前，分離的產(chǎn)電微生物主要是變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)的細(xì)菌，多為兼性厭氧菌，具有無氧呼吸和發(fā)酵等代謝方式，可氧化糖類、有機(jī)酸等獲得能量維持生長(zhǎng)。已報(bào)道的產(chǎn)電微生物有沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和人蒼白桿菌(Ochrobactrumanthropi);鐵還原紅育菌(Rhodofoferaxferrireducens);嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)禾口希萬氏菌(Shewanellaputrefactions)、S.oneidensis;硫還原地桿菌(Geobactersulfurreducens)、金屬還原地桿菌(G.metallireducens)、丙酸硫口十菌(Desulfoblbuspropionicus)，丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)禾口拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)等。弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)目前主要應(yīng)用于臨床致病菌及酶工程的相關(guān)研究，有關(guān)弗氏檸檬酸桿菌具有產(chǎn)電活性在國(guó)內(nèi)外尚未發(fā)現(xiàn)有報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)在微生物發(fā)電方面的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)作為微生物燃料電池的陽極催化劑應(yīng)用于微生物發(fā)電。所述弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)為L(zhǎng)Y_3，保藏編號(hào)為CGMCCNo.3246。弗氏檸檬酸桿菌菌落表面光滑、半透明、邊緣整齊、表面有光澤，能以陽極為電子受體，利用葡萄糖、乙酸鈉等有機(jī)物產(chǎn)電。本發(fā)明菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示。通過形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)定及16SrDNA基因序列分析，本發(fā)明菌株為弗氏檸檬酸桿菌的新菌株，命名為L(zhǎng)Y-3。本發(fā)明還提供了弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)應(yīng)用于微生物發(fā)電的發(fā)電方法，包括以下步驟(1)制備弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)作為微生物燃料電池接種物；(2)制備陰極液和含燃料的陽極液；(3)往微生物燃料電池陽極室中加入微生物燃料電池接種物，連接外電路，進(jìn)行產(chǎn)電檢測(cè)。所述步驟(1)中微生物燃料電池接種物的制備方法為將弗氏檸檬酸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，3(TC，100rpm培養(yǎng)24h，4000rpm離心4min收集菌體，得到微生物燃料電池接種物。所述步驟(2)中的燃料為葡萄糖或乙酸鈉。所述步驟(2)中的陽極液為2g/L的葡萄糖和100mM/L的PBS的混合溶液。所述步驟(2)中的陰極液為0.05MFeCN。所述步驟(3)中微生物燃料電池接種物的量為0.2g/mL陽極液。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明為弗氏檸檬酸桿菌開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域，為微生物燃料電池提供了一種新的適應(yīng)性強(qiáng)的產(chǎn)電微生物。弗氏檸檬酸桿菌LY-3易于培養(yǎng)，能利用多種有機(jī)物產(chǎn)電，產(chǎn)電電壓大。本發(fā)明菌株弗氏擰檬酸桿菌CitrobacterfreundiiLY-3已于2009年8月21日保藏于國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCCNo.3246。圖1為本發(fā)明菌株CitrobacterfreundiiLY-3的16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹；圖2為本發(fā)明菌株CitrobacterfreundiiLY_3菌液的CV掃描圖；圖3為本發(fā)明菌株CitrobacterfreundiiLY-3利用葡萄糖和乙酸鈉為燃料產(chǎn)生的電壓隨時(shí)間的變化曲線圖。具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不能限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1:本發(fā)明菌株CitrobacterfreundiiLY-3的篩選1.菌株分離在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)內(nèi)(廣州)干涸的湖底表面下深lOcm處采集泥樣，快速轉(zhuǎn)移到已達(dá)到厭氧條件的厭氧操作箱中，取樣品少量加入試管中，lOml無菌水稀釋，振蕩混勻。取樣品稀釋液1ml注射到10mlIRM液體培養(yǎng)基中，3(TC富集培養(yǎng)三代。然后，在LB固體培養(yǎng)基上平板劃線，3(TC厭氧培養(yǎng)3d，觀察菌落特征，分別挑取菌落形態(tài)不同的菌劃線分離，培養(yǎng)3代得到純菌株后保存，待電化學(xué)考察。4其中，IRM培養(yǎng)基的組分為NaHC032.5g/L，KC10.lg/L，NH4C11.5g/L，NaH2P040.6g/L，NaAc20mM，擰檬酸鐵20mM，酵母提取物0.5g/L。LB培養(yǎng)基的組分為蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L，固體培養(yǎng)基上添加2%的瓊脂。2.產(chǎn)電菌的篩選對(duì)分離得到的純菌株的菌液進(jìn)行循環(huán)伏安(CV)掃描來確定所測(cè)菌株是否具有電化學(xué)活性。采用電化學(xué)工作站的三電極(石墨工作電極，鉬對(duì)電極，飽和甘汞電極)法對(duì)10ml菌液進(jìn)行CV掃描，以100mV/s的速率在_0.80.8V之間掃描，10ml培養(yǎng)基做對(duì)照(CK)，篩選得到一株具有電化學(xué)活性的菌株，即為L(zhǎng)Y-3，掃描結(jié)果如圖1所示，LY-3菌株的CV掃描出現(xiàn)了還原峰，且氧化還原不可逆，說明菌株LY-3具有電活性。實(shí)施例2:本發(fā)明菌株CitrobacterfreundiiLY-3的鑒定通過形態(tài)特征觀察、生理生化測(cè)定及16SrDNA基因序列分析對(duì)實(shí)施例1得到的LY-3菌株進(jìn)行鑒定。1.形態(tài)特征觀察LY-3菌株菌落表面光滑、半透明、邊緣整齊、表面有光澤。2.生理生化測(cè)定菌株LY-3與《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中檸檬酸桿菌屬菌種的生理生化性質(zhì)對(duì)照如表1所示。表1菌株LY-3與弗氏檸檬酸桿菌的生理生化性質(zhì)對(duì)照性狀革蘭氏染色芽孢兼性厭氧接觸酶氧化酶檸檬酸鹽利用苯丙氨酸脫氨酶VP試驗(yàn)曱基紅H》的產(chǎn)生脲酶明膠水解硝'酸鹽還原水解ONPG從D葡萄糖產(chǎn)氣菌抹LY-++++++++弗氏檸檬酸桿菌ND+++++d+++<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注:+:陽性:陰性;ND:未測(cè);d:不同3.16SrDNA系統(tǒng)進(jìn)化分析用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取LY-3的全基因，然后以提取的基因?yàn)槟０?，以通用引?3f:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；1387r:5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為DNA模板1iiL，10XPCR緩沖液2iiL，上、下游引物各1PL，TaqDNA聚合酶1iiL，10XdNTP2iiL，補(bǔ)水至20iiL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4。C預(yù)變性5min;94。C40s、42。Clmin、72。Clmin，30個(gè)循環(huán)，最后于72。C延伸10min，4。C保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，純化和回收PCR產(chǎn)物，送生物公司進(jìn)行序列測(cè)定，LY-3的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示。將獲得的序列提交NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行Megablast，獲取同源性高的相關(guān)序列，用ClustalX軟件進(jìn)行比對(duì)，Mega軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2是根據(jù)16SrDNA序列所作的系統(tǒng)發(fā)育樹。擴(kuò)增得到1.6kbp的基因序列，在GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源序列搜索，LY-3與Citrobacterfreundii(AB210978)的同源性為99%，LY_3為弗氏擰檬酸桿菌的新菌株，命名為CitrobacterfreundiiLY-3，GenBank接受號(hào)為GQ465944。實(shí)施例3:本發(fā)明菌株CitrobacterfreundiiLY-3以葡萄糖為燃料的產(chǎn)電考察本實(shí)施例按照現(xiàn)有技術(shù)和方法來構(gòu)建利用LY-3發(fā)電的微生物燃料電池，微生物燃料電池采用兩室，包括陽極室和陰極室、交換膜及外電路。電極材料為碳?xì)?，連接外阻1000Q。MFC的產(chǎn)電原理為有機(jī)物作為燃料在厭氧陽極室中被弗氏檸檬酸桿菌氧化，產(chǎn)生電子與質(zhì)子，其中，電子被弗氏檸檬酸桿菌捕獲并傳遞給電池陽極，電子通過外電路到達(dá)陰極，從而形成回路產(chǎn)生電流，而質(zhì)子通過交換膜到達(dá)陰極，與氧反應(yīng)生成水。本實(shí)施例的產(chǎn)電考察步驟為(1)將LY-3接種于LB液體培養(yǎng)基中，30°C，lOOrpm培養(yǎng)24h，4000rpm離心4min收集菌體，作為微生物燃料電池接種物；(2)陽極室加入陽極反應(yīng)液為2g/L的葡萄糖和100mM/L的PBS的混合溶液，陰極室加入陰極反應(yīng)液為0.05MFeCN;其中PBS的配方為:KC10.26g/L，NH4C10.62g/L，NaH2P044.9g/L，Na2HP049.15g/L。(3)往陽極室中接種LY-3菌株(接種量為0.2g/mL陽極液)，3(TC靜置培養(yǎng)。(4)將陽極、陰極通過1000Q外阻連接，數(shù)據(jù)采集卡每ls記錄一次電壓，輸出電壓結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，LY-3可應(yīng)用到微生物燃料電池中產(chǎn)電，以葡萄糖為燃料的微生物燃料電池最大電壓達(dá)到0.52V。實(shí)施例4:本發(fā)明菌株CitrobacterfreundiiLY-3以乙酸鈉為燃料的產(chǎn)電考察實(shí)驗(yàn)方法和實(shí)驗(yàn)步驟同實(shí)施例3，僅將步驟(2)中陽極反應(yīng)液改為2g/L的乙酸鈉和100mM/L的PBS的混合溶液。輸出電壓結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，LY-3可應(yīng)用到微生物燃料電池中產(chǎn)電，以乙酸鈉為燃料的微生物燃料電池最大電壓為0.39V。上述詳細(xì)說明是針對(duì)本發(fā)明的可行實(shí)施例的具體說明，該實(shí)施例并非用以限制本發(fā)明的專利范圍，凡未脫離本發(fā)明的等效實(shí)施或變更，均應(yīng)包含于本發(fā)明的專利范圍中。序列表〈110〉中國(guó)科學(xué)院廣州能源研究所〈120〉弗氏檸檬酸桿菌在微生物發(fā)電中的應(yīng)用及發(fā)電方法〈160>1〈170>PatentInversion3.1〈210>1〈211>1419bp〈212>rDNA〈213>Citrobacterfreundii〈400>1catgcagtcg朋cggtegcaC3gagagcttgctctcgggtgacgagtggc50ggacgggtgagtaatgtctgggaaactgccCg3tgg3ggg100tgga朋cggtagcteateccgcat朋tgtcgC33g3CC朋卿gggggac150cttcgggcctcttgccatcggatgtgcccag￡ltggg￡ltt￡lgcttgtaggt200ggggtaacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctg卿gg3tg3250CC3gCC3C3Ctgg朋Ctg3g3C3CggtCC3gactcctacggg￡lggC￡l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